A Lactobacillus salivarius 1077 (NRRL B-50053) izolálása és bakteriocinjának jellemzése, beleértve az antimikrobiális aktivitási spektrumot

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
Levelezés céljából: [email protected]

ABSZTRAKT

BEVEZETÉS

A bakteriocinok (BCN-k) kis molekulatömegű fehérjék, amelyeket bakteriális riboszómák termelnek, és antimikrobiális tulajdonságokkal rendelkeznek (2, 5, 8, 14, 15). Ezek a fehérjék elsősorban kationos, hidrofób vagy amfifil peptidek, molekulatömegük 5-6 kDa. Az érett bakteriocin antimikrobiális szerek 20-60 aminosavat tartalmaznak (14, 15). A bakteriocinokat sokféle mikroorganizmus termeli, amelyek különféle szisztematikus csoportokba tartoznak és különféle ökológiai fülkéket foglalnak el. Egy széles körben elfogadott osztályozás (8) szerint a IIa alosztály pediocin-szerű anti-Listeria peptideket tartalmaz, amelyek konzervált Y-terminális YGNGV-szekvenciával és egy vagy két ciszteinhíddal rendelkeznek.

Számos szempont különbözteti meg a bakteriocinokat az antibiotikumoktól (2). (i) A mikrobiális sejtekben a bakteriosztinok a riboszómák felszínén termelődnek, míg az antibiotikumok elsősorban a sejt másodlagos metabolitjai. (ii) Az antibiotikumok gyártóival ellentétben a bakteriocin-gyártók érzéketlenek a baktericid hatásokra. (iii) A bakteriocin molekulák a felszín bármely részén a célsejt falához kapcsolódhatnak, mivel a célsejt falán látszólag nem léteznek specifikus receptorok. (iv) A bakteriocin halálozási mechanizmusa sokoldalú, és összefügg a pórusképződés folyamatával a külső sejtmembránban. A bakteriocinok a fogékony mikrobák sejtfalaival kötődnek, ion egyensúlyhiányt okoznak és pórusokat generálnak. Szervetlen ionok szivárognak át a pórusokon, ezáltal megölik a célsejtet. Az antibiotikumok viszont gátolhatják a szubcelluláris folyamatok szintézisét (sejtfalszintézis, intracelluláris fehérjetermelés, valamint DNS és RNS replikáció). (v) A célsejt korlátozott rezisztencia a bakteriocinokkal szemben akkor alakul ki, amikor a cél megváltoztatja sejtmembránjának kémiai összetételét.

A bakteriocinoknak előnyei vannak az antibiotikumokkal szemben. (i) Nincs információ arra vonatkozóan, hogy a bakteriocinok mérgezőek lennének az állatokra vagy felhalmozódnának a szövetekben. A bakteriocinek érzékenyek a proteázokra, és a gazdaszervezetben lebomlanak. (ii) A bakteriocinek hatékonyak az antibiotikumokkal szemben rezisztens kórokozók ellen (24). (iii) A baktériumokat már a normál mikroflóra állati gazdasejtekben termeli, és valószínűleg fontos szerepet játszik a mikrobiális ökoszisztéma kinetikájában. (iv) A fogyasztók természetesen termesztett és feldolgozott ételekre vágynak. Az Európai Unió klórozott vízzel kezelt baromfi-importjának tilalma 1997 óta van érvényben, és korlátozza az Egyesült Államok baromfihúsának behozatalát, amelyet általában ez a folyamat kezel. A bakteriocinek alkalmazása alternatívát jelentene a jelenleg alkalmazott kémiai fertőtlenítési megközelítésekkel szemben.

Ez a cikk egy új, a Lactobacillus salivarius L-1077 (NRRL B-50053) által termelt L-1077 bakteriocin felfedezését, jellemzését és hatékonyságát ismerteti. Kimutattuk ennek a bakteriocinnak a terhes korú brojlercsirkéknek ivóvízben beadott terápiás szerek egyik lehetséges alkalmazását is a Campylobacter jejuni és a Salmonella hatékony kontrollja érdekében az élő állatokban.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Mikrobiológia. Egy orosz vágó-/feldolgozó üzemben egészséges kereskedelmi brojlercsirkék adakozóként szolgáltak vakbéltartalmat, amely antagonista flórát szolgáltatott. Ezeket az anyagokat tejsavbaktérium (de Man, Rogosa és Sharpe [MRS]; Difco) agarra csíkoltuk, és anaerob atmoszférában inkubáltuk egy éjszakán át 37 ° C-on. A Lactobacillus telepeket izoláltuk és azonosítottuk az API 50 CHL mikroteszt rendszerrel (bioMérieux, Franciaország). Az izolátumokat anaerob módon 37 ° C-on egy éjszakán át tenyésztettük az MRS-agarra való összefolyásig. A növekedést tartalmazó agar blokkokat (~ 0,5 cm 3) aszeptikusan levágtuk, és átadtuk a brucella-agarra, amelyet 5% -os lizált vérrel egészítettünk ki, amelyet C. jejuni NCTC 11168-mal oltottunk. Feljegyeztük a növekedés gátlásának zónáit, és megmérettük az átmérőket.

