A lipoprotein lipáz szabályozza a zsírsavak belépését a zsírszövetbe, de a zsírtömeget endogén szintézissel megőrzik a zsírszövet lipoprotein lipáz hiányában szenvedő egerek

Közreműködött: Jan L. Breslow

Absztrakt

Az extrahepatikus szövetek kapilláris endotheliumában található lipoprotein lipáz (LPL) katalizálja a sebességkorlátozó lépést a keringő chilomikronokból és a nagyon kis sűrűségű lipoproteinből származó trigliceridek (TG) hidrolízisében (az áttekintéseket lásd az 1. és 2. hivatkozásban). Mennyiségileg a legtöbb LPL a zsírszövetben (AT) és az izmokban található meg, ahol a felszabadult szabad zsírsavakat felveszik és vagy tárolják, vagy oxidálják (3). Feltételezik, hogy az AT és az izom LPL aktivitásának relatív szintje határozza meg, hogy a zsírkalóriák hogyan oszlanak meg a tárolás vagy hasznosítás felé, és hogy a szöveti expresszió egyensúlyhiánya ezért elhízáshoz vagy fogyáshoz vezethet (4, 5). Az indukált mutáns egerek megjelenéséig a hipotézis közvetlen tesztelésére szolgáló kísérleti rendszerek nem állnak rendelkezésre.

Korábban már létrehoztunk LPL knockout egereket (6), valamint transzgénikus egereket, amelyek kizárólag emberi izomban expresszálják az emberi LPL-t (7). Az LPL-hiányos egerek normálisak születésükkor, de az élet első napján letális hipertrigliceridémia alakul ki, ekkor jelentősen csökkentek az intracelluláris lipidkészletek. Az emberi LPL magas szintjét izomban kifejező transzgénikus egereknél az izom szabad zsírsavkoncentrációja és a zsírsavat metabolizáló organellák (mitokondriumok és peroxiszómák) száma megnövekedett. Ezek a megfigyelések együttesen arra utalnak, hogy a szöveti LPL expresszió a zsírsavak sejtekbe jutásának fő meghatározója. Sajnos a korábbi vizsgálatok nem tudtak megválaszolni a hosszú távú metabolikus következményeket az LPL megváltozott szöveti expressziójának gazdája szempontjából. Az újszülött halála a knockout egerekben kizárta a szöveti lipidfelhalmozódás vizsgálatát egészséges felnőtt állatokban. Az emberi LPL magas szintjét expresszáló transzgénikus egerek súlya csökkent, de miopátia alakult ki és elpusztult. Betegségük kizárta a végleges kijelentéseket az AT és az izom közötti zsírkalória-eloszlás következményeiről a testtömeg-összetételre (BMC).

A jelenlegi tanulmányban megmentettük az LPL knockout tulajdonságát azzal, hogy egy viszonylag alacsony expressziójú izom-specifikus emberi LPL transzgénben tenyésztettünk egy olyan vonalból, amely nem fejlesztette ki a myopathiát. A tenyésztési séma lehetővé tette számunkra, hogy összehasonlítsuk a vad típusú egereket (L2) az alomtársakkal, amelyek az izom-specifikus transzgént és az endogén LPL gén (MCK, egér kreatin kináz) két (L2-MCK) vagy nem (L0-MCK) funkcionális kópiáját tartalmazzák. ). Ezeknek a genotípusoknak a betegesen elhízott ob/ob háttérre gyakorolt hatásait is értékelték. Az L2 és az L0-MCK egerek összehasonlítása azt mutatja, hogy bár az AT LPL nem elengedhetetlen a zsírfejlődéshez, ennek hiányában a zsírraktárakban jelentős minőségi és mennyiségi különbségek figyelhetők meg (ob/ob háttéren). Az L2 és az L2-MCK egerek összehasonlításával kimutatták, hogy az LPL relatív overexpressziójának metabolikus következményei vannak, megerősítve, hogy az izom és az AT LPL relatív szintje fiziológiailag fontos.

