A Kappa B nukleáris faktor bevonása magas zsírtartalmú étrendhez kapcsolódó hasnyálmirigy-fibrózisban patkányokban

Ming-Xian Yan

* Gasztroenterológiai Osztály, Shandong Qianfoshan Kórház, Shandong Egyetem Orvostudományi Kar, Shandong, Kína.

Hong-Bo Ren

† Gasztroenterológiai Osztály, Qilu Kórház, Shandong Egyetem, Shandong, Kína.

Yi Kou

‡ Gasztroenterológiai Osztály, Peking Liangxiang Kórház, Peking, Kína.

Min Meng

§ Gasztroenterológiai Osztály, Anyang Kórház, Henan, Kína.

Yan-Qing Li

† Gasztroenterológiai Osztály, Qilu Kórház, Shandong Egyetem, Shandong, Kína.

Absztrakt

Háttér/Célok

A magas zsírtartalmú étrend hozzájárul a hasnyálmirigy fibrogeneziséhez, de a patogenezis továbbra sem tisztázott. Ez a tanulmány a magfaktor kappa B (NF-κB) szerepét vizsgálta a magas zsírtartalmú étrend okozta hasnyálmirigy-fibrózisban patkányokban.

Mód

A hím Wistar patkányokat 20 héten át magas zsírtartalmú étrenddel vagy szokásos normál chow-val etették. A hasnyálmirigy fibrózisát Sirius vörös festéssel határoztuk meg. Immunhisztokémiai festést, reverz transzkripció-polimeráz láncreakciót és Western-blot-vizsgálatot alkalmaztunk az NF-κB-hez kapcsolódó gének vagy fehérje-expressziók azonosítására.

Eredmények

Gyulladást, zsírlerakódást, hasnyálmirigy-csillagsejtek aktiválódását és fibrózist figyeltek meg a zsírtartalmú étrend hasnyálmirigyében. Az NF-KB p65 alegység (NF-KB/p65) expressziója a magban lokalizálódott, és az 1. sejtközi adhéziós molekula (ICAM-1) túl expresszálódott. A hasnyálmirigy gén expressziójának szintje, az NF-KB/p65, az ICAM-1 és a tumor nekrózis faktor α szignifikánsan megemelkedett a magas zsírtartalmú étrenddel etetett patkányokban, összehasonlítva a kontroll patkányokkal. A Western blot szintén szignifikánsan megnövekedett ICAM-1 és nukleáris NF-κB/p65 szintet mutatott ki a magas zsírtartalmú táplálékkal etetett patkányokban, összehasonlítva a kontroll patkányokkal.

Következtetések

Az NF-κB részt vesz a magas zsírtartalmú étrenddel kapcsolatos hasnyálmirigy-fibrózisban.

BEVEZETÉS

A hosszan tartó, magas zsírtartalmú étrend bevitele károsnak tűnik a hasnyálmirigyre. Korábbi tanulmányok szerint a magas zsírtartalmú étrendek hasnyálmirigy endokrin és exokrin rendellenességeket, 1 - 3 megnövekedett gyulladásos citokint indukálhatnak a hasnyálmirigy szöveteiben, 4, 5, valamint a hasnyálmirigy stellátum sejtjeinek (PSC) aktivációját és fibrogenezisét. 6, 7

A magas zsírtartalmú étrend oxidatív stresszt gerjeszt a hasnyálmirigyben, 6, 7, amelyről kimutatták, hogy szerepet játszik a PSC-k aktiválásában és a hasnyálmirigy fibrózisában. 8, 9 Bár magas vérlemezkéből származó béta típusú növekedési faktor és transzformáló béta 1 növekedési faktor (TGF-β1) emelkedett szintjét találták a hasnyálmirigyben egy állatmodellben a magas zsírtartalmú diétás táplálás után, 7 azonban a szabályozó mechanizmusok és a jelátvitel Az ebben az oxidkárosodási folyamatban résztvevő utakat nem sikerült tisztázni, és ismereteink korlátozottak.

