Az α-liponsav megakadályozza a cukorbetegség által kiváltott ateroszklerózis növekedését az apolipoprotein E – Hiányos egerekben, amelyek magas zsírtartalmú/alacsony koleszterinszintű étrendet fogyasztanak

Absztrakt

Az α-liponsav kofaktorként működik a multienzim-komplexekben, beleértve a piruvát-dehidrogenázt, az α-ketogutarát-dehidrogenázt és az elágazó láncú a-keto-sav-dehidrogenázt (11). Az α-liponsav és redukált formája, a dihidrolipoát, erős antioxidánsok. Amfifilek, a sejtmembránban és a citoszolban egyaránt elterjedtek, és könnyen átjutnak a vér-agy gáton. Kelátképzik az átmenetifémeket, és számos enzimmel regenerálhatók, beleértve a lipoamid-reduktázt, a glutation-reduktázt és a tioredoxin-reduktázt. Ezenkívül az α-liponsav/dihidrolipoát más antioxidánsokat is visszaforgat, például glutationt, C-vitamint, E-vitamint és Q10 koenzimet (12). Az α-liponsavat Németországban több mint 30 éve alkalmazzák diabéteszes neuropathiában szenvedő betegeknél, és egy nemrégiben készült metaanalízis kimutatta, hogy a napi 600 mg α-liponsavval 3 héten át tartó kezelés biztonságos és klinikailag jelentősen csökkenti a neuropátiás hiányokat. fokú tüneti polineuropátiában szenvedő cukorbetegeknél (13,14). Az α-liponsav kezelés hatásait az oxidatív stressz jelentős csökkenését eredményező dózisokban azonban nem igazolták egyértelműen diabéteszes szív- és érrendszeri betegségek esetén.

A mostani tanulmány az étrendi α-liponsav kiegészítésnek az érelmeszesedésre gyakorolt hatását vizsgálta, amelyet köztudottan a streptozotocin (STZ) által kiváltott cukorbetegség fokoz az apolipoprotein (apo) E-hiányos egerekben (15). Itt bemutatjuk, hogy az étrendi α-liponsav, amelyet a cukorbetegség STZ-kezeléssel történő indukciója után indítottak el, az oxidatív stressz biomarkereinek jelentős változásához vezet, és teljes mértékben megakadályozza a diabéteszes apoE -/- egereknél tapasztalt felgyorsult érelmeszesedést, amelyek nem kapták meg a kiegészítést.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

Az egérkísérleteket az intézményi állatgondozási és -használati bizottság által jóváhagyott protokollok szerint hajtották végre. A C57BL/6J genetikai háttérrel rendelkező 12 hetes apoE -/- hím egereket STZ (Sigma, St. Louis, MO) intraperitoneális injekcióival 40 mg/testtömeg-kg 0,1 mol/l citrátpufferben ( pH 4,5) 5 egymást követő napon át. Egy kontrollcsoport csak puffert kapott. Azokat az egereket, akiknél a vércukorszint> 300 mg/dl volt az első STZ beadás után 4 héttel, cukorbetegeknek tekintették, és ebben a vizsgálatban használták őket. Az STZ által beadott és a kontroll apoE -/- egereket az STZ beadásának megkezdése után 4 hétig tartották rendszeres chow-n, amikor félszintetikus étrendre váltottak, amelyben magas a zsírtartalom (23 tömeg%), de alacsony a koleszterinszint (0,05%). tömeg/tömeg), 1,65 g/kg α-liponsavval vagy anélkül (D03120501, D03120502; Research Diets, New Brunswick, NJ). A magas zsírtartalmú étrend (45% zsír, 35% szénhidrát és 20% szacharóz) kalóriaforrása hasonló az emberek által a nyugati társadalmakban fogyasztott étrendekhez. Az egerek ad libitum hozzáférést kaptak az étrendhez és a vízhez, és szorosan figyelemmel kísérték egészségüket. Az állatokat elemzés céljából leöltük az STZ beadásának megkezdése után 20 héttel.

Biokémiai elemzés.

Az egereket 4 órán át éheztettük, és a vér-orbitális sinusból vérmintákat vettünk az STZ injekciók előtt, majd ezt követően 4 hetente. A glükóz, az összes koleszterin és a trigliceridek plazmaszintjét kereskedelemben kapható készletekkel (Wako, Richmond, VA) mértük. A plazma lipoprotein profilokat gyors fehérje folyadékkromatográfiával határoztuk meg (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). A lipoproteineket az összesített plazmából ultracentrifugálással izoláltuk (16).

