A kitozán és a vízoldható kitozán mikro- és nanorészecskék hatása elhízott, magas zsírtartalmú étrenddel rendelkező patkányokban

Hong-liang Zhang

1 Gyógyszerészeti Tanszék, a Guangxi Orvostudományi Egyetem első kapcsolt kórháza, Nanning

2 A máj hiperlipémiás szabályozásának kulcsfontosságú kutatóközpontja SATCM/Lipid anyagcsere 3. szintű laboratóriuma, Guangdong TCM Kulcsfontosságú anyagcserebetegségek laboratóriuma, Guangdong Gyógyszerészeti Egyetem

Xiao-bin Zhong

1 Gyógyszerészeti Tanszék, a Guangxi Orvostudományi Egyetem első kapcsolt kórháza, Nanning

Yi Tao

3 HEC Pharm Group, Dongguan

Si-hui Wu

4 Gyógyszerészeti Tanszék, Guangdong Food and Drug Szakképző Szakiskola, Guangzhou, Kína

Zheng-quan Su

Absztrakt

Célja:

Ez a tanulmány meghatározta a kitozán (CTS) és a vízben oldódó kitozán (WSC) mikrorészecskék és a nanorészecskék (NP) hatását magas zsírtartalmú étrend okozta elhízásban szenvedő patkányokban.

Mód:

A patkányokat véletlenszerűen nyolc csoportba osztottuk: normál étrendű csoport (vakpróba), magas zsírtartalmú emulziós csoport (negatív kontroll), CTS és WSC kontrollcsoport, CTS-MP és WSC-MP csoport és CTS-NP és a WSC-NP csoportok. Az elhízás modelljének megállapításához az összes csoportot (a vak kontrollcsoport kivételével) 4 hétig táplálták magas zsírtartalmú étrenddel. Különböző mintákat adtak be orálisan naponta egyszer a kezelõ csoportoknak 4 héten keresztül.

Eredmények:

A WSC-MP és a WSC-NP, valamint a CTS-MP és a CTS-NP csoportokban szignifikánsan alacsonyabb súlygyarapodást figyeltek meg a normál étrendet és magas zsírtartalmú étrendet folytató patkányokhoz képest (P Kulcsszavak: elhízás, kitozán, vízoldható kitozán, mikrorészecskék, nanorészecskék, akut toxicitás

Bevezetés

Az elhízás egyre növekvő probléma, amely jelentős súlyossági morbiditást és mortalitást, valamint az életminőség csökkenését eredményezi. 1 Az elhízott embereknél nagyobb valószínűséggel alakul ki ízületi gyulladás, tüdőbetegség, cukorbetegség, 2 metabolikus szindróma, magas vérnyomás és koszorúér-betegség, 3 és nagyobb valószínűséggel csökken az élettartama.4

A mikro- és nanoszkóp rendszerek fejlesztése az elmúlt évtizedek során az egyik legszembetűnőbb tendencia az orvosbiológiai kutatások számos területén.16 A CTS nanorészecskék (CTS-NP) szintén nagy figyelmet kaptak a különböző gyógyszerek hordozóiként. 17 A CTS mikrorészecskék (CTS-MP) és a CTS-NP hatását az elhízás ellen azonban még nem jelentették. Ebben a tanulmányban a CTS-MP és a CTS-NP hatását vizsgálták a patkányok elhízására. Az in vitro vizsgálatokból származó bizonyítékok azt mutatták, hogy a kisebb szemcseméretű CTS-nek jobb volt a koleszterinkötő képessége.18 Ahhoz, hogy iparilag releváns legyen, a folyamatnak alacsony költségűnek kell lennie, magas termelési sebesség mellett. A közelmúltban sokféle, keskeny szemcseméret-eloszlású és magas terméshozamú MP-t készítettek porlasztva szárítási módszerrel. 19–21. Ebben a tanulmányban a CTS-MP és a CTS-NP porlasztva szárítással készült.

Korábbi beszámolókban bebizonyosodott, hogy a CTS-NP és a WSC-NP hatékony szerek a szérum lipidszintek csökkentésére patkányokban a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott hiperlipidémiában. 22, 23 Jelen tanulmány tovább vizsgálja a különböző CTS-MP hatásait. és a CTS-NP elhízott patkányokban magas zsírtartalmú étrendet fogyasztottak. Ezért ennek a vizsgálatnak a fő célja az volt, hogy összehasonlítsa a CTS és a WSC MP és NP-k súlycsökkentő hatását a kereskedelemben kapható CTS-vel zsíros táplálékkal táplált elhízott patkányokban. Ezenkívül a képviselők és az NP-k biztonságának értékelése a jelentés másik célja.

