A nagy sűrűségű lipoproteinek javítják az inzulinérzékenységet a magas zsírtartalmú étrenddel táplált egerekben a májgyulladás elnyomásával [S]

Kristine C. McGrath

* Természettudományi Kar, Orvostudományi és Molekuláris Biológiai Tudományok Kar, Műszaki Egyetem, Sydney, Sydney, NSW, Ausztrália

† Szívkutató Intézet, Newtown, NSW, Ausztrália

Xiao Hong Li

† Szívkutató Intézet, Newtown, NSW, Ausztrália

§ Endokrinológiai Osztály, Dezhou Népi Kórház, Shandong, Kína

Phillippa T. Whitworth

* Természettudományi Kar, Orvostudományi és Molekuláris Biológiai Tudományok Kar, Műszaki Egyetem, Sydney, Sydney, NSW, Ausztrália

Kasz Róbert

* Természettudományi Kar, Orvostudományi és Molekuláris Biológiai Tudományok Kar, Műszaki Egyetem, Sydney, Sydney, NSW, Ausztrália

Joanne T. Tan

† Szívkutató Intézet, Newtown, NSW, Ausztrália

Susan V. McLennan

** Orvostudományi tudományág, Sydney Egyetem, Sydney, NSW, Ausztrália

David S. Celermajer

† Szívkutató Intézet, Newtown, NSW, Ausztrália

** Orvostudományi tudományág, Sydney Egyetem, Sydney, NSW, Ausztrália

†† Kardiológiai Osztály, Royal Prince Alfred Hospital, Camperdown, NSW, Ausztrália; és

Philip J. Barter

† Szívkutató Intézet, Newtown, NSW, Ausztrália

§§ Új-Dél-Wales-i Egyetem Orvostudományi Kar, Randwick, NSW, Ausztrália

Kerry-Anne Rye

† Szívkutató Intézet, Newtown, NSW, Ausztrália

§§ Új-Dél-Wales-i Egyetem Orvostudományi Kar, Randwick, NSW, Ausztrália

Alison K. Heather

* Természettudományi Kar, Orvostudományi és Molekuláris Biológiai Tudományok Kar, Műszaki Egyetem, Sydney, Sydney, NSW, Ausztrália

† Szívkutató Intézet, Newtown, NSW, Ausztrália

Társított adatok

Absztrakt

A májgyulladás inzulinrezisztenciát indukálhat a gyulladáscsökkentő citokinek szekréciójának egyensúlyhiányán keresztül, a gyulladásos/oxidatív transzkripciós faktorok aktiválása után (1). A hepatocitákban a gyulladásos választ közvetítő kulcsfontosságú transzkripciós faktor a nukleáris faktor κB (NF-κB) (2, 3). Az aktivált máj NF-κB önmagában képes az inzulinrezisztencia kialakulására, amit az a megállapítás is bizonyít, hogy a nukleáris faktor κB kináz alegység β (IKK-β) gátlójának transzgenikus expressziója, amely növeli az NF-κB aktivitást, nyílt inzulinrezisztenciát eredményez normál táplálékkal ellátott egerekben. chow étrend (4). Ezzel szemben, ha az alacsony NF-κB-t expresszáló heterozigóta IKK-β +/− egereknek magas zsírtartalmú étrendet (HFD) táplálnak, vagy ha keresztezik őket ob/ob egerekkel, akkor nem alakulnak ki inzulinrezisztencia (5). Ezenkívül a máj NF-κB aktivitásának gátlására irányuló genetikai manipuláció közvetlenül megvédi az inzulinrezisztenciát az egerek HFD-reakciójaként (4). Ezek a megállapítások erős bizonyítékot szolgáltatnak arra vonatkozóan, hogy a máj az inzulinrezisztenciát okozó gyulladásos hatás elsődleges helye, és hogy az NF-κB a gyulladás okozta inzulinrezisztencia mögött álló központi patogén tényező.

Az NF-κB aktiváció számos pro-gyulladásos citokin szekrécióját növeli, ideértve az interleukin (IL) -6, a TNFa és az IL-1β (1 )ét. Az NF-κB aktiváció a jelző események komplex sorozatát foglalja magában, amely az inhibitor κB (IκB) kináz komplex aktivációjával kezdődik, amely viszont foszforilálja az IKB-t (6, 7). Az IKB az NF-κB inhibitor fehérje, amely az NF-κB-hez kötődik, a citoplazmában szekvenálva (8). Miután azonban foszforilálódott, az IKB-t megcélozzák az ubiquitáció és az azt követő lebomlás szempontjából, így az NF-κB szabadon áthelyeződik a sejtmagba, és megindíthatja a célgének transzkripcióját (9).

