A nagy szemű étrend hosszú távú táplálásának a laktató kecskéknek a tejzsírtermelésre és -összetételre gyakorolt ​​negatív hatásai a génexpresszió és a DNS-metiláció szabályozásával az emlőmirigyben

Absztrakt

Háttér

Köztudott, hogy a magas koncentrátumú (HC) étrend táplálása a szoptató kérődzők számára valószínűleg szubakut kérődző acidózist (SARA) okoz, és a tejzsírtermelés csökkenéséhez vezet. A HC-étrend hosszú ideig tartó táplálkozásának a tejzsírsav-összetételre és a tejzsír csökkenésének mechanizmusára gyakorolt ​​hatása még mindig kevéssé ismert. Ennek a tanulmánynak a célja az volt, hogy megvizsgálja a HC-étrend táplálásának a tejelő kecskéknek a tejzsír-hozamra és a zsírsavak összetételére gyakorolt ​​hatását, különös hangsúlyt fektetve a tejzsír-depresszió mögöttes mechanizmusokra. Tizenhét közepesen szoptató tejelő kecskét véletlenszerűen három csoportba soroltak. A kontroll kezelést alacsony koncentrátumú étrenddel táplálták (35% koncentrátum, n = 5, LC) és két magas koncentrátumú kezelés volt (65% koncentrátum, HC), az egyiket magas koncentrátumú étrenddel táplálták hosszú ideig (19 hét, n = 7, HL); az egyik magas koncentrátumú étrendet táplált rövid ideig (4 hét, n = 5, HS). Tejzsírtermelést és zsírsavprofilokat mértünk. A tejzsír-termelés és -összetétel változásainak hátterében álló mechanizmusok vizsgálatához elemeztük az emlőmirigy lipid-anyagcseréjében és DNS-metilációjában szerepet játszó génexpressziót is.

Eredmények

A tejtermelést növelte a HC-étrend táplálása a HS és HL csoportokban az LC-étrendhez képest (P

Háttér

A tej magas szintű tápanyagokat tartalmaz, például fehérjéket, zsírsavakat, foszfolipideket, vitaminokat és ásványi anyagokat [1]. Ezen tápanyagok közül a tejzsír fontos szerepet játszik a tejtermékek minőségének és energetikai összetételének meghatározásában [2]. A tejzsír nagy mennyiségben tartalmaz telített zsírsavakat (SFA) és telítetlen zsírsavakat (UFA). A közelmúltban a bizonyítékok azt mutatják, hogy a magas SFA-szintek potenciális kockázatot jelentenek az emberi egészségre, mint például a szív- és érrendszeri betegségek (CVD) [3]. Ezzel szemben epidemiológiai bizonyítékok utalnak arra, hogy az étkezési egyszeresen telítetlen zsírsavak (MUFA-k) és a többszörösen telítetlen zsírsavak (PUFA-k) jótékony hatással vannak a CVD megelőzésére, mivel kedvezően befolyásolják a CVD számos kockázati tényezőjét, beleértve a plazma lipideket és lipoproteineket. Például az olajsav védőhatással bír a retinopathia ellen [4]. Ehhez hasonlóan az eico-szapentaénsav (EPA) és a dokozahexaénsav (DHA) jótékony szerepet játszik a cukorbetegség, az érelmeszesedés és az ízületi gyulladás megelőzésében [5]. Számos stratégiát vizsgáltak a tej telítetlen zsírsavtartalmának növelésére [6,7,8].