A plazma lipid-peroxid-tartalmat tiobarbitursav-reaktív anyag (TBARS) teszttel határoztuk meg (17). Az eritrocita glutationt egy tesztkészlettel (Calbiochem, San Diego, CA) mértük. A szérum paraoxonáz aktivitást spektrofotometriásan határoztuk meg 270 nm-en, fenil-acetáttal szubsztrátként (18).

Az egereket egyenként metabolikus ketrecbe helyeztük havonta 3 egymást követő napon az STZ beadásának megkezdése után. A víz és az élelmiszer-fogyasztást, a vizeletmennyiséget és a testtömeget 24 órán keresztül figyeltük. A vizelet 8-izoprostán szintjét enzim immunszorbens vizsgálati készlet segítségével határoztuk meg (Cayman, Ann Arbor, MI).

Ateroszklerotikus elváltozás elemzése.

Az ateroszklerotikus elváltozások elemzése laboratóriumunkban a standard protokollt követte (16). A proximális aorta fagyasztott szakaszait Szudán IV-vel festettük, és hematoxilinnel ellenfestettük. Az érelmeszesedéses elváltozások területeit a National Institutes of Health 1.59 Imaging Software (19) segítségével mértük. A négy anatómiailag meghatározott helyzetből álló szakaszok lézióterületeinek átlagát vettük az egyes állatok elváltozásának nagyságaként.

Immunhisztokémia.

Immunfestést végeztünk a hasnyálmirigyen standard avidin/biotin komplex módszer alkalmazásával tengerimalac poliklonális antiinzulinnal (1: 1 000 hígítás; Dako, Carpinteria, CA) és biotinilezett tengerimalac antiimmunglobinnal (1: 400 hígítás; Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornia) (20). A negatív kontrollhoz az elsődleges antitestet nemimmun szérummal helyettesítettük. Minden kísérleti csoportból öt egérből egérenként legalább 10 szigetet elemeztek a National Institutes of Health ImageJ 1.34 szoftver segítségével (elérhető online a http://rsb.info.nih.gov/ij címen).

Statisztika.

Minden érték az átlag ± SE. A statisztikai elemzést JMP szoftverrel (SAS, Cary, NC) végeztük. A cukorbetegség és az α-liponsav hatásait, valamint kölcsönhatásukat kétirányú ANOVA alkalmazásával elemeztük, és a Tukey-Kramer őszintén szignifikáns különbséget alkalmaztuk többszörös összehasonlításhoz. A cukorbetegség időtartamának hatásait többszörös ANOVA-val értékeltük minden egér ismételt mérésével.

EREDMÉNYEK

Az STZ cukorbetegséget indukált apoE -/- egerekben.

Az STZ beadásának megkezdése után 3 hónappal az a-liponsavat nem kapó diabéteszes egerek közül sokan a betegség jeleit mutatták, beleértve a letargiát is. A csoportba tartozó 29 egérből 3-ot idő előtt megöltek a vizsgálat vége előtt, amikor súlyos kiszáradás és jelentős testtömeg-csökkenés jeleit kezdték mutatni. Ezen egerek bruttó és szövettani vizsgálata nem mutatott gyulladást vagy nekrózist a máj- és a veseszövetekben, valamint semmilyen vaszkuláris rendellenességet, például trombi képződményeket. Ezzel szemben mind a 16 α-liponsavval táplált cukorbeteg állat egészségesnek tűnt a vizsgálati időszak alatt, és az STZ beadása után 20 héttel elérte a kísérlet befejezését.

A diabéteszes és nem cukorbeteg egerek kísérleti periódusának testtömeg-változását az 1A. Ábra szemlélteti. Bár a magas zsírtartalmú étrend jelentős súlygyarapodást okozott a nem cukorbeteg egerekben, az étrendi α-liponsav jelentősen lelassította ezt a növekedést, annak ellenére, hogy a csoport napi hasonló mennyiségű étrendet fogyasztott (4,8 ± 0,3 g α-liponsavval szemben, szemben 4,9 ± 0,4 α-liponsav nélkül). A kísérletek végén az a-liponsav nélküli kontrollállatok súlya 42,7 ± 1,0 g volt, szemben az α-liponsavat (P -/- egerek) kapók 40 ± 0,5 g-jával.

Plazma lipidek.