A nagy sűrűségű lipoproteinek (HDL) erős gyulladáscsökkentő hatással bírnak (10, 11). Korábban beszámoltunk arról, hogy az emberi szívkoszorúér-endothel sejtek HDL-ekkel történő előkezelése gátolja a TNFα által kiváltott NF-κB aktivációt (12). Ezenkívül az emberi apolipoprotein A-I (apoAI) (a fő HDL fehérje) nyulakba történő injekciója gátolja az érgyulladást (10). A HDL szint állítólag alacsony az inzulinrezisztenciával rendelkező alanyokban (13), ezért ez arra késztetett bennünket, hogy megkérdőjelezzük, hogy a HDL növelése javíthatja-e az inzulinrezisztenciát a megemelkedett májgyulladásos állapot megcélzásával. Megmutattuk, hogy a lipidmentes apoAI injekciói csökkentik a máj és a szisztémás citokin szintjét, elnyomják a máj NF-κB aktivációját és javítják az inzulinérzékenységet a magas zsírtartalmú C57BL/6 egerekben. Ezenkívül bemutatjuk, hogy az apoAI-tartalmú rekonstruált HDL-ek (rHDL-ek) az IκB kináz (IKK)/IκB/NF-κB jelátviteli út szuppresszióján keresztül közvetítik gyulladáscsökkentő hatásukat a tenyésztett hepatocitákban.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Lipidmentes apoAI és discoidális rHDL-ek előállítása

HDL-eket izolált humán plazmából (Gribbles Pathology, Adelaide, SA, Ausztrália) szekvenciális ultracentrifugálással izoláltunk 1,063–1,21 g/ml sűrűségtartományban. Ezután lipidmentes apoAI-t izoláltunk a HDL-ből a korábban leírtak szerint (14). 1-palmitoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-foszfatidil-kolinná (PLPC) komplexként apoAI-t tartalmazó diszoidális rHDL-eket (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) készítettünk kolát dialízis módszerrel (15). A PLPC: apoAI mólarány 100: 1 volt. Közvetlenül a kísérletekben történő felhasználás előtt lipidmentes apoAI vagy rHDL készítményeket intenzíven dializáltunk endotoxinmentes foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) (pH 7,4) szemben (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Ausztrália).

Állati modell

Glükóz tolerancia, inzulin tolerancia és piruvát provokációs tesztek; éhomi szérum triglicerid, citokin és inzulin mérések

A vizsgálat végén egy intraperitoneális glükóz tolerancia tesztet (IPGTT), egy intraperitoneális inzulin tolerancia tesztet (IPITT) és egy piruvát provokációs tesztet végeztek egy éjszakán át éheztetett egerekben. Vérmintákat vettünk a farokcsúcsból a megadott időpontokban, és a glükózszintet glükométerrel mértük (Accu-Chek, Roche Diagnostics, Castle Hill, NSW, Ausztrália). A tesztek során alkalmazott dózisok: glükóz 1 g/testtömeg-kg, inzulin 0,75 NE/testtömeg-kg, és piruvát 2 g/testtömeg-kg az IPGTT, az IPITT és a piruvát-provokációs teszt esetében. A szérum triglicerid szintet triglicerid reagenssel mértük (Roche Diagnostics). A szérum citokinszinteket egér BioPlex kit (Bio-Rad, Hercules, CA) alkalmazásával határoztuk meg. Az inzulinszinteket enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (Crystal Chem, Downers Grove, IL) mértük. Minden egér esetében meghatározták az inzulinrezisztencia (HOMA-IR) homeosztatikus modelljét (4).

Intrahepatikus semleges lipid felhalmozódási vizsgálat

A májban felhalmozódott semleges lipidek (triglicerid és koleszterin-észterek) szintjét a szövetkivonatok Oil Red-O mennyiségi meghatározásával határoztuk meg kvantitatív vizsgálattal (16). Röviden, a fagyasztott májszövetet (100 mg) homogenizáltuk, és 60 percig inkubáltuk Oil Red-O oldattal (0,15% Oil Red-O, 0,4% dextrin). A mintákat 60% izopropanollal mostuk a festékfelesleg eltávolítása érdekében, majd a lipidbe beépített festéket 99% izopropanollal extraháltuk, és az abszorbancia 520 nm-en történő mérésével számszerűsítettük (16).