Az intenzív termelési rendszerű tejelő állatok többségét magas mennyiségű gabonával etetik az energiafogyasztás és a tejtermelés maximalizálása érdekében. A nem strukturális szénhidrátok túlzott mennyisége és a nagyon erjedő takarmány azonban gyors erjedéshez és szerves savak felhalmozódásához vezet a bendőben [19], ami valószínűleg szubakut kérőskő acidózist (SARA) idéz elő [19, 20]. Az akut és a szubakut kérődző acidózis egyaránt csökkentheti a tejzsír termelését, és tejzsír depressziót és a zsírsavprofil elmozdulását okozhatja a szoptató teheneknél [20]. Tudomásunk szerint a magas koncentrátumú (HC) étrend hosszú távú (több mint 4 hónapos) táplálása a szoptató kérődzők számára a tejzsír termelésére és összetételére, valamint a tejzsír megváltozásának lényeges mechanizmusai még nem ismertek. Ebben a vizsgálatban a közepesen szoptató tejelő kecskéket HC-diétával táplálták hosszú (19 hét) vagy rövid (4 hét) ideig. Tejzsír- és FA-profilokat mértünk, és az emlőmirigy releváns génexpresszióját és DNS-metilációját értékeltük a tejzsír-termelés és -összetétel változásának hátterében álló mechanizmusok vizsgálatához.

Mód

Állatok és kísérleti eljárások

Tizenhét egészséges, közepesen szoptató kecskét (Guanzhong tejelő kecske, 60 ± 5 d. Laktáció), átlagos kezdeti testsúlya 49,7 ± 5,5 kg (átlag ± SD) és hasonló napi tejhozamot (1,18 ± 0,13 kg/nap) választottunk ki. és külön-külön elhelyezve (négyzetmérték: 3,0

3,2 m 2) az északnyugati A és F Egyetemen (Shanxi, Kína) egy szokásos takarmányházban. A kísérlet előtt minden kecske számára szabad hozzáférést biztosítottunk egy kontroll étrendhez, amely 2 hétig 65:35 takarmány-koncentrátum arányt tartalmazott. A kísérleti étrend összetevőit és kémiai összetételét az 1. kiegészítő fájlban mutatjuk be: S1. Táblázat. Az étrendi alkalmazkodás után a kecskéket véletlenszerűen három csoportba sorolták, és a napi tejhozam az egyes csoportokban a kísérlet megkezdése előtt nem mutatott szignifikáns különbséget, amint az az 1. ábrán látható (P > 0,05). A kontroll kezelést alacsony koncentrátumú étrenddel táplálták (35% koncentrátum, n = 5, LC), míg két magas koncentrátumú kezelés volt (65% koncentrátum, HC), az egyik magas koncentrátumú étrendet táplált hosszú ideig (19 hét, n = 7, HL), a másik pedig magas koncentrátumú étrendet táplált rövid ideig (4 hét, n = 5, HS) 15 hét alacsony koncentrátumú étrend után. Minden kecskét naponta 8: 00-kor és 18: 00-kor etettek, és etetés előtt naponta kétszer fejtek.

laktató

A tejhozam, a tejzsír és a fehérje változásai. a Napi tejhozam (kg/nap); b Tejzsírtartalom (%); c Tejfehérje-tartalom (%). A csillag * szignifikáns különbséget jelez a HL és az LC kontrollcsoport között

Mintagyűjtés és vizsgálat

A kísérlet végén a kecskéket egy éjszakai koplalás után eutanizálták. Valamennyi kecskét xilazin [0,5 mg/testtömeg kg; Xilozol; Ogris Pharme, Wels, Ausztria] és pentobarbitál [50 mg/testtömeg-kg; Kiadás; WDT, Garbsen, Németország]. Az eutanázia után az emlőmirigy szöveteinek egy részét összegyűjtötték és folyékony nitrogénben azonnal lefagyasztották, majd a teljes RNS, genomi DNS és fehérje kivonására használták fel.

Tejzsírsav-elemzés

A tejmintákat naponta kétszer gyűjtöttük, mielőtt etetnénk, 08: 00-kor, illetve 18: 00-kor. A tejmintákat alaposan összekevertük, és az egyik adagot 4 ° C-on tároltuk a tejzsír- és fehérje-elemzéshez, egy másikat -70 ° C-on tároltunk a zsírsav-összetétel elemzéséhez. A tejzsírsavak szintjét a Jiangsu Agrártudományi Akadémián a korábban leírt gázkromatográfia szabványos protokollja alapján állapítottuk meg [21].