A kappa B nukleáris faktor (NF-KB) egy oxidatív stressz-érzékeny transzkripciós faktor, amely sokféle gént modulál, beleértve a gyulladásgátló citokineket és az adhéziós molekulákat, például a tumor nekrózis-faktort α (TNF-α) és az intercelluláris adhéziós molekulát 1 ( ICAM-1). A 10-12 nyugvó PSC-ket citokinek, növekedési faktorok és 9, 13 reaktív oxigénfajok (ROS) stimulálhatják, hogy ezután megnövekedett mennyiségű extracelluláris mátrixot szintetizáljanak és szekretáljanak. Az aktivált PSC-k elősegítik az autokrin faktorokat, beleértve az ICAM-1-et, a TNF-α-t és a TGF-β-t. 9, 14, 15

A fenti megfontolásokra tekintettel feltételezzük, hogy az NF-κB szerepet játszhat a hasnyálmirigy káros hatásaiban, amelyek krónikus, magas zsírtartalmú étrend miatt következnek be. Ebben a tanulmányban patkányokat egyenként 20 hétig magas zsírtartalmú étrendgel etettünk, szövettani elváltozásokat figyeltünk meg, megvizsgáltunk néhány molekula expressziót, amelyek kapcsolódtak a hasnyálmirigy NF-κB jelátviteli útjaihoz, és megvitattuk eredményeink mögöttes következményeit.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

1. Állatmodellek

Ezt a tanulmányt jóváhagyta a Shandong Egyetem Etikai Bizottsága. Huszonnégy hím Wistar patkányt (167–188 g tömegű, a Shandong Egyetem Laboratóriumi Állatközpontjától nyertünk) használtunk a kísérletben. Fenntartásuk a Shandong Egyetem laboratóriumi állatgondozási és -használati szabályainak megfelelően történt. A patkányok rendszeres patkány-chow-t kaptak 1 hétig, hogy alkalmazkodjanak új környezetükhöz, majd két táplálkozási csoportra osztották őket összehasonlítható testtömeg alapján. A kontrollcsoport patkányai (n = 10) rendszeres chow-t kaptak; a kezelt csoportba tartozó patkányokat (n = 12) magas zsírtartalmú étrenddel etették (2% koleszterin, 10% zsír és 88% szabályos chow, mint a kontroll csoportban). Az összes patkányt a kísérlet kezdetétől számított 20 hétig etettük. Az állatokat éjszakán át éhezés után feláldoztuk, és intraperitonealis injekcióval altattuk pentobarbitál-nátriummal (50 mg/testtömeg-kilogramm), ekkor kaptak hasnyálmirigy-szöveteket.

2. Hematoxilin és eozin (H&E) és Sirius vörös festés

A hasnyálmirigy mintáit formalinnal fixáltuk, paraffinba ágyazottuk, 5 µm vastag metszetekre vágtuk, és H & E-vel festettük a szövettani megfigyelésekhez. A gyulladás pontszámát és a zsírlerakódást az alábbiak szerint értékeltük: 0, 0%; 1, 0-25%; 2, 25-50%; 3,> 50%.

A kollagén kimutatásához a metszeteket paraffinmentesítettük, és 25 percig telített vizes pikrinsavba mártottuk, amely 0,5% Sirius vöröset tartalmazott a kollagén rostok festésére, és 3 percig Harris hematoxylinnek tettük ki a sejtek festését. Ilyen körülmények között a kollagén rostok vörösnek, a nem fibrotikus területek kéknek jelennek meg. A fibrotikus területet ImageJ elemző szoftver 1.39n verziójával (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) mértük (http://rsb.info.nih.gov/ij/), és fibrotikus indexként (fibrotikus index) fejeztük ki. = hasnyálmirigy-fibrózis területe/a minta teljes területe × 100%).