A magas zsírtartalmú étrendet alacsony koleszterinszinttel táplált egerek plazma koleszterinszintje magasabb volt (343 ± 9 mg/dl, n = 10), mint a normál chow-val etetett egereknél (317 ± 9, n = 10), de a különbség nem érte el a szignifikanciát (P = 0,07). Sem az STZ beadása, sem a hiperglikémia nem változtatta meg szignifikánsan az egerek plazma koleszterin- és trigliceridszintjét a-liponsavval vagy anélkül az STZ beadását követő első 4 hónapban (2A. És B. Ábra). Az STZ beadását követő 5 hónapban azonban az a-liponsav nélküli diabéteszes egerek plazma koleszterinszintje (685 ± 57 mg/dl) szignifikánsan magasabb volt (P 1000 mg/dl koleszterinszint emelkedett trigliceridszint kíséretében. diétás α-liponsavat (474 ± 10 mg/dl) megtartva ugyanaz maradt, mint a nem cukorbeteg egereknél A cukorbetegség a plazma trigliceridek kismértékű, de jelentős növekedését okozta (az α-liponsavat tartalmazó P -/- egerek nem különböztek a nem cukorbetegekétől) Ezzel szemben az a-liponsav nélküli diabéteszes egerekben ~ 60% -kal több koleszterin volt VLDL-ben, közepes sűrűségű lipoproteinben és LDL-ben, mint az a-liponsavat tartalmazó diabéteszes apoE -/- egerekben (1. ábra). Az a-liponsav nem volt hatással a HDL-koleszterin szintjére.

Ezek az adatok azt mutatják, hogy az elhúzódó kezeletlen cukorbetegség növeli a plazma koleszterin és lipoprotein maradék részecskéit az apoE -/- egerekben, és hogy az α-liponsav kiegészítés megakadályozza ezeket a változásokat.

Oxidatív stressz biomarkerek.

Az eritrocita glutation és a plazma TBARS szintje 2 hónapos apoE -/- egerekben rendszeres chow-n 28,3 ± 1,5, illetve 12,3 ± 0,6 mg/ml volt. A magas zsírtartalmú étrend táplálása ezeknek az egereknek ≥4 hétig nem változtatta meg szignifikánsan a szintet (28,3 ± 1,1 és 13,3 ± 0,6 mg/ml; n = 26). Amint az várható volt, a cukorbetegség fokozta az oxidatív stresszt, amit az alacsonyabb vörösvértest-glutation bizonyít cukorbeteg egerekben, mint a nem cukorbeteg kontrollokban az STZ beadása után 5 hónappal. Az étrendi α-liponsav mind a nem cukorbeteg, mind a cukorbeteg állatokban 33% -kal (P -/- egerek ~ 40% -kal növelte az eritrocita glutationt a nem cukorbeteg egerekhez képest (P -/- egerek és az étrendi α-liponsav kiegészítés ezt korlátozza) növekedés.

Ateroszklerotikus elváltozás kialakulása.

Ezután értékeltük, hogy az étrendi α-liponsav kiegészítés hogyan befolyásolja az ateroszklerotikus elváltozások kialakulását apoE -/- egerekben (4. ábra). A nem cukorbeteg egerekben az étkezési α-liponsav a plakkok méretének kismértékű, jelentéktelen csökkenését okozta (P = 0,22) (4. ábra). Az α-liponsav nélküli egerekben a cukorbetegség szignifikáns növekedést okozott (P -/- egerek. A cukorbetegség és az étrend hatása egyaránt szignifikáns volt (P -/- egerek által cukorbetegség).

A hasnyálmirigy β-sejtjeinek immunhisztokémiája.

Az antioxidáns vitaminok és a szív- és érrendszeri megbetegedések összekapcsolásának bizonyítékai még mindig nagy mértékben ellentmondásosak (22). A különféle antioxidánsok ateroszklerotikus egereken játszott szerepének vizsgálata szintén ellentmondásos eredményeket hozott. Néhány tanulmány kimutatta az antioxidánsok, például az E-vitamin (22,23) vagy a C- és E-vitaminok és a β-karotin kombinációjának gátló hatását (24). Ezzel szemben mások nem mutatták ki az E-vitamin önmagában (25) vagy a β-karotinnal (26) kombinált hatását. Bizonyos esetekben az antioxidánsoknak, például a probukolnak káros hatása volt, és megnövekedett a lepedék mérete (27). Jelenlegi adataink azt mutatják, hogy az étrendi α-liponsav kiegészítés jelentősen csökkenti az oxidatív stresszt, amint azt a plazma TBARS, az eritrocita glutation és a vizelet 8-izoprostánja mutatja, és úgy tűnik, hogy kicsi a védő hatása a nem cukorbeteg apoE -/- egerek aterogenezisére. . Ezek a megfigyelések egybevágnak a korábbi jelentésekkel, miszerint az étkezési α-liponsav csökkenti a koleszterintartalmú táplált nyulak aorta szöveteinek koleszterintartalmát (28), és hogy az α-liponsav megelőző hatást gyakorol a koleszterin által kiváltott érelmeszesedésre a japán fürjben (29). Ezek az állatkísérletek eredményei azt sugallják, hogy indokolt lenne az α-liponsavnak az emberek érelmeszesedésére gyakorolt hatásának további vizsgálata.