MÓD

Indukált mutáns egerek generálása a vad típuson és az ob/ob háttéren.

Az AT LPL-ben hiányos egerek előállítására vonatkozó tenyésztési stratégia két keresztezést tartalmazott. Először az LPL heterozigóta knockout egereket (mL1) és az emberi LPL-t (hLPL) kizárólag váz- és szívizomban expresszáló transzgénikus egereket egér MCK-promóter [MCK-L (alacsony expressziójú) ml2/MCK-hLPL] néven kontrollálva kereszteztük. heterozigóta knockout állatok, amelyek az izomspecifikus humán transzgént tartalmazzák (mL1/MCK-hLPL). Ezeket azután ml1 egérre kereszteztük, hogy a következő almatársakat állítsuk elő a vizsgálathoz (1. táblázat): ml2 egér (átnevezve L2-nek) transzgén nélküli egér LPL gén (mLPL) két funkcionális másolatát tartalmazta, mL2/MCK-hLPL egerek (átnevezték L2-nek) -MCK), amelyek az mlPL két funkcionális másolatát, valamint az izomspecifikus hLPL transzgént tartalmazzák, és az mL0/MCK-hLPL egerek (átnevezve L0-MCK), amelyek nem tartalmazzák az mlPL funkcionális másolatait kizárólag hLPL transzgén expresszióval az izmokban. A szöveti LPL aktivitásokat táplált állapotban (reggel 8 órakor) mértük a leírtak szerint (7). A vázizom aktivitás az L2, L2-MCK és L0-MCK egerekben 1,4 ± 0,5, 9,3 ± 1,4 volt (P Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

A genotípusok összefoglalása

Az AT LPL-hiány ob/ob fenotípusra gyakorolt hatásainak előállításához és értékeléséhez az MCK-hLPL transzgénre homozigóta tenyésztett L0-MCK egereket kereszteztük ob/ob egerek petesejtjeivel átültetett nőstény szubsztrátokkal (The Jackson Laboratories). Valamennyi utód heterozigóta volt az LPL kiütés, az MCK-hLPL transzgén és ob szempontjából. Ezeket az egereket azután kereszteztük, hogy ob/ob hím egereket állítsunk elő, amelyek MCK-hLPL transzgént tartalmaznak, és vagy homozigóta vad típusúak (L2-MCK-ob/ob), vagy pedig az LPL lokuszban knockout (L0-MCK-ob/ob) voltak ( Asztal 1). A genotípusokat az egér LPL-nél, az MCK-hLPL transzgénnél és az ob-lokuszokban határoztuk meg, a korábban leírtak szerint (6, 7). Az összes egeret meghatározott kórokozóktól mentes környezetben helyeztük el.

Növekedési görbék.

A különböző genotípusú egereket 3 hetesen elválasztottuk, majd chow-étrenden tartottuk (4,5% zsír), és hetente lemértük őket.

A BMC-t a leírtak szerint végeztük (5). Röviden, a 4 hónapos (vad típusú háttér) és a 7 hónapos (ob/ob háttér) egereket méhnyak diszlokációval leöltük és megmértük (nedves súly). Az összes testvíz eltávolítása érdekében a tetemeket 90 ° C-os konvekciós kemencébe helyeztük, amíg állandó tömeg nem volt megfigyelhető. A teljes víztartalmat a kemence előtti hasított test tömegének a kemence utáni hasított test tömegének (száraz tömeg) mínusz számításával számítottuk. A tetemeket rövid ideig lefagyasztották folyékony nitrogénben, és keverőben homogenizálták. A lipidek eltávolításához 1 gramm homogenizátumot extraháltunk 3 órán át kloroform/metanol (3: 1) eleggyel Soxhlet extrakciós készülékben. A maradék szilárd anyagot éjszakán át szobahőmérsékleten szárítottuk, és lemértük. A lipidet az extrakció előtti minta tömegének és az extrakció utáni minta tömegének a számításával számítottuk. A teljes test lipidjét ezután lipidként számítottuk a száraz hasított test alikvot részében, megszorozva az összes száraz hasított test tömegével. A sovány testtömeg kiszámítása a dehidratálás előtti tömeg (nedves tömeg) és a teljes lipid- és víztömeg mínusz. Minden mintát két példányban készítettünk.

