A nyálban lévő szabad glikációs vegyületek mennyisége

Szerepek Konceptualizálás, formális elemzés, vizsgálat, módszertan, írás - eredeti tervezet

szabad

Élelmiszerkémiai tagsági elnök, Drezda, Technische Universität, Drezda, Németország

Szerepek Konceptualizálás, Projekt adminisztráció, Felügyelet, Írás - áttekintés és szerkesztés

Élelmiszerkémiai tagsági elnök, Drezda, Technische Universität, Drezda, Németország

Szerepek Formális elemzés, vizsgálat

Élelmiszerkémiai tagsági elnök, Drezda, Technische Universität, Drezda, Németország

Szerepek konceptualizálás, finanszírozás megszerzése, projekt adminisztráció, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Élelmiszerkémiai tagsági elnök, Drezda, Technische Universität, Drezda, Németország

  • Friederike Manig,
  • Michael Hellwig,
  • Franziska Pietz,
  • Thomas Henle

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Manig F, Hellwig M, Pietz F, Henle T (2019) A szabad glikációs vegyületek mennyisége a nyálban. PLoS ONE 14 (9): e0220208. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220208

Szerkesztő: Ghulam Md Ashraf, Abdulaziz Király Egyetem, SAUDI ARABIA

Fogadott: 2019. április 3 .; Elfogadott: 2019. július 10 .; Közzétett: 2019. szeptember 18

Adatok elérhetősége: Az összes vonatkozó nyers adatot még az Open Access Repository és az OpARA archívum segítségével is feltöltötték ide: https://opara.zih.tu-dresden.de/xmlui/handle/123456789/1416.

Finanszírozás: Az adatok az Európai SALIVAGES projekt részeként jöttek létre. A Joint Programm Initiative (JPI) támogatja az SALIVAGES konzorciumot az „Egészséges étrend az egészséges életért” (HDHL) program keretében. A szerzők elismerik a német szövetségi kutatási és oktatási minisztériumot (BMBF) az FM projekt támogatásáért (01EA1703 támogatásszám). A finanszírozónak nem volt szerepe a tanulmány tervezésében, az adatgyűjtésben és -elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Rövidítések: 3-DG, 3-dezoxi-glükozon; AGE (k), előrehaladott glikációs végtermék (ek); AP (k), Amadori termék (ek); Arg, arginin; CEL, N-karboxi-etil-lizin; CML, N-karboxi-metil-lizin; FruLys, N-e-fruktozililizin; HPLC, nagynyomású folyadékkromatográfia; LC-MS, folyadékkromatográfia, tömegspektrometriával párosítva; Lys, lizin; MG-H1, metil-glioxálból származó hidroimidazolon 1; MGO, metil-glioxál; MRP (k), Maillard reakciótermék (ek); NFPA, nonafluor-pentánsav; Pyr, Pyrraline

Bevezetés

Az MRP-k napi bevitelét a 3,1 ± 1,0 mg CML-t tartalmazó különböző élelmiszerek átfogó elemzése után számolták ki (

0,015 mmol), 2,3 ± 0,8 mg CEL (

0,01 mmol) és 21,7 ± 6,7 mg MG-H1 (

0,1 mmol) [18]. A Pyret, mint a legfontosabb étrendi MRP-t, 20-40 mg bevitel mellett becsülték (

0,08–0,16 mmol) [19]. Lenyelés után a glikált fehérjék proteolitikus hasításon mennek keresztül [20–22]. A kapott peptidek és aminosavak transzlokációja az MRP kémiai jellegétől függ. A Caco-2 sejteken végzett in vitro fluxus vizsgálatok a bazolaterális membránon keresztül történő transzfert sugallták az unpoláris oldallánccal rendelkező MRP-k, például a Pyr esetében, de a töltött oldallánccal rendelkező molekulák, például a CML esetében nem [23,24]. Emberi önkéntesekkel végzett vizsgálatok során a FruLys alacsony vizelet- és ürüléktermeléssel, de a Pyr vizeletben való magas visszanyerésével járt, ami a Pyr, de a FruLys abszorpcióját jelzi [25–27]. A szabad MRP-k széles skáláját, például CML, CEL, MG-H1 stb. Mennyiségileg meghatároztuk az emberi plazmában nanomól tartományban [11].

