A zselatinok intrakután úton történő leadása csökkenti a zsír felhalmozódását a szubkután zsírszövetben

Kulcsszavak: Szubkután zsírszövet, zselatin, mikrotű, elhízás

Az elhízást, amely globálisan növekszik, a testzsír-tömeg feleslegének definiálják, amely a testzsír időbeli felhalmozódásából ered, a felesleges energiafogyasztást vagy az alacsony energiafelhasználást követően (1). Szorosan összefügg számos egészségügyi kockázattal, és inzulinrezisztenciához (IR) és a 2-es típusú cukorbetegség kialakulásához vezet (2). Egyformán magas vérnyomást és bizonyos rákos megbetegedéseket eredményez (3, 4). A zsírszövet (AT) az energiatárolás fő szerve. Két tág osztályba sorolható: szubkután AT (SAT) és zsigeri AT (VAT). A SAT kifejezetten felelős a teljes zsír több mint 80% -ának a szervezetben történő tárolásáért, és főleg a hasi, valamint a farizom-femorális régióban rakódik le (5).

A SAT-csökkentés kozmetikai célú alkalmazása (a test alakjának és arculatának javítása) nagy figyelmet keltett (6). A legújabb jelentések azt mutatják, hogy a SAT szignifikánsan összefügg a metabolikus szindrómával és annak jellemzőitől, kortól és nemtől függetlenül (7). Ezenkívül a SAT feleslege jelentős problémákat okoz az AT diszfunkciójának kialakulásában és a zsír felhalmozódásában olyan méhen kívüli depókban, mint a máj és az izomszövet (8-10). Ezen okok miatt a különböző krónikus betegségek, például a májcirrhosis és bizonyos rákos megbetegedések szorosan összefüggenek a zsíranyagcserével (11).

Sebészeti és nem műtéti módszereket alkalmaznak a SAT csökkentésére (12, 13). Pontosabban, az AT lízisét okozó kémiai anyagok, például foszfatidilkolin (PPC) intralesionális injekciója hatékonyan csökkenti a lokalizált zsírfelhalmozódást (14). Ennek a módszernek azonban számos mellékhatása van, például fájdalom, erythema és fertőző granulomatosus reakció (15, 16). Alternatív megoldásként számos természetes polimert, köztük alacsony molekulatömegű kitozánt, zselatint és kondroitin-szulfátot használtak étrend-kiegészítőként a zsírcsökkentés felgyorsítására többféle úton (17–19). A zselatin egy olcsó alternatíva, amely könnyen elérhető a természetben, és széles körben használják a különféle biomedicinális alkalmazásokban. Egy korábbi tanulmányunkban kimutattuk, hogy a zselatin elnyomja a lipogenezist és felgyorsítja a lipolízist az adipocitákban és a zsírszövetekben (20). Bár ezek a természetes polimerek biztonságosak és hatékonyak étrend-kiegészítőként, a nemkívánatos SAT-ra gyakorolt helyi hatásukra vonatkozó információk korlátozottak.

A közelmúltban olyan neminvazív eljárásokat vizsgáltak, mint a lézerek használata, a nagy intenzitású fókuszált ultrahang (HIFU), a kriolipolízis és a rádiófrekvenciás (RF) terápia, amelyeknek kevés mellékhatása van és a betegek fokozottabban megfelelnek a betegeknek - 23). Ezekhez a technikákhoz azonban további drága fogyóeszközökre van szükség, amelyekhez képzett orvosokra van szükség a biztonságos működéshez. Következésképpen szükség van egy új SAT csökkentési eljárásra, amely hatékony, minimálisan invazív, olcsó, önállóan kezelhető és nem igényel további eszközöket.

A SAT csökkentésére alkalmas platform kifejlesztése érdekében egy biológiailag lebomló természetes polimerből (zselatin) készítettünk egy oldódó mikrotű (MN) tapaszt, amelynek elhízás elleni hatása van. Ebben a tanulmányban megerősítettük a zselatin elhízásellenes hatásait, és új terápiát fejlesztettünk ki az SAT csökkentésére a test kívánt régióiban az MN alkalmazása alapján. A magas zsírtartalmú étrend (HD) által kiváltott elhízás patkányainak SAT-ban a zselatin MN-ek zsíranyagcserére gyakorolt hatását is igazoltuk.

