A lila tea és kivonata elnyomja az étrend okozta zsír felhalmozódást egerekben és emberi alanyokban a zsír felszívódásának gátlásával és a máj karnitin-palmitoil-transzferáz expressziójának fokozásával.

Hiroshi Shimoda

Shoketsu Hitoe

Seikou Nakamura

2 Kiotói Gyógyszerészeti Egyetem, 1 Shichono-cho, Misasagi, Yamashina-ku, Kiotó 607-8412, Japán

Hisashi Matsuda

2 Kiotói Gyógyszerészeti Egyetem, 1 Shichono-cho, Misasagi, Yamashina-ku, Kiotó 607-8412, Japán

Absztrakt

BEVEZETÉS

Az elhízás gyakorisága továbbra is növekszik, és az Egyesült Államokban és a latin-amerikai országokban jelentős egészségügyi probléma (1, 2). Számos, különféle összetevőket tartalmazó súlycsökkentő kiegészítést használtak ezekben az országokban (3). A zöld teát (a Camellia sinensis levelei) és a zöld tea készítményeket évek óta forgalmazzák és fogyasztják a fogyás és a súly kezelésének kiegészítéseként. A klinikai bizonyítékok áttekintése azonban pozitív hatásokat (4, 5) és semmilyen hatást (6, 7) jelentett a fogyásról.

A zöld tea potenciális súlycsökkentő összetevőjének hatásmechanizmusai a katechinek és a koffein kombinációját tartalmazzák. A katechinek feljavítják a máj lipidmetabolizáló enzimjeit, beleértve a karnitin-palmitoil-transzferázt (CPT) 1 a zsír oxidációjának stimulálása érdekében (8). Gátolják a katekol-O-metiltranszferáz (COMT) aktivitását és növelik a noradrenalin és az adenil-cikláz szintjét. Következésképpen a glükózfelvétel csökken és a lipolízis fokozódik. Másrészt a koffein stimulálja a szimpatikus idegrendszert, a hormonérzékeny lipázt és a szétkapcsolódó fehérjék (UCP-k) fel-szabályozását, ami energiafelhasználáshoz és zsír oxidációhoz vezet (8). Az Oolong tea, a mélyen erjesztett zöld tea szintén elhízásellenes hatásokkal rendelkezik (9), mivel az in vitro vizsgálatok azt sugallják, hogy a polimerizált katechin-származékok gátolják a bél lipáz aktivitását és csökkentik a bélből történő zsírfelszívódást (10, 11).

A lila tea a Camellia sinensis változata, amelyet a Kenyai Teakutatási Alapítvány (TRFK) fejlesztett ki, és amelyet jelenleg Kenyában termesztenek (12). A lila tea leveleket ugyanazzal a módszerrel dolgozzák fel, amelyet a zöld tea feldolgozásához használnak. A zöld teában található szokásos polifenolos vegyületek, például az epigallocatechin-gallát (EGCG) és az epikatechin-gallát (EKG) mellett a lila tea egyedülálló, mivel tartalmaz antocianidineket (malvidin, peralgonodin és cianidin-3-O-galaktozid) és 1, 2-di-O-galloil-4,6-O- (S) -hexahidroxidifenoil-P-D-glükóz (GHG), hidrolizálható tannin (12). A lila tea koffeintartalmában különbözik a Camellia sinensis más fajtáitól is, amely viszonylag alacsonyabb a zöld és fekete teához képest (13, 14). Ezért a lila tea HPLC-kromatogramja eltér a zöld teától és a fekete teától (1. ábra. 1. ábra). A lila tea jelentett biológiai aktivitásai között szerepelnek anti-tripanoszóma (15) és agyi antioxidáns (16) aktivitások. Az elhízás elleni hatásokat azonban még értékelni kell. Ezért elkészítettük a lila tea kivonatot (PTE), és értékeltük az étrend okozta zsír felhalmozódásra gyakorolt hatást egerekben. Ezenkívül megvizsgálták az elhízás elleni mechanizmust és az aktív vegyületeket. Ezenkívül egy kis léptékű klinikai vizsgálatot végeztek enyhén elhízott emberekkel.