Bakteriocin L-1077 tisztítás. Az izolátum gátlási zónát produkált, és a Lactobacillus salivarius L-1077-et (NRRL B-50053) izoláltuk további vizsgálatok céljából. A korábban leírt módszerekkel (21., 25.) összhangban a BCN-t előállították és homogenitásig megtisztították. Az izolátumot egy éjszakán át 10% (térfogat/térfogat) brucella táptalajban fermentáltuk nyugalmi állapotú, 37 ° C-on tartott aerob körülmények között. Az elhasznált tenyészetet centrifugáltuk (10 000 x g, 10 perc) a sejtek eltávolítása céljából. A felülúszó pH-ját 1 N NaOH és 130 U/ml kataláz hozzáadásával 6,2-re állítottuk a szerves savak és a hidrogén-peroxid hatásának eltávolítása érdekében. A sejtmentes felülúszóban lévő fehérjéket ammónium-szulfáttal kicsapjuk, majd dializáljuk a korábban leírtak szerint (23). A nyers készítményt 0,22 μm-es szűrőn (Millipore, Bedford, MA) átszűrtük, és kationcserélő és hidrofób kölcsönhatású kromatográfiás elválasztással tovább tisztítottuk (23).

Biológiai vizsgálatok és kémiai elemzések. A kromatográfiás frakciók aktivitását kezdetben a C. jejuni NCTC 11168 szkríneléssel vizsgáltuk. További 32, nagyon sokféle, patogén baktérium izolátumot (lásd 2. táblázat) teszteltünk MIC-ekre (μg/ml). Meghatároztuk a frakciók fehérjekoncentrációit (11). A készítmények megkétszerezett hígítását hajtottuk végre, és mindegyik hígításból 10 μl-t foltoztunk vérrel kiegészített brucella-agar lemezekre, amelyeket előzőleg C. jejuni NCTC 11168 sejtjeivel vagy a további bakteriális izolátumokkal beoltottunk, amint azt korábban leírtuk (23). Valamennyi vizsgálatot két példányban végeztük.

A tisztított bakteriocin aminosav-szekvenciáját Edman-lebontással határoztuk meg 491 cLC automatikus szekvenszerrel (6) (Applied Biosystems). A bakteriocin molekulatömegét tömegspektrometriával (MS) határoztuk meg Voyager-DERP tömegspektrométer (Perkin-Elmer) alkalmazásával. A mátrix által támogatott lézeres deszorpciós ionizáció – repülési idő (MALDI-TOF) elemzést a gyártó utasításai szerint végeztük. Az elsődleges aminosav-szekvencia biokémiai meghatározása után a fizikai jellemzőket a DNAStar (Madison, WI) proteai függvényének felhasználásával elemeztük (13). Az elsődleges aminosav-szekvenciát bevittük a BLAST adatbázisba (1) hasonló szekvenciájú fehérjék keresése céljából.

Csirke kihívások. A tisztított bakteriocint csapvízzel hígítottuk, így a kísérleti madár ivóvizekben 25, 12,5 vagy 6,25 mg vagy egyáltalán nem kaptunk L-1077/liter bakteriocint. Kereskedelmi korú madarakat szereztünk, amelyeket C. jejuni már telepes körülmények között telepített. A 43 napos madarakat Salmonella enterica Enteritidis 92 Rif r szerovar ~ 0,2-10-10 CFU 0,2 ml-es szuszpenzióval fertőztük. A rifampin-rezisztens S. Enteritidis izolátumot szekvenciális passzálással hoztuk létre növekvő rifampinszintet tartalmazó táptalajon. Az S. Enteritidis 92 Rif r törzset egy éjszakán át tenyésztettük 100 μg/ml rifampint tartalmazó Endo táptalajban. A madarak ad libitum takarmányt és vizet kaptak. A három kezelt brojlercsoportot 3 napig ivóvízben az L-1077 bakteriocin/liter három szintjének egyikét biztosítottuk. A második terápiás vizsgálatban 40 napos brojlercsoportokat kereskedelmileg C. jejunival kolonizált és S. Enteritidis 92 Rif r-vel fertőzött csoportokat 1, 2 vagy 3 napon át 12,5 mg L-1077/liter bakteriocinnal kezeltünk. ivóvízükben.