Anyagok

Az anti-β-aktin antitesteket a Cell Signaling Technology, Inc.-től (Beverly, MA, USA) szereztük be. Zsírsav ellenes szintáz (anti-FASN), anti-szterin szabályozó elemkötő fehérje 1c (anti-SREBP-1c) és anti-peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor-y (anti-PPARG) antitestek, valamint torma-peroxidáz ( HRP) konjugált nyúl- és egérellenes IgG antitesteket a Santa Cruz Biotechnology, Inc.-től (Santa Cruz, Kalifornia, USA) szereztünk be. Hideg vizes halbőr-zselatint Sigma Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) vásároltunk; sertésbőr-zselatin a Sammi Co., Ltd.-től (Anyang, Korea); halbőr zselatin a Gel Tec Co., Ltd.-től (Busan, Korea); és polidimetil-sziloxán (PDMS; Sylgard 184) a Dow Corning-tól (Midland, MI, USA).

MN tapaszokat készítettünk egy korábban leírt protokoll alapján (24). A zselatin MN gyártásához 10% -os w/w zselatin oldatot készítettünk 40 ° C-os vízfürdőben. A zselatin MN tapaszok előállítására szolgáló PDMS formákat egy pozitív golyó alakú MN tömbből replikáltuk, amelyet számítógépes numerikus vezérlő (CNC) géppel hagytunk. Zselatin MN tapaszt (1 × 1 cm2) készítettünk úgy, hogy oldószerrel öntjük a zselatin oldatot 60 ° C-on tartott vákuumkamrában. Mindegyik zselatin MN tapaszt 60 ° C-on szárítottuk 12 órán át. Szobahőmérsékletre történő lehűlés után a zselatin MN foltokat óvatosan lehúztuk a PDMS formákról.

A Western blottoláshoz az adipocita fehérje mintákat Pro-prep oldattal extraháltuk az iNtRON Biotechnology-tól (Szöul, Korea), a gyártó utasításainak megfelelően. A fehérjéket nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel választottuk el (SDS-PAGE; 8–12% SDS), majd nitrocellulóz membránokra vittük át; a Daeil Lab Service Co., Ltd-től (Szöul, Korea). A membránokat 2 órán át blokkoltuk 5% Difco ™ fölözött tejjel (Sparks, MD, USA) 0,05% Tween-20 (PBS-T) PBS-ben. Blokkolás után a membránokat egy éjszakán át inkubáltuk anti-FASN nyúl (1: 1000 hígítás), anti-SREBP-1c egér (1: 1000 hígítás) és anti-PPARG egér (1: 1000 hígítás) antitestekkel (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), majd további 1 órán át inkubáltuk HRP-vel konjugált nyúl- vagy antimouse antitestekkel (1: 2000 arányban hígítva) 5% sovány tejben PBS-T-ben. A Bio-Rad (Hercules, CA, USA) Luminol-reagensét használtuk az antitestkötés vizualizálására. Mindegyik blotot 2% SDS-sel és 100 mM 2-merkapto-etanollal 62,5 mM Tris-HCl-ban (pH 6,8) inkubálva 30 percig 50-60 ° C-on inkubáljuk. Ezt követően a membránokat belső kontrollként β-aktin antitesttel (1: 3000 arányban hígítva) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) vizsgáltuk. A blotokat a Gel Doc 1000 1.5-ös verziójával (Bio-Rad) szkenneltük, és a sávintenzitást a β-aktin szintre normalizáltuk.