Anyagok és metódusok

Anyagok

A 350 kDa és 210 kDa átlagos molekulatömegű CTS-t és WSC-t a Shandong Aokang Biotech Ltd-től (Shandong, Kína) szereztük be. A viszkozitás kisebb volt, mint 200 cP, és a dezacetilezési értékek 96,2%, illetve 85% voltak. Az összkoleszterin (TC), a triacilglicerin (TG), a nagy sűrűségű lipoprotein koleszterin (HDL-C) és az alacsony sűrűségű lipoprotein koleszterin (LDL-C) készleteket a Bio Sino Biotechnology and Science Inc-től (Peking, Kína) szereztük be. Az összes többi reagens és oldószer analitikai minőségű volt.

Előkészítés és jellemzés

A CTS-MP-t és a WSC-MP-t porlasztva szárítási technikával készítettük. A CTS feloldása ecetsavban (1,0 térfogat%/térfogat) 2,5% (tömeg/térfogat) CTS-t tartalmazó oldatot eredményezett. A WSC oldatot úgy állítottuk elő, hogy a WSC-t ioncserélt vízben oldottuk, és így 2,0% (tömeg/térfogat) WSC-t tartalmazó oldatot állítottunk elő. Az oldatokat ezután porlasztva szárítottuk az Lab-Spray Dryer L-117 (Laiheng Scientific Co, Ltd, Peking, Kína) alkalmazásával, standard fúvókával (0,7 mm). A porlasztó légáram sebessége 10–15 l/perc, az áramlási sebesség pedig 600 ml/óra volt. A bemeneti hőmérsékletet 160 ° C-on állítottuk be. A kimeneti hőmérsékletet a bemeneti hőmérséklet és a relatív tényezők, például a levegő és a folyadék betáplálási sebessége határozta meg, és 80 ° C és 85 ° C között változott. A MP-k morfológiáját pásztázó elektronmikroszkóppal (S-3700N; Hitachi High Technologies, Tokió, Japán) vizsgáltuk 10 kV-on. Az MP-k részecskeméretét és méreteloszlását egy részecskemérettel határoztuk meg (Zetasizer ® 3000HS; Malvern Instruments Ltd, Malvern, Egyesült Királyság).

A CTS-NP-t a szerzők csoportja által korábban ismertetett módszerrel állítottuk elő. 22 Röviden: a CTS-t feloldottuk ecetsav-oldatban (1,0% térfogat/térfogat). Ezután a tripolifoszfátot desztillált vízben (1,0 mg/ml) oldjuk. A tripolifoszfát vizes bázikus oldatának spontán nanoszuszpenziót (kék átlátszó szuszpenzió) kaptunk, amikor a CTS vizes oldatához mechanikus keverés közben (1000 fordulat/perc) szobahőmérsékleten hozzáadtuk. Ezután a nanoszuszpenziót rotációs bepárlóval (Rotary Evaporator N-1000D-W; Eyela, Japán) az eredeti térfogat felére felemésztjük. A porlasztva szárítást Lab-Spray Dryer L-117 készülékkel végeztük, standard fúvóka (0,7 mm) alkalmazásával. Az állítható paraméterek magukban foglalták a be- és kimeneti hőmérsékletet, az oldat szivattyú áramlási sebességét és az aspirátor részleges vákuumát.

Hasonlóképpen, a WSC-NP a pozitív töltésű kopolimerek és a negatív töltésű tripolifoszfát közötti komplex elektrosztatikus kölcsönhatások eredményeként alakult ki enyhe körülmények között.23 Röviden: a WSC-t és a tripolifoszfátot tisztított vízben oldottuk fel. A WSC-NP előállításához a WSC oldatot szobahőmérsékleten (25 ° C) kevertük (1000 fordulat/perc). Ezután a tripolifoszfát-oldatot adtuk a rendszerhez, miközben a keverést folytattuk, hogy teljes nanorészecskék képződjenek (kék átlátszó szuszpenzió). Ezután a nanoszuszpenziót porlasztva szárítottuk az Lab-Spray Dryer L-117 segítségével.

