A magas zsírtartalmú étrend bevitele különböző ford a zsírsavszintek differenciáltan indukálják az oxidatív stresszt és az alkoholmentes zsírmájbetegséget (NAFLD) patkányokban

Absztrakt

Háttér

Ford-a zsírsavak (TFA) a koszorúér-megbetegedések, az inzulinrezisztencia és az elhízás, valamint a szisztémás gyulladás, a metabolikus szindróma jellemzői kockázati tényezőként ismertek. Kevéssé ismert a lipidek által a májra gyakorolt hatásokról, és kevés tanulmány foglalkozik a TFA-ban gazdag ételek májfunkciókra és oxidatív stresszre gyakorolt hatásával is. Ez a tanulmány azt vizsgálja, hogy a magas zsírtartalmú étrend különböző TFA-szinttel indukálja-e az oxidatív stresszt és a máj diszfunkcióját patkányokban.

Mód

A hím Wistar patkányokat véletlenszerűen négy csoportra osztottuk (n = 12/csoport): C-ben standard-chow; A magas zsírtartalmú étrenddel ellátott kísérleti csoportok között 20% friss szójaolaj-étrend (FSO), 20% oxidált szójaolaj-étrend (OSO) és 20% margarin-diéta (MG) szerepelt. Mindegyik csoportot 4 hétig tartottuk a kezelésen.

Eredmények

Májkárosodást figyeltek meg a magas zsírtartalmú étrenddel etetett patkányokban a máj lipidperoxidációjának növekedésével és a máj antioxidáns enzim aktivitásának csökkenésével (szuperoxid-dismutáz, kataláz és glutation-peroxidáz). Az oxidált olaj bevitele magasabb lipidperoxidáció szintet és alacsonyabb plazma antioxidáns koncentrációt eredményezett az FSO-val táplált patkányokhoz képest. A májban a magasabb gyulladásos választ MG diéta indukálta. Az OSO és az MG csoport májszövettani kórképei közepesen súlyos vagy súlyos citoplazma vakuolizációt, hypatocyta hipertrófiát, hepatocyta ballonozást és necroinflammációt mutattak.

Következtetés

Úgy tűnik, hogy szoros összefüggés van az oxidált olajokban a TFA fogyasztása és a lipidperoxidáció, valamint az alkoholmentes zsírmáj betegség (NAFLD) között. A májban a peroxidatív események mértéke szintén eltérő volt a zsírforrástól függően, ami arra utal, hogy a magasabb TFA-szinttel rendelkező margarin táplálása a szervezet számára az oxidatív stressz közvetlen forrását jelentheti. Ez a tanulmány bizonyítékot szolgáltat a TFA közvetlen hatására a NAFLD-re.

Háttér

Megvizsgáltuk, hogy a különböző zsírtartalmú étrend (friss szójaolaj, oxidált szójababolaj és margarin) eltérő TFA-szinttel indukálja-e az oxidatív stresszt és a NAFLD-t patkányokban.

Anyagok és metódusok

A kiegészített étrendi zsír analitikai meghatározása

A szójaolajat és a margarint egy helyi szupermarketben vásárolták. A hőoxidált olajat úgy állítottuk elő, hogy szójaolajat 24 órán át 200 ° C-on kemencében állítottunk elő. A lipidperoxidáció mértékét úgy határoztuk meg, hogy megvizsgáltuk a peroxid értékét és az UV abszorbanciát 232 és 270 nm-nél (k232 és k270) és a p-anizidin értéket az Európai Hivatalos Módszerek (EEC 2568/91) szerint [26]. az oxidatív stabilitás indexet (OSI) a Rancimat készülékkel (Mod. 743, Metrohm Ω, Svájc) értékeltük 3 g 120 ° C-ra felmelegített olaj és 20 L/h légáramlás mellett [27]. Az eredményeket indukciós időként fejeztük ki a hidroperoxidok bomlásának órájában.

Zsírsavprofil meghatározása

Az olajmintákból zsírsav-metil-észtereket (FAME) állítottunk elő Issaoui és mtsai. [28]. Az egyes FAME-ket gázkromatográfiával különítettük el és kvantifikáltuk lángionizációs detektorral felszerelt 5890-es sorozatú II sorozatú műszerrel (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) és a DB-23 (60 m hosszúságú, 0,32 mm id és 0,25 μm filmvastagság; HP-Agilent Technologies, Wilmington).