Sejtkultúra

Humán hepatoma sejtvonalat (HuH-7) (Health Science Research Resources Bank, Osaka, Japán) DMEM/F12 táptalajban (Sigma-Aldrich) tenyésztettünk 10% FBS-szel 37 ° C-on, 5% CO2-ban. Eltérő rendelkezés hiányában a HuH-7 sejteket 16 órán át inkubáltuk rHDL-ekkel (végső apoAI-koncentráció, 16 μmol/l vagy 0,45 mg/ml), PBS-sel (kontroll), nátrium-szaliciláttal (5 mmol/l) (Sigma-Aldrich), vagy az IKK inhibitor, wedelolakton (8 mmol/l) (Calbiochem, Gibbstown, NJ), majd 24 órán át TNFa-val (1 ng/ml) stimuláljuk. Néhány sejt esetében a 16 órás inkubálás után az rHDL-t tartalmazó táptalajt eltávolítottuk, és a sejteket kétszer PBS-sel mostuk, majd 24 órán át TNFa-val (1 ng/ml) kiegészített friss táptalajt adtunk hozzá. A nem TNFa-stimulált PBS-sel kezelt sejtek kontrollként működtek.

Koleszterin kimerülés és pótlás

A koleszterin kimerülést HuH-7 sejtek 1,5% metil-P-ciklodextrinnel végzett inkubálásával 1 órán át 37 ° C-on inkubáltuk. A koleszterin-visszanyerés elvégzéséhez a koleszterint (0,4 mg/ml) keverés közben keverjük, metil-β-ciklodextrinnel (10%) 1:20 arányban, 40 ° C-on. A HuH-7 sejtek 16 órás rHDL-ekkel történő inkubálása után a koleszterin-pótlást 1: 25-nél hígított koleszterin/ciklodextrin oldat hozzáadásával további egy órán át végeztük.

Laktát-dehidrogenáz sejtek életképességi vizsgálata

A HuH-7 sejteket 40 órán át inkubáltuk rHDL-ekkel (végső apoAI-koncentráció, 16 μmol/l vagy 0,45 mg/ml), PBS-sel (kontroll) vagy nátrium-szaliciláttal (5 mmol/l, Sigma-Aldrich). Inkubálás után a sejt táptalajt összegyűjtöttük és jégen tároltuk. A sejteket ezután PBS-sel mostuk és 1 ml vízben 20 percig 4 ° C-on lizáltuk. Centrifugálás után (1000 g, 5 perc) a sejttörmelék pelletezésére és eltávolítására 10 μl sejtlizátumot vagy sejtközeget inkubáltunk 200 μl 0,15 mg/ml NADH-val és 2,5 mmol/l nátrium-piruvát PBS munkareagenssel. Az abszorbanciát 340 nm-en 5 percenként, 35 percen keresztül határoztuk meg (Tecan Sunrise; Tecan Group Ltd., Mannedorf, Svájc). Az életképességet a táptalajra mért laktát-dehidrogenáz relatív aktivitása és a teljes aktivitás alapján számoltuk (17).

Tranziens sejttranszfekciók és luciferáz mérések

A HuH-7 sejteket egy NF-KB-luciferáz riporter vektorral (Promega Corporation, Madison, WI) transzfektáltuk a pRL-TK (Promega) transzfekciót kontroll plazmiddal, Effectene (Qiagen, Hilden, Németország) (18) felhasználásával. A transzfektált sejteket előzetesen inkubáltuk rHDL-ekkel (végső apoAI-koncentráció, 16 μmol/l vagy 0,45 mg/ml), majd 1 ng/ml TNFa-val (rHDL + TNFα) stimuláltuk. A transzfektált sejtek egy részét előzetesen inkubáltuk rHDL-ekkel, de az rHDL-eket eltávolítottuk a táptalajból, mielőtt a TNFa-val aktiváltuk őket (rHDL/TNFa). A kezelés után a sejteket PBS-sel mostuk, majd passzív lizáló pufferrel (Promega) lizáltuk. A mintákat összegyűjtöttük, centrifugáltuk a sejttörmelék eltávolítása érdekében, majd a Dual-Luciferase riporter rendszer (Promega) segítségével megvizsgáltuk a luciferáz és a Renilla aktivitását. A méréseket Fluoroskan Ascent FL luminométerrel (Thermo Labsystems, Waltham, MA) használtuk.