RNS extrakció és valós idejű kvantitatív PCR

Western blot elemzés

DNS-metilációs vizsgálat

A genomi DNS-t az emlőmirigy szöveteiből extraháltuk kereskedelmi készlet segítségével (DP304, TIANGEN Biotech Co., LTD. Peking, Kína). Röviden, 100 mg emlőmirigyport inkubáltunk 1 ml lízispufferrel (pH 8,0, 50 mmol/l Tris; 100 mmol/L EDTA; 100 mmol/L NaCl; 1,0% SDS), amely fenolt, kloroformot és 50 μl proteináz K-t tartalmaz. (10 mg/ml törzs) 55 ° C-on 2 órán át, majd 5 percig 12 000 x g-vel centrifugáltuk. Körülbelül 500 μl felülúszót gyűjtöttünk össze, és 500 μl izopropil-alkohollal és 60 μl 3,0 mol/l nátrium-acetáttal (pH 5,2) inkubáltuk szobahőmérsékleten 5 percig, majd 12 000 fordulat/perc sebességgel 15 percig centrifugáltuk. Az üledéket kétszer mossuk 70% -os etanollal, szárítás után az üledéket végül TE pufferban (pH 8,0, 10 mmol/l Tris, 1 mmol/L EDTA) szuszpendáljuk. A mintákat 65 ° C-on, rázóvízfürdőben inkubáltuk 1 órán át a jó újraszuszpenzió biztosítása érdekében.

Az izolált genomi DNS-t ultrahanggal kezeltük, hogy véletlenszerű, 300-500 bp méretű fragmenseket állítsunk elő. Az ultrahangos feltételt a következő paraméterekkel állítottuk be: 30 W kimenő teljesítmény, 5 s impulzus be és 5 s impulzus kikapcsolva, 10 ciklus. Két mikrogramm szonikált genomi DNS-t hő denaturáltunk egyszálú DNS előállítására, és a denaturálatlan DNS ugyanolyan részét tároltuk kontroll (bemeneti) DNS-ként. A metilezett DNS-fragmenseket immun-kicsapta az egér 5-metil-citidin elleni monoklonális antitestje (ab10805, Abcam). Előzetesen megtisztított fehérje A/G plusz agarózt (Santa Cruz, Dallas, TX) alkalmaztunk az antitest/DNS komplexek immun-kicsapására, és a MeDIP DNS-t megtisztítottuk. Negyven nanogramm MeDIP DNS-t és kontroll bemeneti DNS-t használtunk a ACACA, SCD, FAS, ACSL1, ACSS1 & 2, FADS2 promóter régiók valós idejű PCR-rel specifikus primerekkel (2. táblázat). Az alapozókat a „Methyl Primer Express” szoftverével terveztük meg, a „http://www.ensembl.org/index.html” weboldalról robbantott CpG helyekkel dúsított specifikus promóter szekvenciát használva. Az immunprecipitált DNS és az input DNS arányát kiszámítottuk a metiláció relatív dúsulásának reprezentációjaként az adott mintában.

FAS enzimaktivitási vizsgálat

Az emlőmirigy szövetében a FAS enzimaktivitást a FAS-aktivitás vizsgálati készlettel (jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kína) mértük.

Statisztikai analízis

Minden adatot átlag ± SEM-ként adunk meg. A tejhozam és a tejösszetétel adatait PROC MIXED, SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) segítségével elemeztük a diétás kezelés, az időhatás és kölcsönhatásuk miatti különbségek szempontjából. A kezelés megkezdése előtt kapott tejhozam, tejzsír és fehérje adatait ko-változónak tekintették a statisztikai elemzés során. A zsírsavak összetételében, a gén és a fehérje expressziójában, valamint az emlőmirigyben végzett enzimaktivitásokban mutatkozó különbségeket post-hoc analízissel elemeztük, az SPSS 11.0 ANOVA-ját követő legkevésbé szignifikáns különbségteszt alkalmazásával. A valós idejű PCR adatok elemzéséhez a 2 -ΔΔCt módszert alkalmaztuk. A különbségeket jelentősnek tekintették a P