Elvileg az aminosavak számszerűsíthetők a verejtékben és a nyálban [35,46,47]. Ez felveti a kérdést, hogy kimutathatóak-e az MRP-k az emberi nyálban, vagy sem. Ennek a tanulmánynak a célja egy LC-MS/MS multimódszer felállítása volt, és a nyál „AGEome” felmérése az AGE CML, CEL, MG-H1, Pyr, valamint az AP FruLys tekintetében homogén alanycsoporttal.

Anyag és módszerek

Vegyszerek

LC-MS minőségű acetonitrilt és HPLC minőségű metanolt a VWR Prolabo-tól (Darmstadt, Németország) vásároltunk. Dupla desztillált vizet (Bi 18E kettős desztillációs rendszer, QCS, Maintal, Németország) használtunk oldószerekhez az LC-MS analízishez, és a nonfluor-pentánsavat (NFPA) a Sigma-Aldrich (Steinheim, Németország). A kalibráláshoz használt referenciaanyagot az előzőekben leírtak szerint szintetizáltuk: N-fruktozililizin [48], pirralin [24,49], CML [23], CEL [23] és MG-H1 [23]. Stabil izotóppal jelzett belső standardokat a HPLC-MS/MS analízishez ugyanúgy szintetizáltunk, de [13 C6, 15 N2] lizint ([13 C6, 15 N2] Pyr) és [13 C6] arginint ([13 C6] MG) használva. -H1) a címkézetlen vegyületek helyett. [13 C3] A CEL szintetizálása az alábbiakban leírtak szerint történt. A [2 H2] CML-t a PolyPeptide (Strasbourg, Franciaország), a [13 C6, 15 N2] lizin és [13 C3] nátrium-piruvát a Campro-tól (Berlin, Németország) és [13 C6] arginint a Eurisotop-tól (Saarbrücken, Németország) szereztük be. . A tisztítást félpreparatív ioncserélő kromatográfiával végeztük, és a termékek tisztaságát és azonosságát magmágneses rezonancia spektroszkópiával, tömegspektrometriával és aminosav-analízissel értékeltük.

A [13C3] N-karboxi-etil-lizin szintézise

Analitikai adatok: HPLC-MS/MS: tR, 8,4 perc; az [M + H] + (m/z 222), 130 (100), 84 (91), 222 (24), 175 (5), 159 (4) fragmentuma (100 V, 10 eV). Tartalom = 76,2%, a címkézetlen standardkal végzett kalibrálás alapján. Hozam: 43,5 mg (59,7%).

Dizájnt tanulni

A tanulmányt a Technische Universität Dresden, Németország etikai bizottsága hagyta jóvá (hivatkozási szám: AZ 439112017). A vizsgálat minden résztvevője írásos beleegyezést kapott. Összességében a vizsgálatban 55 résztvevő vett részt, amelyek közül 22 alanyot kellett kizárni, főleg az alacsony nyálmennyiség miatt. A nyálas MRP-k éhomi szintjét kétszer analizáltuk 33 metabolikusan egészséges alany mintáiban. Reggel előtt naponta mintát vettek a nyálból. A nyál MRP szintjére gyakorolt ​​feltételezett étrendi hatás vizsgálatához hat alanyra kérték fel, hogy két napig fogyasszanak melegítetlen, gyakorlatilag MRP-mentes ételeket [51] (főleg zöldségeket, gyümölcsöket, pörkölt diót). A mintavételt az első napon a hajnali harmadik napig végeztük. Ugyanez az alanycsoport további három nap alatt mintákat vett, miközben megszokott étrendjüket fogyasztották, beleértve az MRP-ben gazdag ételeket.