Az STZ beadása után 5 hónappal egyes egereknél súlyos hiperlipidémia alakult ki. Azonban ezekben az egerekben az ateroszklerózis nem volt rosszabb, mint másokban, és ezeknek az állatoknak az elemzésekből való kiküszöbölése nem változtatta meg az általunk vizsgált paraméterek jelentőségét, beleértve az érelmeszesedést és az oxidatív stressz biomarkereit. Renard és mtsai. (20) a közelmúltban generált egy új típusú transzgenikus egér modellt az 1-es típusú cukorbetegségből, amelyet limfocita choriomeningitis vírusfertőzés indukálhat. Beszámoltak arról, hogy a cukorbetegség lipid-rendellenességek hiányában koleszterinmentes étrendben lipid-rendellenességek hiányában gyorsított elváltozást okozott, míg koleszterinben gazdag étrendet fogyasztó cukorbeteg egerekben az előrehaladott állapotú elváltozások nagyban függtek a cukorbetegség okozta diszlipidémia (20). Bár kísérleteink nemcsak modelljeikben, hanem étrendjükben is különböznek tőlük, a fenti megfigyelések arra engednek következtetni, hogy a diabétesz által kiváltott hiperlipidémia elleni védelem valószínűleg nem az egyetlen oka az α-liponsav ato-protekciójának apoE -/- egerekben.

A diabéteszes egerek súlyos testsúlycsökkenésének megakadályozása mellett kísérleteink kimutatták, hogy az α-liponsav megakadályozta a nem cukorbeteg apoE -/- egerekben a magas zsírtartalmú táplálékkal táplált súlygyarapodást is. Így a cukorbetegség nélküli egereknek, akiket α-liponsavval tápláltak, lényegesen kevésbé voltak elhízottak, mint alomtársaikkal, akik étrendet fogyasztottak α-liponsav nélkül, bár hasonló mennyiségű étrendet fogyasztottak naponta. Korábban Kim és mtsai. (47) kimutatta, hogy az α-liponsav dózisfüggő módon jelentősen csökkentette a Sprague-Dawley patkányok táplálékfelvételét és testtömegét, és hogy az α-liponsav anorexiás hatásának elsődleges helye a központi idegrendszer. Ezzel szemben a kísérleteinkben szereplő nem cukorbeteg egerek nem mutattak étvágycsökkenést. Ennek az lehet az oka, hogy alacsonyabb dózisú α-liponsavat használtunk, mint Kim és mtsai kísérleteiben. és/vagy különböző fajok miatt. Mivel az elhízás fontos kockázati tényező a 2-es típusú cukorbetegség és az érelmeszesedés kialakulásában, az α-liponsav elhízás elleni funkciója további előny lehet.

Összefoglalva, tanulmányunk kimutatta, hogy az α-liponsav étrend-kiegészítése 20 hétig teljesen megvédi az apoE -/- egereket az STZ-indukálta cukorbetegség okozta aorta-érelmeszesedés fokozódásától. Az α-liponsav atheroprotektív hatásainak hátterében álló mechanizmusok közé tartozik az oxidatív stressz lényeges csökkenése, amely az LDL oxidáció csökkenéséhez vezet, a cukorbetegség által kiváltott plazma koleszterinszint elleni védelem és a plazma glükózszintjének kismértékű csökkenése, fokozott védelem/β visszanyerés kíséretében. -sejtek a sérülésektől. Bár a jelenlegi tanulmány nem képes teljesen megkülönböztetni e tényezők relatív hozzájárulását, valamint az α-liponsav diabéteszes neuropathiára gyakorolt bizonyított klinikai hatékonyságát, eredményeink azt sugallják, hogy az α-liponsav védőszerként ígérkezik a cukorbetegség kardiovaszkuláris szövődményei ellen.