Az eredményeket az átlag ± átlagos hiba (SEM) formájában mutatjuk be. Az adatokat egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) (SPSS for Windows, 10.10, standard változat) vizsgáltuk az SPSS Inc-től (Chicago, IL, USA). P -értékek

A zselatin MN-ek hatása a testtömegre és a táplálékfelvételre HD-indukált elhízásban szenvedő patkányokban

HD-indukált elhízással rendelkező patkányokat használtunk a zselatin MN-ek hatásának meghatározásához. A zselatin MN-ket felvittük az inguinalis régióra, amely a SAT felhalmozódásának ismert helyszíne (1A. Ábra). A zselatin MN-eket zselatin eredetű fajok (hal és sertés) és a gyártó cég szerint csoportosítottuk. Az előkészített MN-ket csak az inguinalis régió egyik oldalán alkalmaztuk HD patkányokban, akiknél HD-indukált elhízás volt tapasztalható. A gyártott zselatin MN-foltok (1B. Ábra) 1 × 1 cm 2 golyó alakú tűkből álltak, amelyek alapszélessége 250 μm és magassága 750 μm. A zselatin MN tapaszokat úgy oldották meg, hogy feloldódjanak, és fokozzák a polimerek helyi felszabadulását a megcélzott régióban. Az MN tapaszokat 3 naponta, 4 héten keresztül alkalmaztuk (a tapaszokat ötször rögzítettük). A testtömeget és a táplálékfelvételt 3 naponta mértük az alkalmazás ideje alatt, és az alkalmazás első napján kapott értékekkel normalizáltuk. Az 1C. Ábra a testtömeg változását mutatja, amelyek nem voltak szignifikánsak. Ezenkívül az ételfogyasztás a csoportok között nem különbözött szignifikánsan (1D ábra).

A zselatin-MN-ek hatása a SAT tömegére HD-indukált elhízással rendelkező patkányokban

Annak megállapításához, hogy volt-e lokálisan specifikus SAT csökkenés azokban a régiókban, amelyekre az MN tapaszokat felvittük, kivágtuk és lemértük az inguinalis SAT és az epididymalis AT kísérletet. A SAT súlyokat normalizáltuk az epididymális AT súlyára. A 2A. Ábra azt mutatja, hogy az inguinalis SAT tömegek, amelyekhez az MN tapaszokat rögzítették (bal oldal), a GT-FG 250 és az SM-PG 280 csoportokban jelentősen csökkentek a kezelés nélküli régiókhoz képest (jobb oldal). Továbbá a GT-FG 250 és az SM-PG 280 csoportok normalizált SAT súlya jelentősen csökkent a kontrollcsoport súlyához képest (2B ábra).

A SAT lerakódások változásai a zselatin MN tapaszok felhordása után

Megvizsgáltuk a zselatin MN tapaszok alkalmazását követő SAT szövettani változását is, hogy meghatározzuk, hogyan változnak a tapaszok az adipocita morfológiáján (3. ábra). Az MN tapaszok felvitele után a kezelt inguinalis SAT-t paraffinba rögzítettük és H&E-vel festettük.

Az SA-FG, a GT-FG 250 és különösen az SM-PG 280 csoport lipidcseppjeinek átmérője kisebb volt, mint a kontrollcsoporté, ami a zsír felhalmozódásának csökkenését jelentette (3A. Ábra). Az adipocita méretének változásának eredményeit a 3B. Ábra mutatja. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a zselatin MN-k (különösen az SM-PG 280 MN-ek) csökkentik a zsír felhalmozódását, függetlenül a testtömeg változásától.

A zselatin MN-ek hatása az adipogén és lipogén gének expressziójára SAT-ban

Annak meghatározásához, hogy a zselatin MN-k hogyan szabályozzák a zsíranyagcserét, Western blot segítségével mértük az adipogenezisben és a lipogenezisben részt vevő gének expressziós szintjét (4. ábra). Meghatároztuk az FASN lipogén enzim és transzkripciós szabályozói, az SREBP-1c és a PPARG fehérje expressziós szintjét SAT-ban. A FASN, SREBP-1c és PPARG-nek tulajdonítható reprezentatív fehérje expressziós sávokat a 4A. Ábra mutatja. A FASN (lipogén enzim) szintje jelentősen csökkent (akár 80% -os csökkenés) a GT-FG 220 csoport SAT-jában (4B. Ábra). Azonban a SREBP-1c és a PPARG expressziós szintje a SAT-ban nem változott a zselatin MN tapaszok egyikének alkalmazása után (4C. Ábra). Az SM-PG 280 MN csökkentette a PPARG expresszióját, ami megkönnyíti a lipogenezist, bár a redukció nem volt szignifikáns (4D. Ábra).