Mintavétel

Az éhomi nyálgyűjtést reggel 8-kor végeztük a Salivettes-szel (Sarstedt, Németország). A gyártó mintavételi protokollját úgy alakítottuk ki, hogy a nyálakat stimuláció nélkül gyűjtsük a nyálhoz. Az alanyokat arra kérték, hogy fogkrém nélkül mossanak fogat, öblítsék ki a szájat vízzel, és várják öt percig. A szalivettákat a nyelv közepére helyezték. Az alanyokat arra kérték, hogy a nyálgyűjtéstől számított három percen belül ne mozdítsák el a nyelvet.

Nyálminták előkészítése az MRP elemzéshez

A nyálat centrifugálással izoláltuk a nyálmintákból (2 perc, 2500 g). 500 μl nyálat összekevertünk 10 μl belső standard oldattal, valamint 490 μl jéghideg acetonitril/metanol (70/30, v/v) elegyével. 10 perc elteltével 4 ° C-on a csöveket centrifugáltuk (10000 g, 10 perc), a felülúszót nitrogénatmoszférában szárazra pároltuk, és a maradékot újra feloldottuk 90 μl 20 mM NFPA-ban. A mintákat általában két példányban elemezték. Dupla desztillált vizet alkalmaztunk az üres anyagok alapjául. A minták feldolgozása során a vakokat mintákként kezeltük. A CML, a CEL, az MG-H1, a Pyr, a FruLys, valamint az Arg és a Lys külső kalibrálására szolgáló oldatokat a megfelelő izotopológ belső standard mindegyikével nitrogénatmoszférában szárazra pároljuk és 20 mM NFPA-ban oldjuk. Az MRP kalibrációs görbéje 0,003–0,15 ng/ml és az aminosavak esetében 0,1–150 μg/ml közötti volt lineáris.

Nagynyomású folyadékkromatográfia tandem tömegspektrometriás detektálással (HPLC-MS/MS)

A szabad MRP-ket kvantitatívan meghatároztuk egy bináris szivattyúból (G1312A), egy online gáztalanítóból (G1379B), egy automatikus mintavevőből (G1329A), egy oszlopos termosztátból (G1316A), egy dióda tömb detektorból (G1315D) álló bináris szivattyúból (G1312A), HPLC-MS/MS rendszerből. egy hármas kvadrupól tömegspektrométer (G6410A; mind az Agilent Technologies cégtől, Böblingen, Németország). A nitrogént porlasztó gázként alkalmazták az ESI-forrásnál, 11 l/perc gázárammal, 350 ° C-os gázhőmérséklettel és 35 psi-es porlasztó nyomással, és a kapilláris feszültség 4000 V-on volt. A kromatográfiás elválasztáshoz Kinetex C-18 oszlopot (50 x 2,1 mm, 1,7 μm, 100 Å) és 5 μl injektálási térfogatot használtunk. Az A oldószer 10 mM NFPA-t tartalmazott vízben, a B oldószer 10 mM NFPA-t tartalmaz acetonitrilben. Grádienst (0 perc, 5% B; 10 perc, 32% B; 11 perc, 85% B; 14 perc, 85% B; 15 perc, 5% B) 0,25 ml/perc áramlási sebességgel használtunk. Adatszerzéshez a Mass Hunter B.02.00 (Agilent) szoftvert használtuk. A mennyiségi meghatározást az 1. táblázatban bemutatott ionátmenetekkel végzett MRM mód alkalmazásával végeztük. Az összes mintát két példányban elemeztük.

Statisztikák és módszer validálás

Minden egyes analitot (szürke) a megfelelő izotopológ belső standardnak (fekete) megfelelően analizáltunk specifikus MRM átmenetekkel.

A kimutatási határ (LOD) és a kvantitációs határ (LOQ) kiszámítása a kalibrációs görbe módszerén alapult, az egyes analitok kalibrációs görbéinek felhasználásával. A kalibrációval lefedett koncentrációtartomány lineáris jelválaszt adott, meghatározási együtthatóval 0,980 (MG-H1) és 0,999 (egyéb analitok) között. Az érvényesítési adatokat a 2. táblázat tartalmazza. A megfelelő LOD és LOQ összhangban van a korábban közzétett adatokkal [11]. A Salivette-sel végzett elemzéshez kiszámítottuk a visszanyerési arányokat 72,7 és 110,3% között. Vizsgálatunk során megállapítottuk, hogy a nyálkás gyapot a FruLys esetében az analit 27% -át megtartja, vagy akár a nyálban az MRP-k magasabb analitikai (CEL) hozamához vezetett, ami valószínűleg a dúsulás miatt következett be. Megállapítottuk, hogy az LC-MS mérések megismételhetősége 0,8% (Pyr) és 14,7% (MG-H1) között változik, a minta előkészítésének megismételhetőségét 1,4% és 16,3% között számítottuk.

