A magas kalóriatartalmú étrend hatása az intesztinális flórára LPS által kiváltott tüdőgyulladásos patkányokban

Chen Bai

Pekingi Kínai Orvostudományi Egyetem, ChaoYang körzet, Peking, 100029 Kína

Tiegang Liu

Pekingi Kínai Orvostudományi Egyetem, ChaoYang körzet, Peking, 100029 Kína

Jingnan Xu

Pekingi Kínai Orvostudományi Egyetem, ChaoYang körzet, Peking, 100029 Kína

Xueyan Ma

Pekingi Kínai Orvostudományi Egyetem, ChaoYang körzet, Peking, 100029 Kína

Ling Huang

Pekingi Kínai Orvostudományi Egyetem, ChaoYang körzet, Peking, 100029 Kína

Shaoyang Liu

Pekingi Kínai Orvostudományi Egyetem, ChaoYang körzet, Peking, 100029 Kína

Ő Yu

Pekingi Kínai Orvostudományi Egyetem, ChaoYang körzet, Peking, 100029 Kína

Jianxin Chen

Pekingi Kínai Orvostudományi Egyetem, ChaoYang körzet, Peking, 100029 Kína

Xiaohong Gu

Pekingi Kínai Orvostudományi Egyetem, ChaoYang körzet, Peking, 100029 Kína

Társított adatok

Absztrakt

Bevezetés

A hosszú távú, magas kalóriatartalmú étrend negatív szabályozó hatást gyakorol az egészségre. Tanulmányok kimutatták, hogy 1 magas kalóriatartalmú étrend súlyosbíthatja a tüdőgyulladás állapotát és késleltetheti a gyógyulást a légúti fertőző betegségek esetén. A modern élet ritmusának változásai változásokat okoztak a bélflóra szerkezetében 2, például étrendi egyensúlyhiányban 3, 4. Javasoljuk, hogy az étrendi összetétel megváltozása a bél belső ökoszisztémájának változását okozhatja 5. A légúti gyulladás gyógyulása vagy súlyosbodása a bélflóra felépítésével is összefügg. Például a „tüdő-bél tengelye” 6 hipotéziselmélete azt jelzi, hogy a légzőrendszer helyi gyulladásos reaktív anyagai és a bélflóra-anyagcsere termékei kicserélődnek és stimulálódnak a nyirokrendszeren és a vérkeringési rendszeren keresztül. Még mindig nem világos, hogy a magas kalóriatartalmú étrend bevitele súlyosbítja-e a bélflóra által befolyásolt légúti gyulladásos reakciót. Ez a tanulmány feltárta a magas kalóriatartalmú étrend potenciális hatását a bélflóra súlyosbító pneumonia patkányaira.

Anyagok és metódusok

Állatok és reagensek

Állatok: Tiszta minőségű SD patkányok, 40, hím, 4 hetesek, súlyuk 110 g ± 10 g. Állat-bizonyítvány száma: 11401500016361, a Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. által kiadott, engedély száma: SCXK (Jing) 2016-0002. A Pekingi Kínai Orvostudományi Egyetem Hagyományos Kínai Orvostudományi Intézetének állat-laboratóriumában tárolják, szabad hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez, a természetes fényhez.

Ebben a vizsgálatban az összes állatkísérletet a vonatkozó irányelveknek és előírásoknak megfelelően hajtották végre, és a Pekingi Hagyományos Kínai Orvostudományi Egyetem Állatetikai Felülvizsgálati Bizottsága jóváhagyta, jóváhagyási számával (Állat laboratóriumi etikai vizsga száma): BUCM-4-20170901 -3034.

Házi takarmány: a rakott, csokoládé ostya, marhaszem és liszt arányának 1: 2: 2: 1 aránya szerint a forma megegyezik a közönséges takarmánnyal, és a Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. felelős a szokásos gyártásért, ill. minőségellenőrzés, lásd az 1. táblázatot .

Asztal 1

Házi takarmány-összetevők és táplálkozási összehasonlító táblázat.