HPLC kromatogram, 50% tealeveles etanolos kivonat. A lila teát (A), a japán zöld teát (B) és az indiai fekete teát (C) 2 órán át 50% etanollal extraháltuk 40 ° C-on, és az oldószereket bepároltuk. A HPLC kromatogramot 280 nm-en UV detektorral rögzítettük. A HPLC állapotát az anyagok és módszerek ismertették. TB, teobromin; CA, koffein; EGCG, epigallocatecin-gallát; ÜHG, 1,2-di-O-galloil-4,6-O- (S) -hexahidroxi-difenilil-P-D-glükóz; EKG, epikatechin-gallát.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

PTE előállítása és az alkotóelemek izolálása PTE-ben

A biológiai vizsgálathoz PTE-t készítettünk a lila tea szárított leveleiből (Camellia sinensis, TRFK306), amelyet 2012-ben tenyésztettek az Mt. Kenya, beleértve Thika és Kerugoya területeket. A szárított leveleket (1 kg) 10 tömeg% -os 50 tömeg% -os vizes etanollal extraháltuk 2 órán át 40 ° C-on. Az oldószert lepároljuk, így 338 g PTE-t kapunk. A PTE fő alkotóelemei a teobromin (1,6%), a koffein (4,4%), az EGCG (9,8%), az ÜHG (7,4%) és az EKG (5,8%) voltak.

Ezeknek az alkotórészeknek az elkülönítésére 100 g PTE-t feloldottunk 1 liter vízben, és háromszor extraháltunk 2 liter AcOEt-vel, így 35,7 g AcOEt-frakciót kaptunk. Ezután a H2O réteget n-BuOH-val (1,5 I) extraháltuk, így 32,4 g BuOH-frakciót kaptunk. 25 g BuOH-frakciót ODS-oszlop (375 g) választott el 30–100% MeOH-val. A 15% -os, 30% metanollal extrahált frakciót a DiaionTM HP21 oszlopra (150 g, Mitsubishi Chemical, Tokió, Japán) töltöttük és 10% metanollal mostuk. Ezután 30% MeOH-ot töltöttünk be, így 30% MeOH-frakciót kaptunk (8,2 g). A 30% MeOH-frakciót (4,3 g) HPLC-vel elválasztottuk ODS-oszloppal (Chromatorex ODS, ~ 20 × 250 mm, Fuji Silysia Chemical Ltd., Kasugai, Japán), 30% MeOH alkalmazásával az 1-7 frakcióhoz. RI) detektort alkalmaztunk a detektáláshoz. A 2. frakciót HPLC oszlopon tisztítottuk (Develosil TM ODS-SR-5, ~ 20x250 mm, Nomura Chemical Co. Ltd., Seto, Japán), 40% MeOH felhasználásával koffeint (117 mg) kaptunk. A 3. és 4. frakciót összekevertük és HPLC-oszlopon (Develosil TM ODS-SR-5) tisztítottuk, 40% MeOH alkalmazásával, teobromin (100 mg) előállításához. A 6. frakciót HPLC oszlopon (Develosil TM ODS-SR-5) tisztítottuk 40% MeOH alkalmazásával, így 174 mg GHG-t és 45 mg EKG-t kaptunk. Az izolált vegyületeket, beleértve az ÜHG-t (12), 13 C- és 1H-NMR-spektrum és tömegspektrum összehasonlításával azonosítottuk.

A PTE fő alkotórészeinek HPLC meghatározása

A PTE fő alkotóelemeinek szezonális változásainak értékeléséhez a 2013 januárjától szeptemberig szüretelt leveleket használtuk a korábban leírt területeken. A levelekből előállított PTE-t HPLC-vel a következő körülmények között elemeztük: TSKGEL ODS-80TS QA (~ 4,6 mm × 150 mm, Tosoh, Tokió, Japán) és UV detektor 280 nm); az áramlási sebességet 0,7 ml/perc sebességgel rögzítettük, az A és B oldószerekhez 5% acetonitrilt, 0,1% trifluor-ecetsavat (TFA) és acetonitrilt alkalmaztunk. Az oszlop hőmérsékletét 35 ° C-ra állítottuk be. A gradiens körülmények 0–4 perc (A oldószer: 100%), 4–4,5 perc (A oldószer: 100–95%), 4,5–27 perc (A oldószer: 95–90%), 27–47 perc (A oldószer): 90-50%), 47-48 perc (A oldószer: 50-15%), 48-50 perc (A oldószer: 15%).