Szövettani elemzés.

Az élet 20. órájában a kölyköket lefejezték, és a vér- és farokcsúcsokat eltávolították a plazma, illetve a DNS elemzéséhez. Ezután különféle szöveteket kivágtunk és elemzésre előkészítettünk. Olajvörös O-festéshez az állatokat sagitalisan megfeleztük. Az egyik részt parafa lemezen a Tissue Tek-be ágyazták, 5-metil-butánban (Merck) lefagyasztották és folyékony nitrogénben előhűtötték. Ezután négy mikrométer vastag metszeteket vágtunk és olajvörös O-val festettünk. A fennmaradó felét fixáltuk és formalinnal fixáltuk, majd hagyományos módszerekkel paraffinviaszba ágyazottuk, vagy hematoxilin-eozinnal, masson-trichrommal vagy periodikus savval Schiff festettük.

Zsírsav-összetétel elemzés.

Az étrend, az epididymális AT és a plazma zsírsav-összetételét a leírtak szerint hajtottuk végre (8). Röviden, a C17: 0 zsírsav-TG, a koleszterin-észter és a foszfolipid belső standardok (Nu Check Prep, Elysian, MN és Sigma) hozzáadása után a teljes lipidet azonnal Folch oldószerrel extraháltuk. A lipidfrakciókat vékonyréteg-kromatográfiával elválasztjuk szilikagél G lemezek és hexán/dietil-éter/jégecet 60: 40: 1 arányú oldószer-rendszerével. A lemezt Rhodamine G-vel permeteztük és UV-fénnyel láthatóvá tettük. A kívánt sávokat 2 ml 5% metanolos sósavat tartalmazó csövekbe kapartuk. A csöveket nitrogéngázzal lezártuk, 2 órán át 70 ° C-on melegítettük, és lehűtöttük. A zsírsav-metil-észtert víz hozzáadása után hexánnal extraháltuk, és hőmérsékleten programozott gázkromatográfon (5890 modell; Hewlett – Packard) futtattuk lángionizációs detektorral és 100 m × 0,25 mm-es SP2560 olvadt szilícium-dioxid-kapilláris oszloppal ( Supelco) a 8. pontban leírtak szerint. Negyvenhárom csúcsot azonosítottunk, amelyek a 10: 0 - 22: 6n-3 zsírsavaknak felelnek meg, és kiszámoltuk az egyes zsírsavak tömegszázalékát.

EREDMÉNYEK

Növekedési görbék. Három hetes korban a különböző genotípusú egereket elválasztották a chow-étrendről (4,5% zsírtartalom), majd hetente lemérték őket. (A) Férfi L2 (×, n = 5), L2-MCK (○, n = 8) és L0-MCK (▪, n = 6) egerek. (B) Nő L2 (×,n = 7), L2-MCK (○, n = 8) és L0-MCK (▪, n = 10) egerek. (C) L2-MCK-ob/ob (□, n = 20) és L0-MCK-ob/ob (▪, n = 16) egerek. Az értékek átlag ± SD-t jelentenek. a, P A táblázat megtekintése:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