Antiradikális aktivitás meghatározása

A "stabil" szabadgyök 2,2-difenil-1-pikril-hidrazil (DPPH) elszívásának képességét Ramadan és Morsel módszerével ellenőriztük [29]. Az oldatot 60 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, és az abszorbancia csökkenését 515 nm-en 1, 30 és 60 perc múlva UV-látható spektrofotométerrel (Perkin Elmer Lambda 25) határoztuk meg.

Állatkezelés

A májfunkciók biokémiai elemzése

A szérum lúgos foszfatáz (ALP) aszpartát transzamináz (AST), az alanin transzamináz (ALT) és a laktát dehidrogenáz (LDH) aktivitását spektrofotometriásan határoztuk meg a Randox Laboratories (Ardmore, Észak-Írország, Egyesült Királyság) által forgalmazott kereskedelmi diagnosztikai készletekkel.

A TBARS-szintek mérése

Buege és Aust [30] szerint a lipidperoxidációt tiobarbitursav-reaktív anyagok (TBARS) mérésével becsülték meg, és malondialdehid (MDA) tartalomban fejezték ki. A vizsgálathoz 125 μl felülúszót (S1) összekevertünk 50 μl fiziológiás sóoldattal (PBS, PH 7.4), 125 μl 20% triklór-ecetsavval, amely 1% butil-hidroxi-toluolt tartalmaz, és centrifugáltuk (1000 g, 10 perc, 4 ° C). Ezután 200 μl felülúszót (S2) összekevertünk 40 μl sósavval (0,6 M) és 160 μl trisz-tiobarbitursavval (120 mM), és az elegyet 80 ° C-on 10 percig melegítettük. Az abszorbanciát 530 nm-en mértük. A TBARS mennyiségét 1,56 × 10-5 M -1 cm-1 extinkciós együtthatóval számoltuk, és nmol MDA/mg fehérjében fejeztük ki.

Konjugált diének mérése

A konjugált diéneket Recknagel és Ghoshal módszerével határoztuk meg [31]. A szöveti homogenizátum egy részét kloroform/metanol 2: 1 arányú keverékébe helyeztük. Az egész elegyet vortexeljük és 2500 g-nál centrifugáljuk. A felső réteget kloroform/metanol/víz eleggyel mossuk és centrifugáljuk. Az alsó réteget az első alsó réteggel egyesítettük, és N2 atmoszférában bepároltuk. Az extraktumot újra feloldjuk 1 ml ciklohexánban. Az abszorbanciát 233 nm-en határoztuk meg. 2,52 × 104 mól -1 extinkciós együtthatót alkalmaztunk. Az eredményeket mmól mg-1 fehérjében fejeztük ki.

Máj antioxidáns enzimek aktivitása

A máj-homogenátum szuperoxid-diszmutáz (SOD) aktivitását spektrofotometriásan vizsgáltuk Beyer és Fridovich leírása szerint [32]. Ez a módszer a SOD azon képességén alapul, hogy gátolja a nitroblue tetrazolium (NBT) oxidációját. A SOD egy egysége azt az enzimmennyiséget jelenti, amely szükséges az NBT oxidációs sebességének 50% -os gátlásához 25 ° C-on. Az aktivitást egység/mg fehérje értékben fejeztük ki.

A kataláz (CAT) aktivitást 20 ° C-on mértük Aebi módszerének kissé módosított változatával [33]. A hidrogén-peroxid (H2O2) CAT enzim általi bomlását kinetikusan követtük 240 nm-en. A CAT aktivitás meghatározásához 0,043 mM -1 cm-1 moláris extinkciós együtthatót alkalmaztunk. Egy aktivitási egység megegyezik a percenként lebontott H2O2 mikromoljával/milligramm fehérje.

A glutation-peroxidáz aktivitást (GPx) Flohe és Gunzler módszerével vizsgáltuk [34]. Az aktivitást mmol oxidált GSH/perc/mg fehérje formájában fejeztük ki 25 ° C-on.

Fehérje vizsgálat

A máj fehérje koncentrációját Bradford módszerével [35] határoztuk meg, szarvasmarha szérum albumint használva standardként.