A közelmúltban a helyi régiókban felhalmozódó zsír elhízás kozmetikai problémává vált társadalmi és pszichológiai következményekkel. Általában a SAT megnagyobbodásával társul, amely főleg a csípőn és a combokon oszlik el (25). A hipertrófiás SAT néha hozzájárul az anyagcsere-betegségek patogeneziséhez, amint azt az elhízás és az elhízott egyének állatmodelljeiben láthatjuk (26, 27). A SAT túlzott felhalmozódásának enyhítése érdekében a betegek általában sebészeti beavatkozásokon mennek keresztül, beleértve a zsírleszívást is, amelynek számos lehetséges kockázata van, beleértve a fájdalmat, a fertőzéseket, a zsibbadást és/vagy a hegesedést (25). Ezért a közelmúltban a SAT csökkentésének alternatív megközelítésének kidolgozására összpontosítottak. Az MN-ek mikroméretű, legfeljebb 1 mm hosszú tűszerű szerkezetek, amelyeket a bőr felső rétegének átlyukasztására használnak, hogy lehetővé tegyék a transzdermális gyógyszeradagolást (28). Számos korábbi tanulmányban szilárd MN-ket használtak RF szállító eszközökkel a bőr felszíni behatolásához (29). A zselatin MN-k esetében az alkalmazott MN tapasz mikropunkciókat hoz létre, amelyek jelentősen javítják a zselatintartalom bőrbe jutását.

A zselatin MN csoportok, különösen a GT-FG 250 és az SM-PG 280 csoportok normalizált SAT súlya szignifikánsan csökkent a kontroll csoporthoz képest. A patkányok testtömege azonban az összes csoportban nem változott szignifikánsan, bár a SAT csökkent. Feltételeztük, hogy a SAT a testtömeg nagyon kis részét foglalja el, ezért a statisztikai elemzés során a SAT változása nem befolyásolja a testtömeget.

Továbbá a halakból (SA-FG csoport és GT-FG 250 csoport) és a sertésekből (SM-PG 280 csoport) származó zselatin MN jelentősen csökkentette a zsír lerakódását az inguinalis adipocytákban. A zsír felhalmozódása összefügg a trigliceridek szintjével, amely a testben tárolt zsírforma (31). Korábbi szerzők arról számoltak be, hogy a glicin, amely a zselatin aminosavainak 22% -át alkotja, elhízott állatokban csökkenti az adipociták méretét és a máj nagyon kis sűrűségű lipoprotein (VLDL) kiválasztását (32).

Ennek a javaslatnak a megerősítése érdekében megmértük a lipogenezisben és az adipogenezisben részt vevő gének fehérje expressziós szintjét, hogy meghatározzuk, hogyan szabályozzák az MN-ek a zsíranyagcserét. Meghatároztuk a lipogenezissel kapcsolatos két transzkripciós faktor (SREBP-1c és PPARG) és célgénjük FASN (33-35) fehérje expressziós szintjét. A GT-FG 220 MN szignifikánsan csökkentette a FASN fehérje expresszióját, míg az SREBP-1c és a PPARG expressziós szintjét egyik tesztelt MN tapasz sem befolyásolta szignifikánsan. Ezek a génexpressziós minták ellentmondtak a szövettani elemzések és az előző tanulmányunk eredményeinek, amelyek jelentős adipogenezissel kapcsolatos génszabályozást mutattak ki (20), ami a MN hosszú távú alkalmazásának tulajdonítható. Az ismételt MN alkalmazás (5x) csökkentheti a zselatinra adott reakcióképességet a SAT-ban a lipogén gének expressziója szempontjából.

Összefoglalva, eredményeink azt mutatják, hogy a zselatin MN-ek, különösen a sertésből származó MN-k (SM-PG 280 csoport) alkalmazása csökkenti a zsíranyagcserét és a SAT felhalmozódását elhízott patkányokban. Ezek az adatok tehát biológiailag lebontható zselatin MN-ek alkalmazását javasolják a célzott SAT-csökkentésre, amelynek minimális mellékhatása van.

Ezt a munkát a Pusan Nemzeti Egyetem kétéves kutatási támogatásával támogatták.