A magas fehérjetartalmú étrend és a probiotikus Lactobacillus casei Shirota-kiegészítés hatása az aflatoxin B1 által indukált patkányokban

Z. Nurul Adilah

Táplálkozási és Dietetikai Tanszék, Orvostudományi és Egészségtudományi Kar, Universiti Putra Malaysia, 43400 Serdang, Selangor, Malajzia

Winnie-Pui-Pui Liew

Táplálkozási és Dietetikai Tanszék, Orvostudományi és Egészségtudományi Kar, Universiti Putra Malaysia, 43400 Serdang, Selangor, Malajzia

S. Mohd Redzwan

Táplálkozási és Dietetikai Tanszék, Orvostudományi és Egészségtudományi Kar, Universiti Putra Malaysia, 43400 Serdang, Selangor, Malajzia

Én benne vagyok

Táplálkozási és Dietetikai Tanszék, Orvostudományi és Egészségtudományi Kar, Universiti Putra Malaysia, 43400 Serdang, Selangor, Malajzia

Absztrakt

2.2. Állatok

Huszonnégy (n = 24) hím Sprague Dawley patkányt (7-8 hetesek, 290–300 g) vásároltak a Malajziai Putra Egyetem Állatorvosi Kar Állategészségügyi Patológiai és Mikrobiológiai Tanszékének Állat-erőforrás Osztályától (ARU). (UPM). A patkányokat szobahőmérsékleten, normál fény (12 órás világos-sötét ciklus), szabályozott hőmérséklet (20–22 ° C) és szellőzés mellett tartottuk az Összehasonlító Orvostechnikai Egység (COMeT), Biológiai Tudományok Intézetének állatkutató házában., UPM. Két patkányt egy faforgácsos ketrecben helyeztek el. A ketrecek tisztítási folyamatát hetente kétszer hajtották végre, és naponta változtatták a vízellátást. Erre az állatkísérletre etikai jóváhagyást adott az UPM Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága (UPM/IACUC/AUP-R098/2016).

2.3. Diéta elkészítése

Magas fehérjetartalmú (HP) étrend készült Envigo recept alapján [15]. Ez az étrend a kalóriákat tekintve körülbelül 40% fehérjét tartalmazott.

2.4. Kísérleti tanulmány

2.5. Vizeletgyűjtemény

Az utolsó AFB1 dózist követően az összes patkányt egyenként metabolikus ketrecben tartották a vizelet gyűjtése céljából. A vizeletmintákat az elemzésig -80 ° C-on tárolták.

2.6. Vérelvonás

Mintegy 3–10 ml vért vettünk ki, és szérumszeparátorral ellátott vérgyűjtő csővel (Becton, Dickinson and Company (BD), Plymouth, Egyesült Királyság) gyűjtöttük össze. A vérszérumot Kubota 2810 centrifuga (Tokió, Japán) segítségével 4 ° C-on 13 percig, 2000 g-nál elválasztottuk. A szérumot összegyűjtöttük és -80 ° C-on tároltuk az elemzésig.

2.7. Máj- és vesefunkció-teszt

Az alanin-aminotranszferáz (ALT), az aszpartát-aminotranszferáz (AST), az alkalikus foszfatáz (ALP), az összes fehérje és az albumin szintjét a májfunkció szempontjából mértük, míg a karbamid (UREA) és a vér kreatinin (CREA) szintjét a vesefunkció. Ezeket a vizsgálatokat teljesen automatizált BiOLiS 24i Premium klinikai analizátorral elemeztük az UPM Állatorvostudományi Kar Hematológiai és Biokémiai Klinikai Laboratóriumában.

2.8. A vizelet AFM elemzése

A vizeletet ELISA kit alkalmazásával elemeztük az AFM1 jelenlétére, kifejezetten a vizelet AFM1 meghatározására (Helica Biosystems, Inc., Santa Ana, Kalifornia, USA) [19].

2.9. Szövettani vizsgálat

A teljes vékonybelet, a vastagbelet, a májat és a lépet eltávolítottuk, majd 10% -os formális oldatban, semleges pufferben (R&M Chemicals, Egyesült Királyság) rögzítettük 3 napig szobahőmérsékleten. A rögzített szövetmintákat többször 80–95% -os etanollal mossuk, majd abszolút etanolban dehidratáljuk, majd xilollal tisztítjuk és paraffinba ágyazzuk. A paraffinba ágyazott szöveteket sorozatosan, 4 μm vastagságban szekcionáltuk. A metszeteket kvalitatív szövettani elemzés céljából hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festettük.