Állatok és sejtek

A kísérleteket az Állatkísérletek megfelelő lebonyolításának irányelveivel összhangban hajtották végre (Japán Különtanács, 2006. június 1.). Az 5 és 10 hetes hím ICR egereket a Japan SLC Co. Ltd.-től (Hamamatsu, Japán) vásároltuk, és előzetesen egy hétig akklimatizáltuk párásított helyiségben (50 ± 5%) 22 ± 2 ° C-on.

A HepG2 hepatomát a JCRB sejtbankból (Sennan, Japán) szereztük be.

Reagensek

Triglicerid E teszt A Wako-t, a klofibrátot, a sovány tejet, az olívaolajat, a Dulbecco által módosított Eagle táptalajt (D-MEM) és a magzati borjúszérumot (FCS) a Wako Pure Chemical Industries Ltd.-től (Osaka, Japán) vásároltuk. A Laemmli mintapuffert és a polivinilidén-fluorid (PVDF) membránt a Bio-Rad Laboratories Inc.-től (Collage Station, AZ, USA) szereztük be. A RIPA lízis és extrakciós puffert, proteáz és foszfatáz inhibitor koktélt és Pierce Western Blotting Substrate Plus-t a Thermo Fischer Scientific Inc.-től (Waltham, MA, USA) vásároltuk. Az egér anti-CPT1A antitestét Abcam-től (Cambridge, Egyesült Királyság) szereztük be. A retek-peroxidázzal (HRP) konjugált kecske anti-egér IgG-t a Merck Millipore-tól (Darmstadt, Németország) vásároltuk. Az anti-p-aktin monoklonális antitesteket Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) szereztük be. Az orlisztátot (Xenical) az F. Hoffmann-La Roche, Ltd.-től (Bázel, Svájc) szereztük be.

A magas zsírtartalmú étrend okozta testsúly és lipidparaméter-változások az egerekben

Szérum triglicerid változások az olívaolajjal töltött egerekben

A kísérlet az előző jelentésünkben leírt módszert követte (18). A 6 hetes egereket 12 órán keresztül éheztettük, és vérmintákat vettünk orbitális orrmelléküregből altatásban üvegkapilláris segítségével. Harminc perccel később a PTE-t vagy annak alkotóelemeit orálisan adták az egereknek. Ezután 1 óra múlva orálisan olívaolajat (5 ml/kg) töltöttünk be, és 2, 4 és 6 órával később vérmintákat vettünk. A vérmintákat centrifugáltuk (3000 fordulat/perc, 5 perc), hogy szérumot kapjunk. A triglicerid tartalmat a Wako triglicerid E teszttel mértük.

CPT1A fehérje expresszió HepG2 májhepatómában

500 μl 10% FCS-t tartalmazó D-MEM-ben szuszpendált HepG2 sejteket (4x10 4 sejt) 24 lyukú tenyésztőlemezre oltottunk és 37 ° C-on 5% CO2-atmoszférában egy napig inkubáltuk. A PTE vagy alkotórészeinek oldatát hozzáadtuk a sejtekhez, és még egy napig tenyésztettük. A sejteket 200 μl RIPA extrakciós és izoláló pufferrel gyűjtöttük, amely proteázt és foszfatáz inhibitor koktélt tartalmaz. A CPT1A és a β-aktin expresszióját a korábban leírt eljárással határoztuk meg.

Az elhízási paraméterek változásának értékelése az emberi alanyokban lila tea lenyelésével

A kísérletet a 2008. évi Helsinki Nyilatkozat 6. felülvizsgálatának megfelelően végeztük. Tesztalanyként 10 32–69 éves férfit (átlagéletkor: 47,1 éves) választottak enyhe elhízással (BMI> 24). A kizárási kritériumok magukban foglalták: a lila tea napi bevitele; allergiás reakciók; és súlyos rendellenességek, például cukorbetegség, májbetegségek, vesebetegségek vagy szív- és érrendszeri betegségek. A teszt megkezdése előtt írásos IRB által jóváhagyott magyarázatot és megállapodást kaptak a tesztalanyok. A teszt alapos magyarázatát egy kérdések és válaszok követték, és megerősítették, hogy alaposan megértették a teszt részleteit. A tesztalanyok ezt követően írásbeli beleegyezésüket adták be.