Házi készítésű speciális feedRat fenntartó takarmány

Energia, kilojoule/100 g	1828.12	340
Nedvesség	10,10%	≤10%
Nyers fehérje	13,73%	≥18%
Nyers zsír	16,10%	≥4%
Szénhidrát	58,80%	-
nátrium	0,44%	-
Nyersrost	Nem található	≤5%
Nyers hamu	0,83%	≤8%
kalcium	Nem található	1

Reagensek: Motilin ELISA készlet (Wuhan Huamei, CSB-E08208r), Gastrin ELISA készlet (Wuhan Huamei, CSB-E12743r), Patkány egyfaktoros detektáló készlet (Rat IL-6), Patkány egy faktoros detektáló készlet (Rat TNF-α), GRO alfa/KC/CINC1, IL-12 p40, egér/patkány alapkészlet, NF-KB primer antitest (CST, 8242), MyD88 (Abeam, ab2064), MD2 (Abcam, ab24182), β -aktin (CST, 4970 S), szekunder antitest segédreagens 042-206.

Állati takarmányozás és anyaggyűjtés

2. táblázat

Állatkezelési módszerek.

GroupFull név és rövidítésQuantityFeedAtomization

normál kontrollcsoport	normál vezérlés, NC	10.	Normál	tiszta víz
magas kalóriatartalmú étrend csoport	1. modellvezérlés, MC1	10.	házi	tiszta víz
tüdőgyulladás csoport	2. modellvezérlés, MC2	10.	Normál	LPS
magas kalóriatartalmú étrend tüdőgyulladással kombinálva	modell vezérlés 3, MC3	10.	házi	LPS

A jel észlelése

Minden reggel, mielőtt a modellt elvégezték (anyagokat vettek fel), a patkányokat megmérték az adott napra vonatkozó tömegadatokként. A patkány derekának természetes kerülete a kerülete. A patkány bal mellső hónalj és a végbél hőmérsékletét infravörös hőmérsékleti mérőeszközzel mértük. Vegyük egy bizonyos szervtömeg és a patkányok testtömegének arányát, vagyis a szerv-test arányt. A képlet:

A szövetek vizsgálata

A bélszövet és a tüdőszövet keresztirányú metszeteit a szövetviasz blokk-szelet-HE festés előállításának szokásos eljárása szerint készítettük el. A szérum motilint és a gasztrint ELISA módszerrel detektáltuk; a szérum gyulladásos faktorokat Aimplex módszerrel kezeltük a reagens utasításainak megfelelően. Egyszerű Western technika alkalmazásával először a minta fehérjetartalmát detektálták, majd szimulálták a Western sávot.

Mikroökológiai kimutatás a béltartalomban

Először a mintában lévő mikrobiális DNS-szekvenciát detektáltuk; Az OTU osztályozást és a biológiai osztályozási szintet adatbázis alapján azonosítottuk. A csoportosítási eredmény szerint klaszterelemzést és csoportkülönbség-elemzést végeznek, és releváns statisztikai diagramokat készítettek. Végül a gyulladásos tényezők eredményei alapján korrelációanalízist hajtottak végre a flóra és a gyulladás között, valamint elvégezték a flóra funkció annotációjának útvonal-elemzését.

Bioinformatikai kutatások

Először is, a Polysearch2 (http://polysearch.cs.ualberta.ca/) menüben válassza a „megadott” szöveget, a „Minden társított keresése” lehetőséget a „gének/fehérjék” elemet, és írja be a „magas kalóriatartalmú” kifejezést a lekérdezés kulcsszavába, és kattintson a „Gyorskeresés” gombra, és mentse el az eredményt; írja be a „Pneumoniia” kifejezést a Query Key kulcsszóba, majd kattintson a „Quick Search” gombra, és mentse az eredményt. A magas kalóriatartalmú és a tüdőgyulladás génjeinek kombinálásához kattintson a „keresés” gombra a karaktersorozatban (https://string-db.org/), majd válassza a bal oldalon a „Több fehérje” lehetőséget, és írja be a konszenzus gént a Névjegyzékbe, majd kattintson a „Keresés” és „folytatás”, fehérje kölcsönhatás. A kapcsolat táblázatot importáltuk a Cytoscape-be (V3.6.0), és az „MCODE” plugint használtuk a fehérje interakciós hálózat elemzésére. A David (V6.7) (https://david-d.ncifcrf.gov/) adatbázisban kattintson az „Aanlysis indítása” elemre, hogy az MCODE elemzésből beírja a törzshálózat génszekvenciáját a listába, majd válassza az „office gén szimbólum” és a „ Génlista ”, majd kattintson a„ Lista elküldése ”gombra. Válassza ki a „homo sapiens” fajt, majd kattintson a „Funkcionális kommentár diagram” elemre, várjon egy pillanatra, és válassza az KEGG_PATHWAY elemet az Útvonalakban az útgazdagodás elemzéséhez.