A szövettani változások értékeléséhez minden patkányból véletlenszerűen három hasnyálmirigy-szakaszt választottak ki, és minden szakaszban öt nem átfedő mezőt rögzítettek megfigyelés céljából.

3. Immunhisztokémiai festés

A hasnyálmirigy metszeteket primer egér patkányellenes IgG antitestekkel (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia, USA) inkubáltuk 4 ° C-on egy éjszakán át, majd biotinilált kecske anti-egér antitestekkel és HRP-konjugált streptavidinnel (Santa Cruz Biotechnology) inkubáltuk. ) szobahőmérsékleten 15 percig. Öblítőoldatként desztillált vizet adunk 0,4% 20 foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) (v/v). Negatív kontrollokat végeztünk primer antitestek hiányában. Ha az NF-κB/p65-re festettük, az elsődleges antitestet 0,3% triton-dal hígítottuk PBS-ben (v/v), és mind a citoplazma, mind a sejtmaggal festett sejteket pozitívnak tekintettük. Megfigyelés céljából minden patkányból véletlenszerűen három hasnyálmirigy metszetet választottunk ki, és minden szakaszban öt nem átfedő mezőt rögzítettünk további elemzés céljából. Jelentették az NF-KB/p65 vagy az ICAM-1 pozitív festett sejtek (barna) átlagos számát nagy teljesítményű mezőnként. Az α simaizom aktinra (α-SMA) pozitívan festő területeket ImageJ szoftverrel mértük, és a teljes terület százalékában fejeztük ki.

4. Génexpresszió

A génexpressziót reverz transzkripció-polimeráz láncreakcióval (RT-PCR) határoztuk meg. A PCR-t dNTP-t, sense és antisense primereket és TaqDNS polimerázt tartalmazó reakcióelegyekkel hajtottuk végre (Takara, Shiga, Japán). B-aktint használtunk belső standard kontrollként. A PCR primerek és a körülmények a következők: NF-κB/p65: sense primer: 5'-ATGGACGATCTGTTTCCC-3 ', antiszensz alapozó: 5'-GTCTTAGTGGTATCTGTGCT-3', fragmentum mérete: 170 bp, PCR feltétel: 94 ℃, 45 "; 60 ℃, 45 "; 72 ℃, 45 ", 35 ciklus; ICAM-1: sense primer: 5'-AGCCTCAGGCCTAAGAGGAC-3 ', antiszensz alapozó: 5'-AGGGGTCCCAGAGAGGTCTA-3', fragmentum mérete: 496, PCR-állapot: 94 ℃, 45"; 58 ℃, 45 "; 72 ℃, 45", 35 ciklus; TNF-α: sense primer: 5'-TCGTAGCAAACCACCAAG-3 ', antiszensz alapozó: 5'-CTGACGGTGTGGGTGA-3', fragmens mérete: 193 bp, PCR-állapot: 94 ℃, 45 "; 50 ℃, 45"; 72 ℃, 45 ", 35 ciklus; β-aktin: sense primer: 5'-AAGATCCTGACCGAGCGTGG-3 ', antiszensz alapozó: 5'-CAGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3' fragmens mérete: 327 bp, PCR-állapot: 94 ℃, 45"; 58 ℃, 45 "; 72 ℃, 45", 35 ciklus.

A PCR-termékeket gélelektroforézissel választottuk el (1,5% agaróz etidium-bromiddal festve). A specifikus sávokat képi rendszerrel (FluorChem 9900; Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA) vizualizáltuk. A sávok intenzitását ImageJ szoftver segítségével elemeztük és a β-aktin jelre standardizáltuk.