A tesztidőszak első napján vérmintákat vettünk éhgyomri tesztalanyoktól. Mértük a BMI-t, a testsúlyt, a testzsírtömeget, a hasi zsírt, az izommennyiséget, a testzsírarányt, az izomarányt, az alapanyagcserét, a nedvességet, a derekat, a csípőt, a derék: csípő arányt, a hasi bőr alatti zsírvastagságot, a jobb felkar alatti bőr alatti zsírvastagságot. A mérés után szárított lila tea leveleket (1,5 g/adag) adtak minden alanynak. Az alanyok a lila tearészből kivont teát forró vízzel (100-200 ml) naponta kétszer, 4 héten keresztül fogyasztották. A tesztidőszak utolsó napján ismét elvégezték az elhízás paramétereinek mérését, hogy összehasonlítsák azokat a bevétel előtti értékekkel.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± standard hiba (SE) formájában mutatjuk be. A sejtkísérlet statisztikai összehasonlításához egyirányú varianciaanalízist (ANOVA), majd Dunnett-tesztet hajtottak végre. Páros t-tesztet alkalmaztak humán vizsgálatokhoz. P értéke (2. ábra). 2). A koffein és a teobromin tartalom tartománya 2,7–3,4%, illetve 1,2–2,1% volt. A polifenolos vegyületek közül az EKG-tartalom viszonylag stabil volt, 3,0-3,9% között mozgott. Az EGCG-tartalom februártól áprilisig csökkent, majd júniusban növekedett. Az EGCG maximális tartalma szeptemberben elérte a 9,6% -ot. Az ÜHG-tartalom 6,2 és 8,4% között változott.

A katechinek, az üvegházhatást okozó gáz és a koffein szezonális változásai a PTE-ben.

A PTE hatása a magas zsírtartalmú étrend okozta zsírfelhalmozódásra egerekben

A kontrollcsoport testtömege a 7. és 12. nap között meghaladta a normál csoport súlyát (3. ábra. 3. ábra). A PTE (200 mg/kg) elnyomta a testtömeg-növekedést a 6. és 12. napon a kontroll csoporthoz képest. A PTE csoportban a testtömeg szignifikánsan elnyomott, az átlagos testtömeg megegyezett a normál testtömeggel (1. táblázat). A máj, az epididymális zsír és a perirenalis zsír súlyát szintén jelentősen elnyomta a PTE. A triglicerid tartalmat tekintve a szérum TG és a máj TG is elnyomódott PTE-vel.

A PTE hatása a CPT1A fehérje expressziójára egerekben táplált HFD-ben. Minden oszlop az átlagot jelenti a S.E. (n = 6). A csillagok szignifikáns különbségeket jelölnek a ** kontrollnál: p (5. ábra). 5.) A pozitív kontrollként alkalmazott orlisztát (10 és 20 mg/kg) szintén jelentősen elnyomta a TG emelkedést. A PTE alkotóelemei közül a polifenolos vegyületek, köztük a GHG, az EGCG és az EKG, nem csökkentették a TG emelkedését. Noha a teobromin nem gátolta a TG emelkedést, a koffein (25 és 50 mg/kg) szignifikánsan elnyomta az emelkedést az olívaolaj bevitele után 2 órával.

A PTE és alkotóelemeinek hatása a szérum TG emelkedésére olívaolajjal töltött egerekben. Minden pont az átlagot jelenti az S.E. (n = 6). A csillagok szignifikáns különbségeket jelölnek a * p ** p-nál mért kontrolltól (6. ábra). 6). A növekedés 100 μg/ml-nél szignifikáns volt (p * p 2. táblázat, 2. táblázat, négy hét lila tea, BMI, testtömeg, testzsír-tömeg, hasi zsír, testzsírarány, derékméret, csípőméret és a hasi és a jobb felkar zsírvastagsága jelentősen csökkent a bevétel előtti értékekhez képest. Az izomarány jelentősen megnőtt a lila tea bevétele után. Bár a vérparaméterekben nem történt jelentős változás, a HDL-koleszterin és a HbA1c szint általában alacsonyabb volt, mint a lenyelés előtt (táblázat (3. táblázat 3).