Eredmények

Az állatok általános helyzete

A magas kalóriatartalmú és tüdőgyulladásos patkányok fizikai tüneteinek változásai. (A) Súly, (B) hasi kerület, (C) rektális hőmérséklet, (D) hónaljhőmérséklet, (E) szervi együttható, (F) tüdő.

A szérum gyulladásos tényezői és a bélminta felismerő receptor fehérje

Magas kalóriatartalmú és tüdőgyulladásos patkányok szöveteinek változásai. (A) A bél és a tüdő HE festése; (B) szérum motilin, gasztrin; (C) szérum gyulladásos faktor; (D) útvonalfehérje felismerési receptora a bélszöveti mintázatban. Balról jobbra: NC, MC1, MC2, MC3.

A kísérlet után a gasztrin minden csoportban egyenlőtlen volt, és a különbség statisztikailag szignifikáns volt (2B. Ábra); az egyes csoportokban a Kc nem volt egyenlő, és a különbség statisztikailag szignifikáns volt (2C. ábra). Az NC csoporthoz képest az MD2 expresszió csökkent az MC2 csoportban; az MC1 csoporthoz képest a TLR9 expresszió növekedett az MC3 csoportban, és a különbség statisztikailag szignifikáns volt (2D. ábra).

A bélflóra szerkezete

40 mintaszekvenálást végeztünk az Illumina MiSeq platform alapján, és a szekvenálás hossza főként 400–500 bp tartományban oszlott el (3A. Ábra). A Venn-grafikon eredményei azt mutatták, hogy négy csoportnak összesen 1926 OTU-ja van. Közülük 109 van az NC csoportban, 106 az MC1 csoportban, 93 az MC2 csoportban és 60 az MC3 csoportban (3B. Ábra). A Rarefaction, a fajok felhalmozási görbéi és a bőség regisztrációs görbéi általában stabilak voltak, ami azt jelezte, hogy a jelenlegi eredmények elegendőek az aktuális minta sokféleségének tükrözésére, és az átlagos fok elég magas (3C. Ábra, E).

A béltartalom mikroökológiájának OTU felosztása. (A) Szekvenciahossz eloszlás; (B) A megosztott OTU Venn-diagramja; (C) ritka görbe OTU szám; (D) a specaccum fajok felhalmozási görbéje; (E) bőség fokozatú görbe; (F) az egyes besorolási szintek mikrobiális számának statisztikája.

A béltartalom mikroökológiai felépítése. (A) Csoportok közötti különbségek osztályozási egység megjelenítése térkép az osztályozási szintfa alapján (NC-MC1); (B) csoportok közötti különbség osztályozási egység megjelenítése térkép az osztályozási szintfa alapján (NC-MC2); (C) csoportok közötti különbségek osztályozási egység megjelenítése térkép az osztályozási szintfa alapján (NC-MC3); (D) csoportok közötti különbség osztályozási egység megjelenítése térkép az osztályozási szintfa alapján (MC1-MC3); (E) csoportok közötti különbség osztályozási egység megjelenítése térkép az osztályozási szintfa alapján (MC2-MC3); (F) általános osztályozási szintfa diagram a GrabhlAn minta alapján.