5. Western blottolás

A hasnyálmirigy szöveteit apró darabokra vágtuk, PBS-sel (pH 7,4) mostuk, majd jéghideg lízispufferben (10 mM Hepes, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1,5 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid) homogenizáltuk. (PMSF), 20 mM NaF, 200 uM Na3VO4 és proteáz inhibitor koktél). Miután a mintát 20 percig jégen tartottuk, NP-40-et adtunk hozzá 0,5% -os végkoncentrációig, majd a mintákat további 20 percig jégen inkubáltuk, és 10 000 x g-vel 2 percig 4 ° C-on centrifugáltuk. A felülúszókat citoszolos kivonatokként használtuk az ICAM-1 méréséhez. A pelleteket PBS-sel mostuk és mag-extrakciós pufferben szuszpendáltuk (20 mM Hepes, 420 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1,5 mM PMSF, 20 mM NaF, 200 uM Na3VO4 és proteáz inhibitor koktélt) 20 percig jégen, és 15 000 × g-vel 15 percig 4 ° C-on centrifugáljuk. A magfehérjét tartalmazó felülúszókat összegyűjtöttük az NF-κB/p65 kimutatására.

Ugyanolyan mennyiségű fehérjét (20 ug) töltöttünk különböző sávokba, és 12% -os nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottuk. Az elsődleges antitestek (Santa Cruz Biotechnology) az NF-KB/p65 (1: 150) és az ICAM-1 (1: 200) voltak. Peroxidázzal konjugált másodlagos antitestet (1: 1 250; Santa Cruz Biotechnology) alkalmaztunk, és a membránt fokozott kemilumineszcenciával tettük láthatóvá. A sávok intenzitását ImageJ szoftver segítségével számszerűsítettük, és a vezérlő jelére standardizáltuk.

6. Statisztikai elemzés

Valamennyi érték átlag ± SD értékként jelenik meg. A két kísérleti csoport közötti különbségek jelentőségét a független minták t-tesztjével elemeztük az SPSS szoftver 15.0 verziójával (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). A 0,05-nél kisebb valószínűségi értékeket szignifikánsnak tekintették.

EREDMÉNYEK

1. Testtömeg és hasnyálmirigy oxidatív stressz

A kísérleti időszak alatt minden állat testtömegre tett szert. De a magas zsírtartalmú étrenddel táplált patkányok testtömege a kísérlet végén a kontroll patkányok testtömegének 122,1% -a volt. A malondialdehid szintje nőtt, míg a szuperoxid-diszmutáz aktivitása szignifikánsan csökkent a magas zsírtartalmú étrendet tápláló patkányok hasnyálmirigyében, összehasonlítva a kontroll patkányokéval (az adatokat nem közöltük), amint azt korábbi tanulmányunkban közöltük. 6.

2. H&E és Sirius vörös festés

A magas zsírtartalmú étrenddel etetett patkányok H&E-vel festett szakaszai a parciális és a szigeti sejtekben a zsírlerakódást, valamint a sejtek atrófiáját tárták fel. Ezekben a mintákban limfociták beszivárgását is megfigyelték. Ezenkívül a magas zsírtartalmú étrenddel táplált patkányok hasnyálmirigy-mintái nyilvánvaló Sirius-foltos kollagén-lerakódást mutattak a lebenyeket körülvevő és a hasnyálmirigy-parenchima periacináris területein. Ezzel szemben a kontroll állatokból vett minták esetében nem vagy csak csekély mértékű kollagén lerakódást mutattak be (1. táblázat és 1. ábra).

Asztal 1

Patkányok hasnyálmirigy-szövetének szövettani változásai a 20. héten

Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. A szövettani változásokat az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint értékeltük.

* p 2Aa, b és B ábra). Az ICAM-1 főleg vaszkuláris endoteliális sejtekben és néhány acináris sejtben expresszálódott, és expressziója erősebb volt a magas zsírtartalmú étrendet tápláló patkányokban, mint a kontroll patkányokban (12,27 ± 1,75 vs 21,07 ± 3,65, p 2Ac, d és B ábra) . A magas zsírtartalmú étrendi patkány hasnyálmirigy-mintákban α-SMA-pozitív festési területeket figyeltek meg, amelyek főleg periacináris térben mutatkoztak (0,26 ± 0,07 vs 4,85 ± 0,45, p 2Ae, f és C ábra).