A nyál MRP-szintjének egyéni változása

A négyzet az átlagot, a vonal a mediánt jelöli. CEL-t 26/99 mintában detektáltak; a bemutatott adatok olyan mintákra vonatkoznak, amelyek CEL csúcsaránya S/N> 3.

Az MRP-k előfordulása közötti összefüggések további értékeléséhez korrelációs elemzést végeztünk az egyes nyálban lévő analitok között a Spearman modelljei szerint (S3 táblázat). Az MRP-k esetében mérsékelt korrelációt figyeltek meg a Pyr és CML esetében a FruLys, valamint a Lys és a FruLys esetében. Érdekes módon ez a helyzet Lys és Arg esetében is, amelyek mérsékelt összefüggést mutatnak a legtöbb vizsgált MRP-vel. Ez a megfigyelés az Arg és Lys hasonló transzportmechanizmusainak tulajdonítható a vértől a nyálig, ami az Arg és Lys-ből származó MRP-kre is vonatkozhat. A CEL az egyetlen olyan analit, amely nem mutat összefüggést más, ebben a vizsgálatban elemzett vegyületekkel.

Az MRP-szintek ellenjavallt változása a nyálban

Az egyes alanyok nyál MRP-szintjeinek különböző napjai közötti különbségek értékeléséhez az alanyokat arra kérték, hogy adjanak mintákat három egymást követő napból. A mintákat a fentiek szerint mértük, és az intraindividuális variációt variációs együtthatóként számoltuk. Az elemzés feltárta a FruLys, az MG-H1, a lizin és az arginin magas intraindividuális variációit, 5 és 80–90% között (lásd a 3. táblázatot és az S1 ábrát). Figyelemre méltó, hogy a FruLys magas és Pyr alacsony inter- és intraindividuális variációkat mutatott. Az egyes személyek közötti variációk átfedik az egyéni ellenjavallatokat. A különböző alanyokból származó vizsgált MRP-k profilját az S1 adja meg. Az intraindividuális eltérések magyarázhatók az étkezési MRP bevitelével, a dohányzási viselkedéssel, az egyéni metabolikus vagy akár patofiziológiai jellemzőkkel. Számos anyag esetében leírták, hogy a nyál tükrözi a vérkoncentrációt [31,32,44,56]. Ezt a feltevést két érv is alátámasztja: A biológiai folyadékokban az MRP-k erős korfüggő növekedését ebben a tanulmányban sem nem látták, sem az irodalomban nem jelentették kifejezettnek [57].

Előzetes tanulmány az étrendi hatásról

A vizsgált elemzések nyálszintje magas inter- és intraindividuális variációkat mutatott, amelyek nem magyarázhatók a kérdőívben feltett személyes paraméterek egyikével sem. A résztvevők által elfogyasztott étkezések értékelése a kérdőívben leírtak szerint diétás hatást gyakorolt ​​a nyál MRP szintjére. Annak elemzésére, hogy az egyes MRP-k koncentrációja a nyálban függ-e az étrend bevitelétől, egy életkorban és dohányzási magatartásban (könnyű vagy nem dohányzó) homogén önkéntesek csoportját kérték fel két napig nyers vagy fűtetlen étel fogyasztására. A fehérjével való ellátást pörkölés nélküli, fűtetlen dió fogyasztásával biztosították (kesudió kizárták, mert a kesudió hámozás és feldolgozás közben felmelegedhet), és kb. 3. ábra: A nyál Maillard reakcióvegyületeinek táplálékra gyakorolt ​​hatásának vizsgálata.