Az NP-k részecskeméretét és méreteloszlását egy részecskemérő (Zetasizer 3000HS) alkalmazásával mértük. A nanorészecskék morfológiáját pásztázó elektronmikroszkóppal (S-3700N) vizsgáltuk 10 kV feszültségen.

Állatok

Ezeket a kísérleteket a Guangdong Gyógyszerészeti Egyetem (Guangzhou, Kína) Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá. Hím Sprague – Dawley patkányokat (8 hetesek az étrendi időszak elején) használtak ezekben a kísérletekben. A Guangzhou Egyetem Kínai Orvostudományi Laboratóriumi Állatközpontjából (Guangzhou, Kína) vásárolták őket. A kísérleti időszak alatt az állatokat ketrecenként tízen tartották a laboratóriumi állattartó létesítményben, hőmérséklet és páratartalom szabályozott helyiségben, 12 órás fény-sötét ciklus mellett. Valamennyi patkányt standard rágcsáló-chow-val láttuk el (Guangdong Laboratory Animal Center, Guangzhou, Kína), és 1 hétig hagytuk őket akklimatizálódni. Ezután a patkányokat véletlenszerűen nyolc csoportba soroltuk (n = 10): (1) normál zsírtartalmú étrend-csoport (NF); (2) magas zsírtartalmú étrend-csoport (HF); (3) CTS csoport; (4) CTS-MP csoport; (5) CTS-NP csoport; (6) WSC csoport; (7) WSC-MP csoport; és (8) WSC-NP csoport.

Az NF-csoportot standard rágcsáló-chow-val ad libitum táplálták, és a HF-csoport a vizsgálat végéig magas zsírtartalmú étrendet kapott (alaptáplálék 70%, tojássárgája 10%, sertészsír 12% és cukor 8%). A többi csoportot 4 héten keresztül táplálták a magas zsírtartalmú étrenddel, hogy megállapítsák az elhízás modelljét. Ezután 5,0 g CTS-t, WSC-t, CTS-MP-t, WSC-MP-t, CTS-NP-t és WSC-NP-t diszpergálunk 100 ml desztillált vízben. Minden mintát (450 mg/kg) orálisan adtak be naponta egyszer a kezelõ csoportoknak 4 hétig.

Testtömeg, máj és zsírszövet súlya, valamint táplálékfelvétel

Az elhízás állapotát a testtömeg és a táplálékfelvétel mérésével figyelték meg, mivel az elhízott állapotban általában nagyobb az étkezés. A testsúlyt és az étkezés mennyiségét hetente egyszer regisztrálták. A kísérleti szakasz végén a patkányokat egy éjszakán át éheztettük, és vérmintákat vettünk az orbitális vénából kapilláris cső alkalmazásával éteres érzéstelenítésben. Ezután a patkányokat leöltük és boncoltuk. A májat, az epididymális fehér zsírszövetet és a perirenalis fehér zsírszövetet gyorsan eltávolítottuk és lemértük. Egy darab májat azonnal -80 ° C-on tároltunk további elemzés céljából.

Szérum és máj lipidek mérése

A szérum és a máj lipidjeit a kereskedelemben kapható készletekkel (Bio Sino) mértük az ajánlott protokollok szerint. A plazmát centrifugálással állítottuk elő, és a kereskedelemben kapható készletekkel vizsgáltuk.

Akut toxicitási vizsgálatok

A CTS és a WSC MP-k és NP-k akut orális toxicitását patkányokban értékelték a GB 15193,3-1994 CN akut toxicitási teszt nemzeti szabványa által leírt eljárással. Az állatokat kontrollcsoportokra és hat kezelési csoportra osztottuk (CTS, CTS-MP, CTS-NP, WSC, WSC-MP és WSC-NP), mindegyik csoportban 20 állat (tíz hím és tíz nő). A kezelés előtt az összes állatot 4 órán át éheztettük. A kontroll csoportok normál sóoldatot kaptak, a kezelt csoportok pedig 1000, 2150, 4640 és 10 000 mg/kg megjelölt mintákat kaptak. Az állatokat a kezelés után 1 órán át, majd szakaszosan 4 órán át figyeltük. Ezt követően a patkányokat további 14 napig megfigyeltük a kezelés után. A patkányok mortalitását, klinikai jeleit és súlyos eredményeit 14 napon keresztül figyeltük meg és mértük különböző CTS MP és NP orális beadása után. Ezt követően az állatokat méhnyak diszlokációval feláldoztuk. A létfontosságú szerveket, beleértve a májat, a tüdőt, a lépet, a vesét és a szívet, eltávolítottuk makroszkópos elemzés céljából.