Immunhisztokémiai festés a kappa B p65 nukleáris faktor (NF-KB/p65), az 1. sejtközi adhéziós molekula (ICAM-1) és az a-simaizom aktin (a-SMA) (× 400) esetében, és a megfelelő statisztikai elemzés. (A) Reprezentatív immunhisztokémia az NF-KB/p65 (a, b), az ICAM-1 (c, d) és az a-SMA (e, f) esetében (kontroll, a, c, e; magas zsírtartalmú, b, d, f). Az NF-κB/p65 festéshez a festett citoplazmával és egy festett maggal (barna) rendelkező sejteket pozitívnak tekintettük. (B, C) A megfelelő statisztikai elemzés. Jelentik az NF-κB/p65- vagy ICAM-1-pozitív festett (barna) sejtek átlagos számát nagy teljesítményű mezőnként. Az a-SMA-ra pozitívan festő területeket a teljes terület százalékában fejezzük ki. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. Kontroll, n = 10; Nagy zsírtartalmú, n = 12.

Gén expresszió hasnyálmirigy mintákban. (A) A reverz transzkripció-polimeráz láncreakció (RT-PCR) eredményei a kappa B p65 nukleáris faktorhoz (NF-KB/p65) (a), az 1. sejtközi adhéziós molekulához (ICAM-1) (b), a tumor nekrózis faktorához α ( TNF-a) (c) és β-aktin (d). Megjelennek a reprezentatív RT-PCR eredmények. (B) A PCR-termelési sávok relatív intenzitását ImageJ szoftverrel (National Institute of Health) elemeztük. Az adatokat az egyes mRNS-ek és a megfelelő β-aktin mRNS arányában fejezzük ki. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. Kontroll, n = 10; Nagy zsírtartalmú, n = 12.

Fehérje expresszió hasnyálmirigy mintákban. (A) Western-blotok, amelyek a magon belüli fehérje nukleáris faktor kappa B (NF-KB)/p65 és az 1. citoszolos fehérje sejtközi adhéziós molekula (ICAM-1) expresszióját mutatják be. Három kísérlet reprezentatív képe jelenik meg. (B) A Western blot sávok relatív intenzitását ImageJ szoftverrel elemeztük. Az adatokat a kontrollértékek százalékában fejezzük ki. Az adatokat átlag ± SD-ként adjuk meg. Kontroll, n = 10; Nagy zsírtartalmú, n = 12.

* p 2, 6, 16 és a hasnyálmirigy-fibrózist az oxidatív stressz gátlásával enyhítették. 17, 18 Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az oxidatív stressz hatékony szerepet játszik a magas zsírtartalmú étrenddel kapcsolatos hasnyálmirigy-fibrogenezisben.

Így az NF-κB, egy ROS-érzékeny transzkripciós faktor részt vehet e hasnyálmirigy-rendellenesség mögöttes molekuláris patogenezisében. Az aktivált NF-κB sok molekula expresszióját szabályozza, ideértve a citokineket és az adhéziós molekulákat is. A TNF-a, egy gyulladáscsökkentő citokin, képes befolyásolni az NF-κB útvonalat és elősegíteni annak aktiválódását. 19 Jelen vizsgálatunkban a magas zsírtartalmú étrendet tápláló patkányok hasnyálmirigy-szöveteiben PSC aktiválódást és fibrogenezist találtunk, és ezekben a mintákban emelt NF-κB/p65 mRNS szintet és magasabb intra-nucleus p65 fehérje expressziót is találtunk. RT-PCR, immunhisztokémia és Western blot. Rengeteg bizonyíték van arra, hogy az oxidatív stresszhez kapcsolódó NF-κB aktiváció gyulladással és fibrózissal jár együtt, 20, 21 és az NF-κB aktivitás blokkolása megakadályozhatja a krónikus hasnyálmirigy-gyulladás előrehaladását az ECM szintézisének gátlásával és a gyulladáscsökkentő citokin termeléssel. 22 Ezért feltételezzük, hogy az NF-κB nemcsak hasnyálmirigy-gyulladásban, hanem fibrózisban is szerepet játszhat a magas zsírtartalmú étrendet tápláló patkányokban.

