A magas zsírtartalmú étrend elősegíti az emlőmirigy myofibroblast differenciálódását a MicroRNS 140 downregulation révén

ABSZTRAKT

BEVEZETÉS

Az emlőstroma vaszkuláris frakciójában (SVF) található heterogén sejtpopuláció elengedhetetlen az extracelluláris mátrix (ECM) átalakításához és a betegség kialakulásához. Az emlő zsírszövetének fontossága ellenére meglepően keveset tudunk a normális szöveti homeosztázisról. Az SVF multipotens mesenchymális őssejtekből, elkötelezett progenitor sejtekből, fibroblasztokból, endoteliális sejtekből és immunsejtekből áll. Különböző hormonok, növekedési faktorok és külső tényezők hatása alatt a sztrómás vaszkuláris frakcióban lévő mesenchymális őssejtek (MSC) képesek sejttípusok sokaságára differenciálódni, beleértve az adipocitákat, kondrocitákat, oszteoblasztokat, fibroblasztokat és myofibroblastokat. Például, hogy az MSC-ket in vitro adipogén vonalakba kapcsolják, a peroxiszóma proliferátor által aktivált gamma receptorokat (PPARγ) és a C/EBPα-t a dexametazon, indometacin, inzulin és metil-izobutilxantin kombinációjával indukálják, míg az oszteoblasztok differenciálódásában a RUNX2 aszkorbát, csontmorfogenetikus fehérje, dexametazon és 1,25-dihidroxi-D3-vitamin keverékével aktiválják (1). Míg ezek a koktélok felhasználhatók differenciálódás kiváltására, a zsíros MSC-ket szabályozó komplex jelátviteli utak nem teljesen tisztázottak.

A fibroblasztok kritikus jelentőségűek az extracelluláris mátrix termelésében és fenntartásában az ECM fehérjék, köztük a fibronektin és a kollagén, valamint az ECM-t lebontó mátrix metalloproteinázok szekréciója révén. A normál ECM átalakításában betöltött szerepük mellett a fibroblasztok és aktivált formájuk, a miofibroblasztok a sebgyógyulási válasz kiemelkedő tagjai (2). Ezt a folyamatot a β1 (TGF-β1) növekedési faktor transzformálása jelzi. Amikor a TGF-β1 megköti receptorát, toboroz és foszforilez SMAD fehérjéket, beleértve az SMAD3-at is, amelyek ezután belépnek a sejtmagba, és transzkripciós faktorokként és kofaktorként működnek a célgének expressziójának aktiválása érdekében. A fibroblasztokban és a zsíros őssejtekben a TGF-β1 jelátvitel stimulálja a miofibroblasztokká történő differenciálódást, amely egy erősen kontraktilis és proliferatív sejttípus, amely magas szintű ECM fehérjéket termel (3, 4).

A myofibroblastok diszregulációja és a sebgyógyulás fibrózis kialakulását eredményezi, ami a hegszövet patogén felhalmozódása. A fibrózist számos szövetspecifikus fibrotikus betegség, köztük a tüdő (tüdőfibrózis [5], sugárzás okozta tüdőfibrózis [6, 7] és cisztás fibrózis [8]), a szív (endomyocardialis) vizsgálata jól jellemezte. fibrózis [9, 10]) és máj (cirrhosis [11]).

Az elhízás fokozza a myofibroblast differenciálódását az emlő zsírszövetében, elősegítve a mikrokörnyezet fibrotikus átalakulását és az emlőrák progresszióját (12). Az elhízás által kiváltott emlő zsírszövet miofibroblaszt differenciálódásának mechanizmusait azonban továbbra sem lehet tudni.