2.10. Statisztikai analízis

Az adatokat SPSS 20-as verziójú szoftverrel (SPSS Inc., Chicago, IL) elemeztük. A máj és a vese biomarkerek átlagos különbségeit ANOVA alkalmazásával elemeztük a csoportok között, és post hoc elemzést (Tukey-teszt) végeztünk minden jelentős ANOVA kimenetelre. Másrészt a vizelet AFM1 szintjének különbségét független t-teszttel határoztuk meg. Az eredményeket átlag ± SD értékben fejeztük ki. A szignifikancia szintjét p 1. ábrán adtuk meg. Ez a megfigyelés összhangban van más tanulmányokkal [14, 20]. Az AFB1 súlycsökkenést okozhat és csökkentheti az élelmiszer-fogyasztást azáltal, hogy csökkenti a leptin szintjét [21], ami közvetlenül befolyásolja az energiaegyensúlyt és a testtömeg-növekedést [22]. Jelen tanulmányban nem figyeltek meg szignifikáns különbséget a testtömeg-növekedésben az A csoport (58,5 ± 4,6 g) és a C csoport (53,33 ± 7,9 g) között, mivel a HP diéta fokozza az AFB1 méregtelenítését [12]. A B csoportba tartozó patkányoknál (47,67 ± 5,5 g) azonban szignifikánsan alacsonyabb volt a súlygyarapodás (p 8 CFU probiotikumok [26]. Ezenkívül a Lactobacillus fajok pótlása a testtömeg és a testzsír jelentős csökkenését okozta női alanyokban [27].

A patkány testtömeg-növekedésének összehasonlítása három csoport között. A: csak magas fehérjetartalmú (HP), B: magas fehérjetartalmú, Lactobacillus casei Shirota és aflatoxin B1 (HP + LcS + AFB1), C: magas fehérjetartalmú és aflatoxin B1 (HP + AFB1).

Emellett a probiotikus kiegészítés a rövid szénláncú zsírsavak (SCFA) termelésén keresztül befolyásolja a gazda energia-anyagcseréjét [28]. Egy tanulmány [29] kimutatta, hogy a Lactobacillus salivarius ssp. salicinius JCM 1230 és Lactobacillus. Az agilis JCM 1048 24 óra alatt szimulált csirkececumban szignifikánsan fokozta a propionát és a butirát képződését. Valójában az L. acidophilus képes volt növelni az SCFA-koncentrációt a SHIME (az emberi mikrobiális ökoszisztéma szimulátora) reaktorban [30]. Az SCFA-k növekedése összefügg az anorektikus bélhormonok, például a peptid (PYY) és a glukagon-szerű peptid-1 (GLP-1) keringő koncentrációjának növekedésével, és ezekről a bélhormonokról kimutatták, hogy csökkentik az energiafogyasztást [31]. Ezen kívül az SCFA csökkenti a súlyt az energiafelhasználás növelésével, és fokozza a zsír oxidációját és a termogenezist az oxigénfogyasztás mértékének növelésével [32].

3.2. Májfunkciós teszt

Az AST és az ALT a májfunkció enzimjei, és ezeknek az enzimeknek egy bizonyos határon túli megemelkedett aktivitása májelváltozásokat vagy egyéb károsodásokat jelez [33]. Az A csoport patkányainak magas volt az AST szintje, és a szint szignifikánsan különbözött a C csoport patkányaitól (1. táblázat). Ennek az eredménynek ellentmond egy korábbi tanulmány, mivel az AFB1 expozíció növelte az AST szintet [14]. A patkányoknak a jelen vizsgálatban adott AFB1 dózisa hasonló volt Nikbakht Nasrabadi és mtsai által végzett vizsgálathoz. [14]. Ennek a megállapításnak a lehetséges magyarázata az étrend típusának tudható be. Mint korábban említettük, a HP diéta fokozza az AFB1 méregtelenítését [12]. A HP étrend a májenzimekre is hatással van, mint azt egy állatkísérlet megállapította [34]. HP diéta után a májenzimek fokozzák az aminosav katabolizmusát [35]. Mivel az étrend magas fehérjetartalmú, a májnak több enzimet kell kiválasztania az aminosav katabolizmusához. Valójában az AST szint növekedése a csoportok között párhuzamos volt az élelmiszer-fogyasztással, mivel az A csoport patkányainak magasabb volt az élelmiszer-fogyasztása, mint a B és C csoport patkányainak.

Asztal 1

Patkány vérmintájának biokémiai elemzése májfunkciós teszthez.