IKK assay

A HuH-7 sejteket előkezeltük rHDL-ekkel (végső apoAI-koncentráció, 16 μmol/l vagy 0,45 mg/ml) vagy PBS-sel, majd 15 percig TNFa-val (1 ng/ml) stimuláltuk. A sejteket 1% Nonidet P-40, 0,1% SDS, 0,5% dezoxikolát, 150 mmol/l NaCl, 50 mmol/l Tris (pH 8) és proteáz inhibitor koktél (Sigma-Aldrich) tartalmú RIPA lízispufferben lizáltuk. . A fehérje lizátumot (10 μg) 2 mmol/l ATP-vel és 10 μg IKK szubsztrát peptiddel (Millipore, Billerica, MA) inkubáltuk reakciópufferben (8 mmol/l MOPS (pH 7), 0,2 mmol/l EDTA-Na2). szobahőmérsékleten 90 percig. Ezután Kinase-Glo reagenst (50 μl; Promega) adunk a reakcióelegyhez, szobahőmérsékleten 10 percig inkubáljuk, és a lumineszcens jelet Fluoroskan Ascent FL-n (Thermo Labsystems) mértük.

IκB assay

A teljes sejtfehérje-lizátumot HuH-7 sejtekből extraháltuk RIPA-lízis pufferben, az IKK assay-nél leírtak szerint. A fehérje-lizátumot (100 mg) az IκBα szintre vizsgáltuk a PathScan foszfo-IκBα és a teljes IκBα enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (Cell Signaling Technology, Danvers, MA).

NF-κB nukleáris transzlokációs vizsgálat

A nukleáris fehérjéket HuH-7 sejtekből vagy májmintákból extraháltuk a NucBuster fehérje extrakciós készlet alkalmazásával (Merck and Co., Whitehouse Station, NJ). A nukleáris fehérjéket (100 μg) az NF-KB NoShift transzkripciós faktor tesztkészlet (Merck and Co.) segítségével vizsgáltuk.

Humán NF-κB célgén tömb elemzés

A teljes RNS-t izoláltuk HuH-7 sejtekből TRI reagens (Sigma-Aldrich) alkalmazásával. Biotinnal jelölt cDNS-próbákat 10 μg teljes RNS-ből készítettünk AMV reverz transzkriptáz (Promega) és biotin dUTP alkalmazásával. A cDNS-próbákat ezután hibridizáltuk a TranSignal NF-KB célgén-tömbjével (Panomics, Santa Clara, CA). A közvetlen kemilumineszcens képalkotást ChemiDoc XRS (Bio-Rad) képalkotó rendszerrel végeztük. Mennyiség Egy szoftvert (Bio-Rad) alkalmaztunk páronkénti összehasonlító gén expresszióhoz, miután a jelintenzitásokat a háttér és a referencia gén expressziójához igazított arányra konvertáltuk. A tömb reprodukálhatóságát RT-kvantitatív (q) PCR-rel igazoltuk az érdekes génekre.

A teljes mRNS izolálása és elemzése RT-qPCR segítségével

A teljes RNS-t HuH-7 sejtekből vagy májmintákból extraháltuk TRI reagenssel (Sigma-Aldrich), és a koncentrációt 100 ng/μl-re normalizáltuk SYBR Green II assay alkalmazásával (Molecular Probes, Invitrogen, Melbourne, Ausztrália). Az RNS integritását az Experion rendszerrel (Bio-Rad) határoztuk meg. A cDNS-t az összes RNS-ről (100 ng) reverz átírással iSCRIPT (Bio-Rad) alkalmazásával írtuk le. A génexpressziót (lásd a primer szekvenciákat lásd az 1. táblázatban) PCR-rel amplifikáltuk 12 pmol primert és iQ SYBR Green Supermixet tartalmazó reakcióelegyekben. Az amplifikációt Bio-Rad iQ5 termociklusos hajtóműben hajtottuk végre a következő protokoll alkalmazásával: 95 ° C 30 másodpercig, 60 ° C 30 másodpercig és 72 ° C 30 másodpercig. Az mRNS gén expressziójának relatív változását a ΔΔCT megközelítéssel határoztuk meg (19), humán minták referencia génjeként β-2-mikroglobulin (β2M) szinteket vagy egér mintáknál IID transzkripciós faktor (Tbp) referencia gént használva.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. A kezelések jelentős különbségeit egyirányú ANOVA-val határoztuk meg Bonferroni post hoc tesztanalízisével. Az elemzéshez a PRISM szoftvert használtuk. A szignifikanciát kétfarkú P értéken állítottuk be 1A. Ábra ). A testtömeg növekedése a szérum triglicerid, a máj semleges lipid (triglicerid és koleszterin észterek) szintjének emelkedésével járt (kiegészítő IIIA. Ábra, B; P ábra 1B, C). A HFD által kiváltott testsúlynövekedést az apoAI kezelések nem befolyásolták; azonban elnyomta a HFD által kiváltott szérum triglicerid, máj semleges lipid (triglicerid és koleszterin észterek), SREBP-1 és ChREBP szint emelkedését (IIIA, B és 1B, C kiegészítő ábra).