Az emlő zsírszövet nagyon érzékeny a környezeti és étrendi tényezők stimulációjára. Ha elhízás jelentkezik, a fokozott zsírraktározás az adipocitákat hiperpláziában és hipertrófiában éri. Ez elősegíti a zsírszövet hipoxiáját és gyulladását (13, 14), ami myofibroblast differenciálódáshoz vezet. Bár a mechanizmusok nem teljesen ismertek, a zsírszövet fibrotikus változásai összefüggenek az emlődaganat megindulásának és növekedésének fokozódásával (12, 15). A fibrózis fokozott ECM-merevséget eredményez, amelyről kimutatták, hogy aktiválja a mechanosignalizációt a Rho/ROCK jelátviteli utakon keresztül. A Rho/ROCK foszforilát fokális adhéziós kináz és az onkogén transzkripciós faktorok YAP/TAZ nukleáris transzlokációja elősegíti a kontrollálatlan proliferációt (16). Az étrend okozta elhízásról kimutatták, hogy közvetlenül befolyásolja az emlőmirigy szerkezetét is. A magas zsírtartalmú étrendű egerek emlőmirigyei szabályozatlan emlőcsatorna-fejlődést mutattak, csökkent elágazások, hiányos myoepithelialis bélés és fokozott ductalis kollagén-lerakódás (17).

Ebben a cikkben azzal a kritikus kérdéssel foglalkozunk, hogy a magas zsírtartalmú étrend miként szabályozza a miR-140 és a TGF-β1 jelátvitelt az emlő zsíros stroma vaszkuláris frakciójában. A magas zsírtartalmú étrend által kiváltott elhízás in vivo egérmodelljeinek felhasználásával azt tapasztaltuk, hogy az elhízott egerekből izolált SVF sejtekben a miR-140 szabályozása csökkent. Egy új SMAD3 kötőhelyet azonosítunk, amely gátolja a miR-140 expressziót, és egy TGF-β1/SMAD3/miR-140 negatív visszacsatolási hurokot, amely kritikus fontosságú a miofibroblaszt differenciálódásához az elhízott egerek emlőmirigyében. Végül a kokultúrás modelleken keresztül megmutatjuk, hogy a miR-140 magas zsírtartalmú étrend-szabályozása mind a normális, mind a rosszindulatú duktális hámsejteket befolyásolja.

EREDMÉNYEK

Sejtes immunfluoreszcencia. A sejteket 4% paraformaldehiddel rögzítettük 10 percig, kétszer PBS-sel mostuk, és 10% kecskeszérummal PBS-ben blokkoltuk szobahőmérsékleten 1 órán át, majd primer antitestet inkubáltunk egy éjszakán át 4 ° C-on. PBS-ben végzett mosás után a sejteket szekunder antitesttel inkubáltuk 1 órán át, majd PBS-ben mostuk. A sejteket ezután Hoechst 33342-vel PBS-ben 10 percig szobahőmérsékleten ellenfestettük, szerelőközeggel (KPL, Gaithersburg, MD) szereltük fel, és egy Olympus IX81 forgó korongos konfokális mikroszkóppal tettük láthatóvá. A mennyiségi meghatározást ImageJ (NIH) analízissel végeztük (37).

A szövet immunfluoreszcenciája. A paraffinba ágyazott szövetszelvényeket para-xinmentesítettük xilolban, etanolban újra hidratáltuk és kétszer mostuk desztillált vízzel (dH2O). Az antigén visszakeresést 10 mM nátrium-citrát (pH 6,0) alkalmazásával, 95 ° C-on 10 percig végeztük, majd a tárgylemezeket hagytuk lehűlni 30 percig szobahőmérsékleten. A mintákat 3% -os hidrogén-peroxid alkalmazásával leállítottuk, majd mosást és blokkolást végeztünk 10% kecskeszérummal PBS-ben 1 órán át. Primer antitestet alkalmaztunk, és a tárgylemezeket egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on. A mintákat PBS-ben mostuk, majd szekunder antitesttel inkubáltuk 1 órán át, majd PBS-ben mostuk és Hoechst 33342-vel PBS-ben ellenfestettük 10 percig szobahőmérsékleten. A mintákat rögzítő közeggel (KPL, Gaithersburg, MD) szereltük fel, és egy Olympus IX81 forgó korongos konfokális mikroszkóppal tettük láthatóvá. A mennyiségi meghatározást ImageJ (NIH) analízissel végeztük.