Paraméter ALT (U/L)
p értékAST (U/L) p érték ALP (U/L)
p érték ALB (g/L) p értékTP (g/L) p érték

Csoport
A	48,60 ± 12,13 a	0,987	196,40 ± 45,23 b	0,049	164,60 ± 28,43 a	0,385	31,52 ± 0,89 a	0,255	69,96 ± 3,70 a	0,394
B	47,60 ± 10,62 a		163,80 ± 2,26 ab		168,40 ± 10,92 a		30,90 ± 0,65 a		71,90 ± 1,81 a
C	48,00 ± 7,54 a		142,60 ± 19,62 a		181,80 ± 15,96 a		30,32 ± 1,51 a		69,54 ± 2,56 a

A: csak magas fehérjetartalmú (HP), B: magas fehérjetartalmú, Lactobacillus casei Shirota és aflatoxin B1 (HP + LcS + AFB1), C: magas fehérjetartalmú és aflatoxin B1 (HP + AFB1), ALT: alanin-transzamináz, AST: aszpartát transzamináz, ALP: alkalikus foszfatáz, ALB: albumin, TP: összes fehérje. A p értékeket varianciaanalízissel (ANOVA) kaptuk. Az értékeket átlag ± SD-ként fejezzük ki. A különböző felső indexű értékek jelentősen eltérnek egymástól (p 1. táblázat). Az AST és az ALP szint egyaránt magasabb volt, mint a normál tartomány (AST: ≤40 NE/L, [36], ALP: 44–147 NE/L, [37]), de májkárosodást nem figyeltek meg. Ezenkívül más májfunkciós biomarkerek, mint például az ALT, az összes fehérje és az albumin, a normális tartományban maradtak. Az ebben a vizsgálatban megfigyelt megnövekedett AST és ALP szint lehet a patkányok adaptációs mechanizmusa a HP étrendhez. Az adaptáció egy szándékos válasz, amelyet a testrendszer egy új típusú étrendre hajt végre, ami a funkcionális állapot változását okozza a jobb testteljesítmény érdekében [38]. Ez nyilvánvaló volt egy Johnson és munkatársai által végzett állatkísérletben. [39], mivel a magas fehérjetartalmú étrenddel rendelkező majmoknál az ALP szintje megemelkedett. Ezért a májfunkció biomarkereinek változásait, különösen az AST-t és az ALP-t, a HP diéta fogyasztása okozza, és nem a májkárosodás miatt. A HP diéta májenzimekre gyakorolt hatása azonban a kísérleti étrendben felhasznált makrotápanyagok százalékától függ [40].

3.3. Vesefunkció teszt

A patkányok karbamidszintje az A, B és C csoportban valamivel magasabb volt, mint a normális 5,4-7,9 mmol/l tartomány, amint azt patkányokban közölték [41] (2. táblázat). A fehérjebevitel változásokat okoz a karbamid enzim ciklustevékenységében [35]. Az étkezési fehérje esszenciális és nem esszenciális aminosavakká metabolizálódik [42]. Ezenkívül aminosavat használnak a fehérje szintetizálására vagy karbamiddá történő átalakítására a májban [42]. A karbamid termelése az elfogyasztott étkezési fehérje mennyiségétől függ [42, 43].

2. táblázat

Patkány vérmintájának biokémiai elemzése vesefunkciós vizsgálat céljából.

Paraméter Urea (mmol/l)
kreatinin (umol/L) p érték

Csoport
A	10,82 ± 0,26 b	0,032	46,2 ± 3,34 a	0,772
B	10,02 ± 0,73 a		45,0 ± 2,54 a
C	10,10 ± 0,14 ab		45,0 ± 3,08 a

A: csak magas fehérjetartalmú (HP), B: magas fehérjetartalmú, Lactobacillus casei Shirota és aflatoxin (HP + LcS + AFB1), C: magas fehérjetartalmú és aflatoxinszint (HP + AFB1). A p értékeket varianciaanalízissel (ANOVA) kaptuk. Az értékeket átlag ± SD-ként fejezzük ki. A különböző felső indexű értékek szignifikánsan különböznek (p 0,05) a B csoport patkányaiban, összehasonlítva a C csoport patkányaival (3. táblázat). A B csoport patkányaihoz kiegészített LcS megköti az AFB1-t és csökkenti abszorpcióját a vékonybélben [11]. Valójában az AFM1 csökkenése körülbelül 93% volt, összehasonlítva a B csoport patkányaival. Nikbakht Nasrabadi et al. [14], az LcS-kiegészítés 85% -os csökkenést okozott az aflatoxin biomarkerben. Az étrendi bevitel változásai befolyásolhatják a baktériumok összetételét [50]. Az étrend a fő környezeti tényező, amely befolyásolhatja a baktériumok sokféleségét és funkcionalitását [50–52]. Például az étkezési fehérje befolyásolja az általános mikrobiális sokféleséget [53] azáltal, hogy növeli a bélben a hasznos mikrobiotát [54]. A fehérjebevitel nitrogénforrásokat biztosít a vastagbél mikrobiális növekedéséhez [55], így a B csoportban elegendő mennyiségű hasznos mikroorganizmus, valamint probiotikus LcS lesz az AFB1 adszorbeálására.