A PCA főkomponens elemzése azt mutatta, hogy az MC2 és NC csoportok elosztási struktúrája az űrben közelebb van; míg az MC3 és az MC1 különböző irányú trendeloszlás volt (5A. ábra). A PCoA fő koordináta-analízise azt a különbséget mutatta, hogy a minták között az MC3 és az MC1 különböző szögekben diszkrétálódott (Súlyozatlan UniFrac, 5B. Ábra); Az MC3 inkább diszperziós (Súlyozott UniFrac, 5C. Ábra). A PLS-DA részleges legkisebb négyzetek diszkriminációjának elemzése azt mutatta, hogy az NC csoport és az MC1 csoport egybeeső része nagyobb volt, mint a független részé; az NC csoport, az MC2 csoport és az MC3 csoport egybeesési része kisebb volt, mint a független részé; az MC1 csoport és az MC3 csoport egybeesési része kisebb volt, mint a független részé; az MC2 csoport és az MC3 csoport egybeesési része kisebb, mint a független részé, ami arra utal, hogy az osztályozási modell jól működik (5D. ábra).

A béltartalom mikroökológiai tényezői. (A) A PCA-elemzés háromdimenziós rendezési térképmintái; (B) súlyozatlan UniFrac PCoA elemzés háromdimenziós válogatási térképmintái; (C) háromdimenziós válogatási térképminták a súlyozott UniFrac PCoA elemzésből; (D) PLS-DA diszkrimináns elemzési diagram; (E) RDA kényszer válogatási diagram; (F) a domináns nemzetség társított hálózati diagramja.

A bélflóra működése

A tesztelt mikrobiális genom 16S rRNS génjének teljes hosszúságú szekvenciája alapján, és a Greengenes 16S rRNS gén teljes hosszúságú szekvencia adatbázisára hivatkozott a flóra metabolikus funkciójának előrejelzésére. A KEGG metabolikus előrejelzése azt mutatta, hogy az egyes funkciók magasabb átlagos relatív bősége az egyes mintacsoportokban az energia metabolizmus, a szénhidrát metabolizmus és az aminosav metabolizmus volt (6A. Ábra). A Venn-grafikon eredményei azt mutatták, hogy 4774 közös funkció volt négy csoportban. Közülük az NC csoportban 68, az MC1 csoportban 22, az MC2 csoportban 33 és az MC3 csoportban 184 volt (6B. Ábra). Az ábra eredményei azt is megmutatták, hogy a flórabőség különféle tendenciákat mutatott, miután külön-külön kombinálták a magas kalóriatartalmú étrend és az LPS porlasztás két tényezőjét (6C. Ábra).

A béltartalom metabolikus funkciójának előrejelzése. (A) A KEGG második szintjének eloszlási diagramja a KERUSt által; (B) Venn térképe a közös funkciócsoportról; C: KEGG ortológ génfürt (KO) mennyiségi hőtérkép, klaszteranalízissel kombinálva.

Biológiai hálózat kiépítése

Ez a tanulmány megállapította, hogy a „Magas kalóriatartalmú” 14 gén és a „Tüdőgyulladással” összefüggő 22 gén (lásd a kiegészítő adatokat) kettős duplikációjának felszámolása 35 gén volt, amelyek 56 fehérje kölcsönhatás-készletet tartalmaznak (7A. Ábra). A klaszterezés után egy csoport klasztert kaptunk (7B. Ábra). Dúsítás után két rokon utat kaptunk, nevezetesen a bél immunhálózatát az IgA termeléséhez és a NOD-szerű receptor jelátviteli utat (7C. Ábra, D).

A magas kalóriatartalmú étrend patológiás biológiai hálózat kiépítése tüdőgyulladással kombinálva. (A) Fehérje kölcsönhatás sztring elemzés alapján; (B) klaszter az mcode elemzés alapján (pontszám = 6,75, a dúsítás arányos a csomópont árnyékolásával); (C) A bél immunhálózatának gazdagítási eredménye az IgA termelési útvonalán (a vörös csillag dúsító fehérje, a fehérje dúsulás mértéke fordítottan arányos a színárnyalattal); (D) A NOD-szerű receptor jelátviteli út dúsítási eredményei (a vörös csillag dúsító fehérje, a fehérje dúsulás mértéke fordítottan arányos a színárnyalattal).