Statisztikai analízis

Valamennyi kísérleti eredményt összehasonlítottuk az IBM ® SPSS 16.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL) egyirányú varianciaanalízisével, és az adatokat átlag ± szórásként fejeztük ki. A csoportos átlagok közötti különbségeket a Student – Newman – Keuls többszörös tartományú teszttel elemeztük. P 1. ábra. Az átlagos súlygyarapodás a CTS és a WSC csoportban 68,99 g, illetve 33,52 g volt. Jelentősen kevesebb súlygyarapodást figyeltek meg a különböző MP-vel etetett állatoknál (57,44 g volt a CTS-MP-vel etetett és 21,13 g a WSC-MP-vel tápláltaknál) és az NP-knél (49,31 g volt a CTS-NP-vel tápláltaknál, és 25,73 g-ot nyertek a WSC-NP-vel tápláltaknál a HF (121,25 g) és az NF (113,81 g) csoporthoz képest (P 2. ábra), de a kezelési csoportok között nem.

Hatásai (A) kitozán és (B) vízben oldódó kitozán mikro- és nanorészecskék patkányok táplálékfelvételén (n = 10).

Rövidítések: CTS, kitozán; CTS-MP, kitozán mikrorészecskék; CTS-NP, kitozán nanorészecskék; HF, magas zsírtartalmú étrend; NF, normál zsírtartalmú étrend; WSC, vízoldható kitozán; WSC-MP, vízoldható kitozán mikrorészecskék; WSC-NP, vízoldható kitozán nanorészecskék.

Májsúly és zsírszövet

A csoportok végső máj- és zsírszövet-tömegét a 3. és a 4. ábra mutatja. 4. A máj súlya szignifikánsan csökkent a CTS-MP csoportban a HF csoporthoz képest. A többi csoport között nem tapasztaltunk különbséget (P> 0,05). CTS és WSC MP és NP beadása csökkentette a végső epididymális fehér zsírszövet és a perirenalis fehér zsírszövet súlyát a HF és NF csoportokhoz képest (P> 0,05). A CTS és a WSC csoportok szintén csökkent végső zsírszövet-súlyt mutattak, de a különbségek nem voltak statisztikailag szignifikánsak a HF-csoporthoz képest (P> 0,05).

A kitozán és a vízben oldódó kitozán mikro- és nanorészecskék hatása a máj súlyára patkányokban (n = 10).

A kitozán és a vízben oldódó kitozán mikro- és nanorészecskék hatása patkányok zsírszövetére (n = 10).

Szérum és máj lipidek

Megjegyzések: Az adatokat átlag ± szórásként adjuk meg (n = 10); az oszlopon belül a különböző betűkkel jelölt értékek jelentősen eltérnek egymástól (P 2. és 3. táblázat). 3). A WSC-MP és a WSC-NP csoportok kivételével az összes vizsgált dózis halálozási száma kevesebb mint a fele volt. Ezért a CTS, a WSC, a CTS-MP és a CTS-NP átlagos halálos dózisának (LD50) értéke> 10 000 mg/kg volt. Ez arra utal, hogy a CTS, a CTS-MP és a CTS-NP nem okozott akut toxicitást. A halálozási arány 55% volt a WSC-MP csoportban és 65% a WSC-NP csoportban. Az LD50 meghatározásához a dózis eszkalációs számítási táblázat segítségével azt találtuk, hogy a WSC-MP és a WSC-NP LD50 értéke 4080 mg/kg, illetve 2370 mg/kg volt. Az akut szisztémás toxicitás osztályozása szerint a GB 15193,3-1994 CN által ajánlott orális LD50 értékek alapján a WSC-MP és a WSC-NP 4. osztályba sorolták (501 mg/kg 1000 nm. 30,31 CTS-MP nagy felület, amely megkönnyítheti a lipidek és zsír adszorpcióját.