A transzgénikus és kontroll egerek BMC-je

A normális BMC és az AT bruttó megjelenése felnőtt L0-MCK egerekben váratlan volt, tekintettel az LPL kritikus szerepére az AT zsírsav felvételében és tárolásában. Korábbi vizsgálatunkban (6) az L2 és LPL knockout (L0) egereknek születésükkor (császármetszés) alig vagy egyáltalán nem volt AT, de 20 órára az L2 egereknek zsírraktára volt, míg az L0 egereknek nem. A jelenlegi vizsgálatban az L2, L0-MCK, L2-MCK és L0 egerek születésükkor mind csak nyomokban tartalmaztak zsírraktárakat (az adatokat nem közöljük). Azonban, amint az a 2. ábrán látható: Balra (× 70-es nagyítás) a periglanduláris AT reprezentatív szakaszai által, 20 órás korukban az L0 egerek kivételével mindegyiknek volt megfelelő AT ezen és más helyeken. Gondos szövettani vizsgálat (2. ábra jobb, × 270-es nagyítás) viszonylag homogén, nagy, univacuolizált adipocitákat tárt fel az L2 egerekben, míg az L0-MCK és az L2-MCK egerek morfológiai heterogenitása megnövekedett sok plurivacuolizált adipocita megjelenésével és a nagy univacuolizált sejtek. Így úgy tűnik, hogy normális körülmények között az AT LPL-hiány hatással van a sejtmorfológiára, de nem akadályozza meg az AT-felhalmozódást, és az állatok még 20 órás korukban is képesek kompenzálni a hiányt.

Az AT szövettani elemzése. Tipikus periglanduláris AT (A) L2, (B) L0-MCK, (C) L2-MCK és (D) L0 kölykök életének 20 órájában. (Balra, × 70-es nagyítás; Jobbra, × 270-es nagyítás csak az AT-ra fókuszálva.) Gl, mirigyes hám; At, zsírszövet.

Az intramuszkuláris lipid felhalmozódást ezután különböző mennyiségű izom LPL expresszióval értékeltük AT LPL expresszióval és anélkül. A fénymikroszkópiát 20 órás L2, L2-MCK, L0-MCK és L0 kölykök izomszelvényein végeztük, és az intramuszkuláris lipidtartalmat szemikvantitatívan értékeltük (3. ábra). Az L2 egerek izmaival összehasonlítva az L2-MCK egerek kismértékben (10–20%), míg az L0-MCK egereknél jelentősen (60%) emelkedett a lipidszint. Mint arról korábban beszámoltunk, az L0 egerekben szinte nem volt intramuszkuláris lipid. Így az AT LPL hiánya, amely meghaladja az összes izom LPL aktivitását, meghatározza az izom lipid felhalmozódását.

Az intramuszkuláris lipidcseppek szemikvantitatív elemzése. Az intramuszkuláris lipid szemikvantitatív elemzését „vakon” hajtották végre (a genotípus ismerete nélkül), a szövettani metszetek értékelésével egy (legkevesebb) és öt (legnagyobb) között, az intracelluláris lipidcseppek mennyiségétől függően. Ezután az egyes genotípusok értékeit átlagoltuk. A zárójelben lévő számok az egyes genotípusokra elemzett kölykök számát jelzik.

A következő bruttó AT megjelenést L2-MCK-ob/ob és L0-MCK-ob/ob egerekben hasonlítottuk össze (4. ábra). A tömeg és a lipidtömeg csökkenésével kompatibilis volt, hogy az L0-MCK-ob/ob egerekben, valamint más helyeken a perirenalis és a gonadális AT bruttó csökkenést mutatott (az adatokat nem mutatjuk be). Az AT szintén barna színűnek tűnt, megnövekedett erezettséggel, nem pedig fehér színűnek. Így genetikailag programozott elhízás esetén az AT LPL hiánya akadályozza a lipid felhalmozódását a zsírraktárakban.

Az AT LPL-ben hiányos ob/ob egerek bruttó megjelenése. L2-MCK-ob/ob (balra) és L0-MCK-ob/ob (jobbra) egereket és szöveteket hasonlítottunk össze. (A) Tipikus hím alomtársak 7 hónaposan. Megjegyezzük a testtömegeket. (B) Perirenal és retroperitoneális zsírraktárak. K, vese; At, zsírszövet. (C) Gonadal zsírpárnák. T, herék.