Immunhisztokémia. A paraffinba ágyazott szövetszelvényeket para-xinmentesítjük xilolban, etanolban rehidratáljuk és kétszer mossuk dH2O-val. Az antigén visszakeresését 10 mM nátrium-citrát (pH 6,0) alkalmazásával, 95 ° C-on 10 percig végeztük, majd szobahőmérsékleten hagytuk 30 percig hűlni. A mintákat 3% -os hidrogén-peroxid alkalmazásával leállítottuk, majd lemostuk és 10% kecskeszérummal PBS-ben blokkoltuk. A mintákat egy éjszakán át inkubáltuk az elsődleges antitesttel 4 ° C-on antitesthígítóban, mostuk és szekunder antitesttel inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten. A szubsztrátreakciót a 3,3-diaminobenzidin – torma-peroxidáz (DAB-HRP) szubsztrát (Vector Laboratories, CA) felhasználásával hajtottuk végre a peroxidázhoz. A metszeteket DPX (Sigma, USA) segítségével szereltük fel, és Nikon Eclipse Ti-U mikroszkóppal tettük láthatóvá. A mennyiségi meghatározást ImageJ (NIH) küszöbérték-analízissel végeztük (38).

RNS in situ hibridizáció. A miR-140 in situ hibridizációját a korábban leírtak szerint hajtottuk végre 5'-digoxigeninnel jelölt próba alkalmazásával (21, 39). A paraffinba ágyazott szövetszelvényeket para-xinmentesítjük xilolban, etanolban rehidratáljuk és kétszer mossuk dH2O-val. Kolorimetriás detektálási reakciót végeztünk NBT-BCIP (nitroblue tetrazolium – 5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfát) (Roche, Indianapolis, IN) alkalmazásával 48 órán át. A tárgylemezeket gyorsan gyorsan vörös színnel festettük (Sigma, St. Louis, MO), és a képeket Nikon Eclipse Ti mikroszkóppal (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) készítettük.

Masson trikrom foltja. Az emlő zsírszövetében a kollagén lerakódás meghatározásához módosított Masson festést végeztünk a gyártó utasításai szerint (ScyTek Laboratories, West Logan, UT; katalógusszám: TRM-1). Röviden, a szövetek rehidratálása után a metszeteket rögzítettük Bouin folyadékában, Weigert-féle hematoxilinnal festettük, és Biebrich skarlátvörös savas fuschin-ban inkubáltuk. Ezután foszfomolibd-fofotung-savoldattal mossuk és ellenfestjük anilinkékben és ecetsavban. A metszeteket ezután dehidráltuk és vizualizáltuk Nikon Eclipse Ti mikroszkóppal (Nikon Instruments Inc., Melville, NY).

Összehúzódási vizsgálat. Kollagén gél összehúzódási vizsgálatot állítottunk fel a gyártó utasításai szerint (CBA-201; Cell Biolabs, San Diego, Kalifornia) és a korábban leírtak szerint (39). Röviden: 2,0 × 106 sejt/ml sejtszuszpenziót kaptunk. Száz mikroliter sejtszuszpenziót összekevertünk 400 μl semlegesített kollagén-oldattal, hozzáadtuk egy 24-lyukú sejttenyésztő lemez egyik lyukához, és hagytuk 1 órán át megszilárdulni 37 ° C-on. Polimerizáció után 1 ml teljes táptalajt adunk minden üregbe, és a sejteket 48 órán át inkubáljuk. A stresszt úgy oldották fel, hogy steril pipetta hegyet vezettek a kút oldalán. A tenyészedényt a stressz felszabadulása után (nulla idő) és a többi meghatározott időpontban beolvasottuk. A kollagén gél területét ezután ImageJ szoftverrel (NIH) mértük.

TGF-β1 ELISA. A WT-RD, WT-HFD és miR-140 KO egerek SVF sejtjeiből származó 48 órás kondicionált táptalaj TGF-β1 fehérje szintjét enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) kit (eBioscience, San Diego, USA) segítségével vizsgáltuk. CA; EBS-88-8350-22 katalógusszám) a gyártó protokolljának megfelelően.