Mikrobiológiai mintavétel. Meghatározott időpontokban (a kezelés 1., 2. vagy 3. napja után) a brojlercsoportokat leöltük és lemértük. Az egyes csoportokba tartozó összes madár átlagos tömegét és az elfogyasztott víz mennyiségét használtuk a brojlercsoporthoz juttatott bakteriocin teljes átlagos mennyiségének becsléséhez. A madarakat boncolgattuk, hogy aszeptikusan eltávolítsuk az állatok cecáját, máját és lépét. A lehűtött szöveteket közvetlenül a laboratóriumba visszajuttattuk, és tízszeres soros hígításoknak vetettük alá, majd a következő táptalajra és körülményekre helyeztük: (i) MRS agar 24 órán át 37 ° C-on anaerob módon, (ii) Campy-Cefex agar (19 ) 48 órán át 42 ° C-on mikroaerob módon, vagy (iii) Endo agart plusz 100 μg rifampin/ml-t 24 órán át 37 ° C-on aerob módon, a tejsavbaktériumok, a C. jejuni és az S. Enteritidis szintjének becsléséhez.

EREDMÉNYEK

Az L-1077 bakteriocin biokémiai tisztítása meghatározott eljárások alkalmazásával

A 32 vizsgált patogén baktérium MIC-értéke 0,09 és 1,5 μg/ml között mozgott (2. táblázat). Jelentős a széles genetikai panoráma e tesztelt fogékony izolátumok között. A vizsgált Gram-negatív izolátumok közül sok megközelítette az alacsonyabb MIC értékeket, amelyekről számoltak be, de a Gram-pozitív Listeria monocytogenes, Staphylococcus és Clostridium perfringens izolátumok szintén hasonló érzékenységet mutattak, mint a bakteriocin L-1077. A vizsgált izolátumok mindegyike következményes etiológiai szereket képvisel, amelyek különféle emberi betegségeket vagy kóros baromfi- és állatállomány-fertőzéseket okoznak (9, 17).

Az L-1077 bakteriocin antimikrobiális aktivitása szelektált kórokozókkal szemben, 10 μl-es spot vizsgálattal meghatározva

Az L-1077 bakteriocin terápiás értékét a C. jejuni és a Salmonella Enteritidis 92 Rif r fertőzött brojlerekben a 3. és 4. táblázat mutatja be. Az első kísérlet adatait a 3. táblázat mutatja be, és bemutatja a madarak 5,5 és 5 21,3 mg/madár 3 napig, mindkét szer drámai csökkentése érdekében. A brojlerek kb. 2 kg tömegűek voltak, amikor a mintákat vették. Ebben a kísérletben a nem kezelt kontrollmadarakat bélben kolonizálták C. jejuni 106 CFU/g fölött és S. Enteritidis 92 Rif r 108 CFU/g vakbéltartalmat meghaladó mértékben. Ezeknek a madaraknak a máját és a lépét is parenhimális szerveket kolonizálták S. Enteritidis 92 Rif r-vel ≥108 CFU/g koncentrációban. A tejsavbaktériumok ≥10 8,5 CFU/g vakbéltartalomban voltak jelen. A 21 mg bakteriocint tartalmazó madárcsoportban a C. jejuni-t egyetlen kísérleti brojlercsoport cececájában sem sikerült kimutatni. Hasonlóképpen, az S. Enteritidis 92 Rif r jelenléte és szintje ezeknek a kezelt madaraknak a cecában, a májában és a lépében drámaian csökkent, összehasonlítva a pozitív kontrollcsoportú brojlerekével.

3 napos, különböző koncentrációjú BCN L-1077 kezelések terápiás hatása a Campylobacter jejuni és a Salmonella Enteritidis 92 Rif r vegyes fertőzése ellen 43 napos brojlerekben a

1-3 napos BCN L-1077 (12,5 mg/liter) kezelés terápiás hatásai a Campylobacter jejuni és a Salmonella Enteritidis 92 Rif r vegyes fertőzése ellen 40–42 napos brojlereknél