Eredmények

Tejhozam, valamint tejfehérje és zsírtermelés

Amint az az 1a-c. Ábrán látható, a magas kéntartalmú étrenddel (HL és HS csoport) táplált kecskék (P 0,05). A telített zsírsavak (SFA) tartalma a tejben tendenciát mutat a HL-csoportban az LC-csoporthoz képest (0,05 3. táblázat Zsírsav-összetétel a tejzsírban

A tejzsír termelésében szerepet játszó gén expresszió

Amint a 2. ábrán látható, HC-étrend etetése a tejelő kecskéknek a tejzsírtermelésben részt vevő gének expressziójának szabályozása az emlőmirigyben. A zsírsavtranszport folyamatát tekintve a LPL, ACSL1, ACSS1 és ACSS2 gének alacsonyabbak voltak a HL kecskék emlőmirigyében (P 0,05).

Fehérje expresszió és FAS enzimaktivitás

Az ACSL1 és az SCD fehérje expressziójának szintjét az emlőmirigyben Western blot módszerrel határoztuk meg. Az eredmények azt mutatták, hogy az ACSL1 fehérje expresszió szintje az emlőmirigyben HC diéta táplálásával csökkent (P 0,05). A FAS enzim aktivitása szintén csökkent a HL kecskékben az LC csoporthoz képest (P 0,05) (3. ábra).

DNS-metilációs elemzés

Az emlőmirigy tejzsírtermelésében szerepet játszó génexpresszió csökkenése miatt a kódoló gének promoter régióiban a DNS metilációjának szintjét MeDIP módszerrel mértük. Az eredmények azt mutatták, hogy a DNS metilációja a SCD és ACACA gének nagyobbak voltak a HL kecskék emlőmirigyében az LC csoporthoz képest (P 0,05) (4. ábra).

Vita

A magas tejtermelés energiaigényének kielégítése érdekében a tejelő állatokat általában HC-étrenddel táplálják, ami valószínűleg rendellenes fermentációt okoz a bendőben, és anyagcserezavarokhoz vezet, amelyek SARA néven ismertek. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a korai laktáció 19% -a és a laktáció közepén lévő tehenek 26% -a tapasztalta SARA-t [23]. A SARA-ban szenvedő szoptató állatoknál fokozott a hasmenés, a laminitis és a gyulladásos válaszok kockázata [24, 25]. Ez a széles körben alkalmazott takarmányozási stratégia végül a tejminőség csökkenéséhez vezet alacsonyabb tejzsírmennyiség mellett [25,26,27]. Ebben a tanulmányban, amint azt a gyakorlatban megállapítottuk, eredményeink azt mutatták, hogy a tejtermelés jelentősen megnőtt a HC-étrend táplálásával mind a HL, mind a HS csoportokban az LC csoporthoz képest, míg a tejzsír százalékos aránya lényegesen alacsonyabb volt a HL csoportban. Egy korábbi tanulmány azt is kimutatta, hogy a magas szemű étrend takarmányozása a szoptató tejelő teheneknek alacsonyabb tejzsír-koncentrációjú tejzsír-depresszióhoz vezetett.

Következtetések

A HC-étrend rövid távú táplálása kicsi hatást gyakorolt ​​a tejelő kecskék tejzsírtermelésére és összetételére. A HC-diéta hosszú távú táplálása azonban alacsonyabb MUFA-kkal, de magasabb SFA-kkal tejzsír-depressziót és FA-profil-váltást vált ki. A lipidtermelés folyamatában szerepet játszó génexpresszió visszaszorítása és az emlőmirigyben a DNS-metiláció újraszabályozása hozzájárulhat a HL kecskék tejzsírtermelésének csökkenéséhez.