Statisztikai analízis

Az adatokat elemeztük a Statistics Package for Social Sciences (SPSS) programmal, a Windows 11.0 kiadásával (SPSS, Chicago, IL, USA). Minden egyes vizsgálatban a kísérleti adatok 12 független vizsgálat átlagát mutatják ± standard eltérések. Duncan tesztjét alkalmazták a különböző csoportok közötti jelentős különbségek meghatározására. A statisztikai szignifikancia értéke: o

Eredmények és vita

Az étkezési zsír analitikai paraméterei

Az alkalmazott étkezési zsír analitikai paramétereit az 1. táblázat mutatja. Nagyon fontos értékelni a zsírok és olajok oxidatív lebomlását, mert a szabad gyökök által elindított oxidáció a zsírokban és olajokban az avasodás egyik fő oka, ami a főbb minőség-ellenőrzési változók, például szín, íz, aroma és tápérték módosulása [36]. A termikusan oxidált szójaolaj (OSO) minták összetétele különbözött a friss szójaolajtól (FSO), magas peroxid-, konjugált dién- és p-anizidin-értékkel (1. táblázat) és az oxidatív stabilitás jelentős csökkenésével (3,74). vs.. 0,67 óra), illetve antiradikális kapacitás (93,12 vs. 55,16%), ill.o 1. táblázat A magas zsírtartalmú étrend zsírsavösszetételének (%), lipidperoxidációs paramétereinek és antiradikális tulajdonságainak átlagértékei (friss szójaolaj, FSO; oxidált szójaolaj, OSO és margarin, MG)

Ami a zsírsav (FA) összetételt illeti, amint azt az 1. táblázat mutatja, az FSO-t és az OSO-t magas szintű többszörösen telítetlen zsírsav (PUFA) frakció jelenléte jellemezte, jelentős (o 2% FSO, OSO és MG étrendben (1. ábra). Ezenkívül az izomer típus is különbözik a túlsúlytól ford-18: 2 olajokban és ford-18: 1 n-9 MG-ben. A TFA-fogyasztás biomarkereit használó megfigyelési vizsgálatok során úgy tűnik, hogy a 18: 1 és a 18: 2 izomerek is hozzájárulnak a CVD kockázatához [41].

A patkányok növekedése és tápláltsági állapota

A legtöbb patkány a négyhetes étrendi kezelések során folyamatosan hízott. Az átlagos testtömeg-növekedés a négy hét végén 16,4 g volt a kontroll állatokban, 24,55, 20,33 és 25,83 g FSO-vel táplált, OSO-val táplált és MG-vel táplált patkányokban (2. táblázat). Négy hetes etetés után a magas zsírtartalmú táplált patkányok testtömeg-növekedése statisztikailag nem volt szignifikáns (2. táblázat). Az OSO-táplálékkal etetett patkányok takarmányozási hatékonysága alacsonyabb volt, mint az FSO-vel táplált patkányoké. Ez azzal magyarázható, hogy szinte az összes aminosav reagál az oxidált lipidek primer és szekunder termékeivel, ezáltal csökken a fehérje, aminosavak és zsírok emésztési hasznosulása, ami befolyásolhatja a súlygyarapodást [42]. Másrészt az eredmények azt mutatták, hogy az FSO diéta szignifikánsan növelte az abszolút májtömeget a kontroll csoporthoz képest. Az OSO és az MG csoportokban azonban nem figyeltek meg jelentős változásokat (2. táblázat).

A máj működésének biokémiai mutatói

A plazma hepato-specifikus enzimek, például az ALP és az LDH szintje jelentősen megnőtt (o 3. táblázat: A máj működésének biokémiai mutatói a kontrollban (C) és a magas zsírtartalmú kezelt patkányoknál friss szójaolajjal (FSO), oxidált szójaolajjal (OSO) és margarinnal (MG) táplált táplálékkal

A máj lipidperoxidációja

A kontroll csoporthoz képest egyértelmű bizonyítékot találtunk az FSO, OSO és MG-vel táplált patkányok máj lipidperoxidációjára, a konjugált diének (CD) termékek jelentősen magas tartalma alapján ítélve, tükrözve a lipidperoxidáció kezdeti szakaszát.