2. táblázat

Az elhízás paramétereinek összehasonlítása a lila tea négyhetes bevétele előtt és után

Lenyelés előttLenyelés után

BMI (kg/m 2)	27,0 ± 0,6	26,8 ± 0,6 a
Testtömeg (kg)	80,8 ± 3,2	79,9 ± 3,1 a
Testzsírtömeg (kg)	21,8 ± 1,5	21,0 ± 1,4 b
Hasi zsír (választott bírósági egység)	135,0 ± 8,5	123,5 ± 8,5 b
Izom mennyisége (%)	24,9 ± 1,0	25,0 ± 1,0
Testzsír arány (%)	26,8 ± 1,2	26,1 ± 1,2 a
Izomarány (%)	30,9 ± 0,5	31,4 ± 0,5 b
Alap metabolizmus (kcal)	1789 ± 73	1768 ± 70 a
Nedvesség (%)	43,2 ± 1,6	39,4 ± 4,3
derék (cm)	97,6 ± 1,6	94,2 ± 1,7 b
Csípő (cm)	106,0 ± 1,5	102,8 ± 1,6 a
Derék/csípő arány	0,92 ± 0,01	0,92 ± 0,01
A hasi szubkután zsírvastagság (mm)	28,5 ± 1,4	24,4 ± 1,8 a
Jobb felkar szubkután zsírvastagsága (mm)	28,5 ± 2,6	21,5 ± 1,6 b

Az értékeket átlagértékben és standard hibában (n = 10) jelölik. A szignifikancia értékeléséhez párosított t-tesztet használtunk. Jelentős különbségeket jelezünk

Az értékeket átlagértékben és standard hibában (n = 9) jelölik. A szignifikancia értékeléséhez a párosított t-tesztet használtuk. Jelentőséget nem figyeltek meg.

VITA

A bélzsír felszívódását tekintve a koffein hozzájárult a PTE gátló hatásához. Korábban megerősítettük, hogy a koffein hozzájárul a zöld kávébab kivonat gátló hatásához a zsír felszívódására (18), valószínűleg azért, mert a koffein késlelteti a gyomor ürítését (26). Továbbá Wang és munkatársai korábbi kutatásainak eredményei. jelezte, hogy a koffein jelentősen csökkenti a mesentericus nyirok áramlási sebességét, amely utat a felszívódó zsírsavak a véráramba vezetik. Az EGCG nem volt hatással a nyirok áramlására, ami azt sugallja, hogy az EGCG és a koffein lipidfelszívódásra gyakorolt hatása egyértelműen különböző mechanizmusokon keresztül zajlik, és a lipidek típusától függően változik (27). Úgy gondolják, hogy a koffein hatása hozzájárul a PTE zsír felszívódására gyakorolt hatásának csökkentéséhez.

Korábbi klinikai vizsgálatokban a koffein és a katechinek egyaránt beszámoltak arról, hogy hozzájárulnak a zöld tea testtömeg-növekedésre gyakorolt elnyomó hatásához (5). A zöld tea katekinek elhízásellenes hatása enyhe, és önmagukban történő alkalmazásuk esetén nagyobb dózisra (800–1200 mg/nap) van szükség (28, 29). Valójában arról számoltak be, hogy az EGCG (300 vagy 1500 mg/nap) nincs hatással az elhízott személyek zsírfelhalmozódására (30, 31). Körülbelül 400 mg/nap zöld tea kivonat, amely katechineket és koffeint tartalmaz kombinációban, szükségesnek tűnik az elhízás elleni hatás eléréséhez (32, 33). Vizsgálatunkban 3 g/nap lila tealevél lenyelése négy hét alatt javította az elhízott paramétereket. A levelek teljes mennyisége (3,0 g/nap) körülbelül 600 mg PTE-t eredményezett, 20% -os extrakciós hozamot. Tehát ebben az adagolásban ésszerű azt sugallni, hogy a fő összetevők (koffein és katechinek) biztosítják az elhízás elleni hatást. Ezenkívül az üvegházhatásúgáz, amely egyedülállóan található meg a lila tealevelekben, körülbelül azonos koncentrációban, mint az EGCG, szintén hozzájárulhat az elhízás elleni hatáshoz.

Összefoglalva, eredményeink azt mutatják, hogy a lila tea levelek és kivonata elhízás elleni hatást fejtenek ki egerekben és emberekben, és a hatásmechanizmusok három vegyületet alkalmaznak. A koffein elnyomja a zsír felszívódását, míg a koffein és a katechinek kombinációja fokozott elhízás elleni hatást eredményez. Végül az üvegházhatású gáz részt vehet a lila tea máj lipidmetabolizáló hatásában a CPT1A expresszió fokozásával.