Vita

A gyermekkori tüdőgyulladás gyakori betegség a gyermekek légzőrendszerében, nagy gyakorisággal. Egyes területeken még a csecsemők és a gyermekek halálának is az egyik fontos oka. A társadalmi haladás és az életmód megváltozásával a rossz étkezési szokások az olyan betegségek egyik fontos okává váltak, mint a légúti fertőzések.

A magas kalóriatartalmú étrend befolyásolja-e a bélflóra révén a légúti fertőzéseket.

A bélflóra befolyásolta a gazda szisztémás immunitását, például a helyi környezet mikrobiális populációs szerkezetének megváltozását, amely befolyásolhatja a disztális szervek immunfunkcióit. Abt M C és mtsai. 21 rámutatott, hogy a dysbacteriosis egerek vírusellenes veleszületett és adaptív immunválaszai károsodtak, és az influenza vírusfertőzés után elhúzódott a vírus eltávolításának ideje. Az egerek makrofághiányos expressziója az I. és II. Típusú interferonokkal csökkentette a vírusreplikáció korlátozásának képességét. Schuijt TJ et al. 22 megállapította, hogy a C57BL/6 egerek a bélflóra gyorsabb terjedése után súlyos gyulladással és szervi elégtelenséggel, valamint a Streptococcus pneumoniae fertőzés utáni megnövekedett mortalitással járnak, és gyengítik az alveoláris makrofágok elnyelését, és csökkentik a lipopoliszacharidra adott választ. Javasoljuk, hogy a bélflóra védő tényező lehet a gazdaszervezet számára, hogy ellenálljon a pneumococcus betegségnek.

Az élet összetett és dinamikus rendszer. Nehéz szabályozni a globális vagy alapvető mechanizmusokat egy hagyományos kóros folyamat kvantitatív vagy kvalitatív tanulmányozásához hagyományos orvosbiológiai kutatási módszerek alkalmazásával. Bioinformatika és egyéb biológiai hálózatok, például a bél immunhálózata az IgA termeléséhez és a NOD-szerű receptor szignál útvonalak, amelyeket ebben a tanulmányban bemutattunk, amelyek fontos patológiás mechanizmusok lehetnek a magas kalóriatartalmú étrendben, tüdőgyulladással kombinálva. Ezt azonban még kísérletekkel kell ellenőrizni. Ezenkívül egyes kiegészítő hagyományos gyógyszerek, mint például a kínai orvoslás, egyedülálló ötletekkel rendelkeznek a kapcsolódó betegségekről. A TCM elméletén alapuló prospektív kohorszvizsgálat 23 azt mutatta, hogy a gyomor-bélrendszeri melegben szenvedő gyermekek hajlamosabbak lehetnek a légúti fertőzésekre, ahol a széklet szárazsága és a testtömeg-index pozitívan/negatívan kapcsolódik a visszatérő légúti fertőzésekhez. A kínai orvoslás hőszindrómájának szindróma-differenciálási rendszere és az étrend felépítése, valamint a légúti fertőzésre gyakorolt hatás közötti kapcsolat felhasználható belépési pontként vagy áttörési pontként további kutatásokhoz.

Összefoglalva, a magas kalóriatartalmú étrend pneumonia modelljének mikroökológiai vizsgálata az első jelentés a tüdőgyulladás-belek mikroökológiai vizsgálatáról, amely táplálkozási tényezőkön alapszik. Tekintettel a táplálkozási struktúra összetettségére, amelyet a különböző régiók, fajok, nemek, életmód stb. Okoznak, ez a tanulmány megalapozta az étrend légúti fertőzésekre gyakorolt hatásainak további vizsgálatát, valamint a bélflóra mint patogenezis/terápiás célpont hotspot-vizsgálatát. Eközben nagy jelentősége van az étrendi szerkezet javításának és az antibiotikumok fertőzéssel történő helyettesítésének további kutatásában.