Másrészt, amikor megvizsgálták a lipidperoxidáció degradatív fázisát, tiobarbitursavval reagáló anyagokat (TBARS) vizsgálva, az FSO csoport MDA-szintje a C-csoporthoz képest 26,5% -kal nőtt (2. ábra). A magas zsírtartalmú táplált állatok májában a TBARS szignifikánsan emelkedett a kontroll patkányokhoz képest (o 2. ábra

Eredményeinkből kiderült, hogy a máj lipidperoxidációjának mértéke markánsan magasabb volt a margarinnal és az OSO-val táplált csoportokban, mint a friss olajjal táplált csoportban. Az OSO-val táplált csoport esetében azonban a CD-koncentráció szignifikánsan, 85% -kal, illetve 36% -kal növekedett a C- és FSO-csoportban. A lipidperoxidációs mérések eredményei megerősítik, hogy az antioxidáns kapacitás csökkenése és a TFA-k növekedése az OSO-ban befolyásolja a máj működését, ami arra utal, hogy az oxidált olaj táplálása a szervezet közvetlen oxidatív stresszforrását jelentheti. Pozitív korrelációt figyeltek meg az étrendben a teljes TFA-k szintje és a magas zsírtartalmú állatok táplált állatok májának TBARS-koncentrációja között (r = 0,84). Nagyon szignifikáns pozitív korrelációt figyeltek meg a patkány májának CD szintje között is ford PUFA patkány étrendben (r = 1,0; o - gyökök és H2O2, amelyek viszont hidroxilgyököket képeznek [58]. A SOD és a CAT aktivitása szignifikánsan csökkent az OSO csoportban, mint az FSO csoport (o 3. ábra

Szövettani kórképek

Szövettani szempontból a standard táplálékkal etetett patkányok májszakaszai normális morfológiai megjelenést mutattak (4a. Ábra). A kísérleti csoportok májjai egyértelmű különbséget mutattak a kontroll csoportétól. Az FSO-t tápláló csoportban a NALFD kezdeti fázisa, amelynek során a zsír felhalmozódik a májban (4b. Ábra, vékony nyíl). és a hepatocyták citoplazma vakuolizációját figyelték meg (4b. ábra, fekete háromszög). Amint arról korábban Samuhasaneeto beszámolt et al. [59], a százszázalékos zsírtartalmú étrend a zsírszövetből származó szabad zsírsav mozgósítását és a májsejtekbe történő transzportot okozta. Ezek az eredmények összhangban vannak a magas zsírtartalmú étrendnek a NAFLD korai stádiumának kiváltásában kifejtett hatásaira vonatkozó korábbi tanulmányokkal [59].

A magas zsírtartalmú étrend hatása különböző ford zsírsavszint a patkány máj szövettanán. Normális májszövettani aspektus kontrollból (H&E 32 ×). Panel (a) hatszögletű vagy ötszögletű lebenyből áll, központi vénákkal (CV) és perifériás májhármasokkal (HT), amelyek kötőszövetbe vannak ágyazva. A hepatociták a központi vénától sugárzóan futó trabeculákban vannak elrendezve, és Kuppfer-sejteket tartalmazó szinuszoidák (S) választják el őket. Kísérleti csoportok májai (H&E 100 ×): FSO panel (b): mérsékelt lipidfelhalmozódás tapasztalható sok hepatocitában; OSO panel (b); a citoplazma vakuolizációjának és a ballonizált hepatociták és az MG Panel (e) bősége; súlyos lipidfelhalmozódás a hepatocitákban és nagy számú ballonos májsejt. Citoplazma vakuolizáció a máj parenchymás sejtjeiben (vékony nyíl), hipertrofált hepatociták (fekete háromszög). Máj az OSO Panel (d) és az MG Panel (f) csoportokból (H&E 32 ×): degenerált hepatociták és nekrózis fotográfiája (vastag nyíl).

Következtetés

Összegzésképpen elmondható, hogy a patkányoknak négy hétig táplált oxidált étolajok lipidperoxidációt indukáltak a májban, ugyanazokkal az oxidálatlan olajokkal összehasonlítva. Úgy tűnik, hogy szoros kapcsolat áll fenn az oxidált olajokban lévő TFA-k fogyasztása és a lipid-peroxidáció között. A májban a peroxidatív események mértéke a zsírforrástól függően is eltérő volt, ami arra utal, hogy a magasabb TFA-szinttel rendelkező margarin táplálása a szervezet számára az oxidatív stressz közvetlen forrását jelentheti. Jelen tanulmány bizonyítékot szolgáltat a TFA-k közvetlen hatására a májműködési zavarokra, ami a máj lipid anyagcseréjének zavarait okozza, amelyek a NAFLD-t eredményezik, amely a kardiometabolikus szindróma kulcsfontosságú eleme. Ez arra utal, hogy a TFA-k befolyásolhatják a CVD kockázati tényezőit.