Az utolsó kísérletben a kereskedelmi forgalomban lévő, már C. jejunival gyarmatosított madarakat is kiváltották és S. Enteritidis 92 Rif r. A brojlercsoportokat 12,5 mg L-1077 bakteriocinnal/liter ivóvízzel kezelték egy 3 napos vizsgálati időszak alatt (4. táblázat). A kezelés 3 napja alatt mindegyik csoportban 4 c log10 csökkenést figyeltünk meg a cecalis tartalomon belül. A Salmonella Enteritidis hasonló módon> 4 log10 értékkel csökkent a cecában 1 napos kezelés után, és további két napos bakteriocin-kezeléssel szinte nem észlelhető szintre csökkent. Három-4 log10 S. Enteritidis-csökkenést figyeltek meg mind a máj-, mind a lépmintában, csak 1 napos bakteriocin-kezelés után, és további redukciók következtek be a kezelés minden további napján, 3 napos kezelés után megközelítve a nem kimutatható szintet. Végül a tejsavbaktériumok száma a kezelt madarak cecekájában megközelítőleg megegyezett a kontrollcsoportban megfigyeltekkel, vagy akár megnövekedett a szövetben ezen általános baktériumcsoport sejtsűrűsége.

VITA

Feltétlenül ki kell dolgozni új, innovatív megközelítéseket az élelmiszer-eredetű bakteriális betegségeket okozó szerek visszaszorítására az összes baktériumcsoport körében az antibiotikum-rezisztencia széles körben megfigyelt növekedésével (7, 12). Következésképpen kutatásunk új antimikrobiális szerek felkutatására összpontosított, különös tekintettel a bakteriocinokra, az antimikrobiális peptidekre, amelyeket általánosan elismert (GRAS) baktérium entitások állítottak elő (10, 21, 23). Ezeket a bakteriocinokat fel lehet használni a baromfi baktériumok kórokozóinak elleni védekezésre, és potenciálisan pozitív élettani hatásuk lehet a madárbél morfológiájára (3). Az L-1077 bakteriocin a IIa osztályú pediocin-szerű antimikrobiális peptidek közé sorolható, amely tartalmazza az YGNGV motívum aminosav-szekvenciát, de hiányzik belőlük az XCXXXXVVV szekvenciák, amelyekben nincsenek C és V áramlási maradékok. Következésképpen az L-1077 tartalmazza a hidrofil, kationos N-terminális „pediocin doboz” régiót, amely feltételezések szerint a molekula sejtfal-kötő része (4). Bár az L-1077 rendelkezik YGNGV motívummal és hasonló felépítésű, mint a többi II. Osztályú bakteriociné, a BLAST analízis nem ismerte el, hogy hasonló lenne az adatbázis többi peptidjéhez. Következésképpen ez egy újabb új peptid.

Leírjuk egy C. jejuni antagonista, az L. salivarius L-1077 izolátum izolálását, amely L-1077 bakteriocint termelt. A bakteriocint megtisztítottuk, és 37 aminosav hosszúságú antimikrobiális polipeptidként jellemeztük, 3445-Da molekulatömeggel. Az L-1077 bakteriocin izoelektromos pontja pI 9,1 volt, az YGNGV nitrogén-terminális aminosav-szekvenciája pedig a IIa osztályú bakteriocin hozzárendelésre utal. Az L-1077 bakteriocin MIC-értékei 33 gram-negatív és Gram-pozitív baktérium izolátummal szemben 0,09 és 1,5 μg/ml között mozogtak. Az L-1077 bakteriocin terápiás hasznát a piaci életkorú brojlercsirkékben igazolták, amelyeket mind a C. jejuni, mind a Salmonella Enteritidis baktériumokkal telepítettek. A kezeletlen kontrollmadarakhoz képest mind a C. jejuni, mind az S. Enteritidis száma a kolonizált ceca-ban> 4 log-kal csökkent, a S. Enteritidis-szám a kezelt madarak májában és lépében egyaránt 6-8 log/g-rel csökkent. a kezeletlen kontrollmadarakban lévők. Úgy tűnik, hogy az L-1077 bakteriocin ígéretet tesz a C. jejuni/S elleni védekezésre. Enteritidis brojlercsirkékben.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezt a munkát az Egyesült Államok Külügyminisztériuma, az Orosz Föderáció Állami Alkalmazott Mikrobiológiai Kutatóközpontja (SRCAM), az Egyesült Államok Mezőgazdasági-Agrárkutatási Szolgálatának (USDA-ARS) CRIS projektje támogatta. Bakteriális kórokozók csirkéknél 6612-32000-046-00, valamint a Nemzetközi Tudományos és Technológiai Központ (ISTC) 1720-as projekt.

E kísérletek elvégzését az Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság engedélyezte (PMS-03-03, „Campylobacter elleni védekezés a baromfitermelésben”).