Az étrend és az AT átlagos zsírsavösszetétele

VITA

Az AT-tömeg pontosan megmarad akkor is, ha az AT TG szintézisének elsődleges szubsztrátja, az exogén zsírsav hiányzik. A kompenzációs mechanizmusoknak tehát ki kell fejlődniük a zsírraktárak megőrzése érdekében. Ezeket a mentési folyamatokat finoman ellenőrzik, és felnőtt állatokban normális zsírraktárakat eredményeznek, és a plazma leptinszintje alapján ítélve (az adatokat nem mutatjuk be) a zsírfunkciókat. A folyamat az élet korai szakaszában kezdődik, és minőségileg normális AT postnatálisan fejlődik ki, és 20 órás életkorig jelen van. Ez azt jelenti, hogy az AT-tömeg fenntartása elengedhetetlen a szervezet túléléséhez. Érdekes módon a megnövekedett AT lipogenezist a közelmúltban leírták olyan patkányoknál is, amelyek több éhség-újratáplálási cikluson estek át, ami ismét potenciális túlélési előnyt jelent (18). Meg kell tisztázni ennek a folyamatnak az irányítását, legyen az központi vagy helyi.

Az LPL túlzott expressziója az izomban zsírsav-szubsztrát ellopásához vezethet az AT-től távol, de az endogén AT-zsírsav-bioszintézis következtében nem eredményezi a zsírtömeg csökkenését. Greenwood (4, 5) feltételezte, hogy az AT relatív túlzott expressziója az izom LPL-hez képest elhízást okoz. Erre rágcsálókon és emberen végzett kutatások következtek, amelyek az AT LPL relatív túlzott expresszióját jelezték elhízási körülmények között (19). Mechanikusan azt javasolták, hogy a szubsztrát AT általi ellopása vagy közvetlen zsírfelhalmozódást okozott, vagy azáltal, hogy más szöveteket megfosztott zsírból származó kalóriáktól, fokozott étvágyat és túlzott kalóriabevitelt eredményezett. A jelenlegi vizsgálatban nem generáltunk olyan egereket, amelyek AT izom-LPL-je megnövekedett; inkább az ellenkezőjét generáltuk. Ezekben az állatokban (L2-MCK) valóban voltak bizonyítékok a szubsztrát izom általi ellopására, de az AT endogén zsírsavszintézisének kompenzatív növekedése megakadályozta a BMC vagy a táplálékbevitel változását. Az AT és az izom LPL aktivitás között megnövekedett arányú állatokat állítanak elő a Greenwood-hipotézis közvetlen tesztelésére. A jelenlegi kísérletek azonban arra utalnak, hogy normál egerekben az izom és az AT LPL aktivitás arányának elsődleges változása önmagában nem változtatja meg a súlygyarapodást vagy az élelmiszer-fogyasztást.

Ob/ob egereknél az AT LPL hiánya, különösen idősebb egereknél, a súlygyarapodási görbe ellaposodásával és kevesebb zsírtartalommal jár, mint azoknál az egereknél, ahol AT LPL van jelen. Az ob/ob egerekben (19–21) megnövekedett táplálékfogyasztás és csökkent anyagcsere esetén az AT LPL-hiányos egerek súlya nagyobb, mint a normál egereknél, de kevesebb, mint az ob/ob egereknél, akiknél normális AT LPL van. A legegyszerűbb magyarázat az, hogy az AT zsírsavak endogén szintézise tarthat egy bizonyos pontot, de elér egy bizonyos határt. A 90 napnál hosszabb időtartamú L0-MCK-ob/ob egerek súlygyarapodási görbéjéből a fennsík alapján megítélve az egyensúlyi állapotot a szintézis és az eltávolítási útvonalak egyensúlyban tartják. Ezek az adatok arra utalnak, hogy egyes esetekben az AT LPL mennyisége korlátozhatja az elhízás kialakulását.

Összefoglalva, az itt közölt indukált mutáns egerek feltárják az LPL alapvető szerepét a zsírból származó kalóriák szövetbe jutásában, ugyanakkor fontos mentési utakat is jeleznek, amelyek feltételezhetően szükségesek a szervezet túléléséhez.