Másrészt azt is tapasztaltuk, hogy mind az ICAM-1, mind a TNF-α, az NF-kB downstream molekulái, felülszabályozódtak. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a hosszú távú, magas zsírtartalmú étrend aktivált NF-κB jelátviteli utat eredményez a hasnyálmirigyben. A hasnyálmirigyben a megemelkedett TNF-α pozitív visszajelzésként működhet az NF-κB reaktivációja szempontjából, és elősegítheti a betegség további fejlődését.

Mint tudjuk, a TGF-β pro-fibrogenetikus tényező és a hasnyálmirigy fibrózisának fő közvetítője, amely elősegítheti a PSC aktiválódását és az ECM szekrécióját. 9 A legújabb vizsgálatok kimutatták az NF-κB és a TGF-β jelátviteli utak közötti áthallást: 1) az NF-κB kiválthatja a TGF-β gén transzkripcióját; 2) az NF-KB szuppressziója csökkenti a PSC-k autokrinjét a TGF-β1 által; 24 3) a túl expresszált Smad7 blokkolja az NF-κB aktivációt, a gyulladásos citokin és az ICAM-1 expresszióját, és gátolja a fibrózist. 25, 26 Ezek az eredmények szoros összefüggésre utalnak az NF-κB aktiváció és a TGF-β expresszió között. Ennek megfelelően tanulmányunk során túlzottan expresszált NF-κB/p65-et találtunk a hasnyálmirigy szöveteiben a magas zsírtartalmú étrendet tápláló patkányoktól. Az NF-κB ezen felülszabályozása hozzájárulhat a TGF-β1 expressziójához.

Ezért tanulmányunk eredményei alapján feltételezzük, hogy a magas zsírtartalmú étrenddel összefüggő hasnyálmirigy-fibrózis mechanizmusa részben a pro-gyulladásos citokinek túlzott expresszióját követő NF-κB-aktivációnak tudható be, amely különböző molekulák kölcsönhatásait ösztönözheti., és kezdeményezze a hasnyálmirigy fibrogenezisét.

Tudomásul vesszük, hogy tanulmányunkban vannak korlátozások. Nem világos, hogy a hasnyálmirigy szövettani változásai enyhülnek-e automatikusan, ha abbahagyják a magas zsírtartalmú étrendet. Ezenkívül vannak más molekulák, amelyek részt vesznek az NF-KB aktiválásában, mint például az I-KB kináz és más fehérjék. A PSC-k aktiválásához kapcsolódó egyéb jelátviteli utakat, például a MAPK-okat és a JAK/STAT útvonalakat nem vizsgáltuk vizsgálatunkban. De tanulmányunknak jelentős klinikai következményei lehetnek. Az elhízás globális járványával nézünk szembe, és már most is széles körben elismerik az elhízás és az anyagcserezavarok közötti összefüggéseket. Ösztönözni kell a magas zsírtartalmú étrend, az elhízás és a hasnyálmirigy károsodása közötti mély összefüggések feltárására irányuló jövőbeni klinikai és kísérleti tanulmányokat.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

A szerzők köszönetet mondanak Dr. William Tam-nak az ausztráliai Royal Adelaide Kórházban a kézirat kritikus elolvasásáért. Ezt a munkát a Kínai Shandong tartomány Tudomány- és Technológiai Tanszékének és Közegészségügyi Minisztériumának támogatása támogatta (2009HZ069 sz.).