3. táblázat

Az AFM1 koncentrációja az aflatoxin által kiváltott patkányok vizeletében.

Paraméter: AFM1 (ng/ml) p érték

Csoport
B	0,39 ± 0,01	2. ábra ). Az A csoport vékonybél egészséges állapota (A.1) volt a szövettani megfigyelés alapján. 4 hétig tartó AFB1 kezelés után nagy karcinómát figyeltek meg az AFB1 kezelt csoport vékonybélében (C.1). Hasonló karcinómát figyeltek meg a B csoportban (B.1), de a carcinoma növekedése kisebb volt, és kisebb volt a mérete a C csoporthoz képest. A vastagbélben limfociták felhalmozódását figyelték meg mind az AFB1-vel kezelt (C.2), mind a probiotikumban./AFB1-kezelt (B.2) csoportok. A limfociták felhalmozódása a gyulladás előfordulását jelzi. A karcinóma növekedése azonban csak az AFB1-vel kezelt csoportban található meg (C.2). Az eredmények bemutatták az AFB1 negatív hatásait a vékonybél és a vastagbél felé, míg az ilyen hatásokat az LcS-kezelés nagymértékben megfordíthatja. Az AFB1 általában a májrákhoz kapcsolódik. Ebben a tanulmányban azonban nem találtak változást a H&E festett májban a három különböző csoport (A.3, B.3 és C.3) között. Másrészt az immunrendszer diszfunkciója az AFB1 szennyezés egyik negatív hatása. Mégsem figyeltünk meg változásokat az összes csoport lépében (A.4., B.4. És C.4.).

A vékonybél (1), a vastagbél (2), a máj (3) és a lép (4) haematoxilin- és eozinfestése. A: csak magas fehérjetartalmú (HP), B: magas fehérjetartalmú, Lactobacillus casei Shirota és aflatoxin B1 (HP + LcS + AFB1), C: magas fehérjetartalmú és aflatoxin B1 (HP + AFB1). A vékonybélben tumorszerű növekedés (carcinoma) figyelhető meg a B és a C csoportban. A vastagbélben tumorszerű növekedés (carcinoma) és a limfociták felhalmozódása (gyulladás) figyelhető meg a C csoportban. A B csoport csak limfociták felhalmozódását mutatta. (gyulladás). A májban és a lépben azonban nem figyeltek meg elterjedt változásokat. A nyíl daganatszerű növekedést jelez; piros kör jelzi a limfociták felhalmozódását. n = 5.

4. Következtetés

Összességében ez a tanulmány megállapította, hogy az LcS képes volt megkötni az AFB1-et egy HP diéta után, és enyhítette az AFB1 testtömegre, valamint a máj és a vese működésére gyakorolt káros hatást. Ezenkívül az LcS fogyasztása a HP étrendben növelte az AFB1 metabolit kiválasztódását is, mivel az AFM1 nagymértékben csökkent a vizeletben. Ezt a vékonybélben és a vastagbélben bekövetkezett karcinóma előfordulásának csökkentésével igazolták az AFB1-gyel és LcS-vel etetett patkánycsoportban, összehasonlítva a csak AFB1-vel táplált patkányokkal. Ezt a vizsgálatot azonban korlátozta a normál étrend-csoport hiánya. Ezenkívül szélesebb körű kutatásra van szükség annak meghatározásához, hogy a fehérje különböző százaléka milyen hatással van az LcS és más probiotikumok azon képességére, hogy csökkentse az AFB1 negatív hatását, mivel ez a vizsgálat a patkányoknak csak 40% -os HP-étrendet biztosított. Különböző makrotápanyagok, például szénhidrátok és zsírok szintén hatással lehetnek a probiotikumok és az aflatoxin anyagcseréjére, ezért további vizsgálatokat indokolhatnak a probiotikumok, mint az aflatoxin adszorbensének hatékonyságának meghatározása érdekében.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a kutatást a Putra Research Grants finanszírozta a Malajziai Universiti Putra (UPM) [GP-IPS/2017/9517000 és GP-IPM/2016/9480100] részéről. Z. Nurul Adilah és Winnie-Pui-Pui Liew Graduate Research Fellowship (GRF) kedvezményezettjei az UPM Graduate Studies School-nak. Winnie-Pui-Pui Liew elismeri a malajziai Felsőoktatási Minisztériumot (MoHE) a MyBrain15 ösztöndíjért.

Összeférhetetlenség

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek összeférhetetlenségek.

A szerzők közreműködése

Z. Nurul Adilah és Winnie-Pui-Pui Liew elvégezték a kísérletet, elvégezték az adatok elemzését és megírták a kéziratot. S. Mohd Redzwan és I. Amin hozzájárultak a projekt technikai támogatásával és a végleges kézirat korrektúrájával.