A WSC-NP azonban nem bizonyult hatékonyabbnak a súlygyarapodás csökkentésében, mint a WSC-MP. Úgy tűnik, hogy a WSC részecskemérete nem a domináns tényező, amely befolyásolja a lipidek felvételét. Ez azt sugallja, hogy a WSC antiobezitási mechanizmusa eltérhet a CTS mechanizmusától. Az elhízást sejtszinten a zsírszövetekben a fibroblastos preadipocitáktól megkülönböztetett adipociták számának és méretének növekedése jellemzi.32 Az adipocita differenciálódás során transzkripciós faktorok, például peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor-y és CCAAT/enhancer-kötő fehérjék részt vesznek az adipocita-specifikus fehérjék, például a glükóz transzporter-4,33 szekvenciális expressziójában. Eközben egy in vitro vizsgálat kimutatta, hogy a CTS oligoszacharidok jelentősen csökkentették a lipidfelhalmozódást.34 a peroxiszóma proliferátor által aktivált receptor-y szintén jelentősen csökkent. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a WSC-MP fiziológiai koncentrációk esetén elnyomhatja az adipocita differenciálódást. A WSC-MP hatása az adipocita differenciálódásra azonban nem teljesen ismert. Így az elhízás elhárításának mechanizmusát egy későbbi tanulmányban tovább kell tisztázni.

A zsírszövet és a máj súlya csökkent a CTS-MP és a WSC-MP csoportokban, de ezek a kezelések csekély hatást gyakoroltak a testtömegre. A máj súlyát csak a CTS-MP csökkentette szignifikánsan. Az eredmények következetlenségének oka lehet a zsír felhalmozódásának és a testtömeg csökkentésének alapjául szolgáló különböző mechanizmusok. Az elhízás genomvizsgálatának eredményei arra utalnak, hogy több tranziens receptor potenciális (TRP) csatorna társulhat az elhízással.35 A zsírszövetben és a 3T3-L1 preadipocitákban a messenger ribonukleinsavat és a TRPV1 fehérjét detektálták, amelyek szerepet játszhatnak adipogenezis.36 Leung felfedezte, hogy a bélnyálkahártya afferens idegek kapszaicin általi stimulálása megnöveli a bél véráramlását, amelyet egy TRP antagonista csillapít. Ez részben magyarázhatja, hogy a CTS-MP bevitele miért csökkenti a májzsír felhalmozódását, de csekély hatással van a testtömegre.

A méret csökkenésével a patkányok TC és TG szintje fokozatosan csökkent a CTS, WSC, CTS-MP és CTS-NP csoportokban. Ez összhangban áll azzal a jelentéssel, hogy a finomabb szemcseméretű CTS képes volt hatékonyan csökkenteni a plazma lipidszintet patkányokban.38 A TSC azonban a WSC-NP csoportban megemelkedett a többi kezelési csoporthoz képest. Mint korábban említettük, a WSC-MP elnyomhatja az adipocita differenciálódást fiziológiai koncentrációknál. A TG-t szintetizálják glükózból és egy zsírsavból, amelyet a glükóz transzporter-4 és a CD36 zsírsav transzporter beépít a 3T3-L1 preadipocitákba. 39 Úgy tűnik, hogy a glicerin-3-foszfát-dehidrogenáz citoszol enzim fontos szerepet játszik a glicerin A TG.40 WSC-NP lehet a glicerin-3-foszfát-dehidrogenáz agonistája, és ezért a TG emelkedését indukálhatja. Ez a hipotézis további kutatásokat igényel.

Következtetés

Jelen munka bizonyítja, hogy a CTS és a WSC MP és NP-k alkalmasak a súlygyarapodás csökkentésére és elfogadható biztonsági pontszámokkal rendelkeznek, amelyek alkalmasak az emberi elhízás elleni kezelésekre. A WSC-MP és a WSC-NP, különösen a WSC-MP, kiváló képességet mutattak a súlygyarapodás csökkentésére zsíros táplálékkal etetett elhízott patkányokban. A fogyás mechanizmusainak további tisztázásához azonban in vitro és molekuláris vizsgálatokra van szükség. Az akut toxicitási eredmények azt mutatták, hogy a CTS-MP és a CTS-NP rendkívül biztonságos, és a WSC-MP és a WSC-NP csak enyhe toxicitási hatást fejt ki. Ezen eredmények alapján nyilvánvaló, hogy a CTS és a WSC MP-k és NP-k jobbak, mint a közös CTS-ek, és felhasználhatók potenciális elhízás elleni szerként.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a projektet pénzügyileg támogatta a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (81173107. szám), a kínai Guangdong tartomány tudományos és technológiai tervezési projektje (2010B090400467 szám), a kínai Zhongshan tudományos és technológiai tervezési projektje (2009H017 szám) és a kínai Guangzhou tudományos és technológiai tervezési projektje (11A52130094 szám).