Fluoreszcenciával aktivált sejtrendezés (FACS). A sejteket anti-egér FcR antitesttel (CD16/CD32) blokkoltuk (BD Biosciences, San Jose, CA; katalógusszám: 553131) 15 percig, 4 ° C-on, PBS-ben, 2% FBS-sel és 1 mM EDTA-val. A sejteket ezután SCA1-Alexa Fluor 647-vel (Biolegend, San Diego, CA; katalógusszám: 108118) és CD49e-Alexa Fluor 488-mal (Biolegend katalógusszám: 103810) festettük 20 percig jégen. Az antitestek inkubálása után a sejteket kétszer PBS-ben mostuk 2% FBS-sel és 1 mM EDTA-val, újraszuszpendáltuk és FACSAria II sejtválogatóval (Beckman Coulter, Fullerton, CA) elemeztük.

Western blottolás. Az összes sejtlizátumot SDS-PAGE-val elválasztottuk és egy poli (vinilidén-difluorid) membránra blottoltuk. A membránt egy éjszakán át specifikus primer antitesttel inkubáltuk 4 ° C-on, majd HRP-konjugált másodlagos antitestet alkalmaztunk, és egy ECL Western blot detektáló rendszerrel (Thermo Scientific, Rockford, IL) tettük láthatóvá. Vinculint (Sigma, St. Louis, MO) használtuk terhelés kontrollként 1: 15 000 hígítás mellett. A fibronektint (Millipore, Billerica, MA), az aSMA-t (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) és az SMAD3-at (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) 1: 500, 1: 250, illetve 1: 100 hígításban használtuk.

qRT-PCR. A miRNS expressziójának qRT-PCR analízisét az előzőekben leírtak szerint végeztük, normalizálva az U6 kis mag RNS-t (40).

Cokultúra, kondicionált táptalaj kezelés, invázió és migrációs vizsgálatok. A tenyésztési vizsgálatokat 0,4 μm pórusméretű Transwell kamrákkal (Costar, Cambridge MA) végeztük. Összesen 0,5x105 SVF sejt/ml-t oltottunk a felső üregbe SVF-táptalajba, és 0,5x105 sejt/ml-t ültettünk az alsó üregbe. A sejteket 48 órán át inkubáltuk, mielőtt a DCIS sejteket újraszuszpendáltuk volna funkcionális vizsgálatokban történő szaporodás céljából.

A 48 órán át kondicionált táptalajt eltávolítottuk a sejtlemezekről, és a kamrába helyezett tárgylemezekre terített MCF10A sejtek kezelésére használtuk. Az MCF10A sejteket kondicionált tápközeggel kezeltük 48 órán át, majd immunfluoreszcens festést hajtottunk végre.

A Transwell inváziós vizsgálatokat 8 μm pórusméretű Transwell migrációs kamrák alkalmazásával végeztük (Costar, Cambridge, MA). A felső üreget 1 mg/ml Matrigellel (BD Biosciences) vonjuk be sejttenyésztő tápközegben, és 30 percig inkubáljuk 37 ° C-on. Az MCF10DCIS sejteket (0,5x105 sejt/ml) beoltottuk a felső kamrába (1,5 ml). Az invázió megkönnyítése érdekében az alsó kamra 1,5 ml DMEM-t tartalmazott 10% FBS-sel. A sejteket egy éjszakán át hagyták vándorolni a 10% FBS gradiens felé. A migrált sejteket 1% kristálylilával metanol-PBS-ben festettük, és fénymikroszkóppal megszámoltuk.

A transzwell migrációs vizsgálatokat 8 μm pórusméretű Transwell migrációs kamrák alkalmazásával végeztük (Costar, Cambridge, MA). Az MCF10DCIS sejteket (0,5x105 sejt/ml) beoltottuk a felső kamrába (1,5 ml). A migráció megkönnyítése érdekében az alsó kamra 1,5 ml DMEM-t tartalmazott 10% FBS-sel. A sejteket egy éjszakán át hagyták vándorolni a 10% FBS gradiens felé. A migrált sejteket 1% kristálylilával metanol-PBS-ben festettük, és fénymikroszkóppal megszámoltuk.

Mammoszféra kialakulása. Az MCF10A vagy MCF10DCIS egysejteket 40 μm-es sejttörők (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) felhasználásával nyertük és megszámoltuk. Összesen 10 000 sejt/ml-t oltottunk be 2% poli (2-hidroxi-etil-metakriláttal) (poli-HEMA; Sigma St. Louis, MO) bevont hat lyukú lemezekre 2% B27-et tartalmazó 20 ng DMEM – F-12-ben./ml EGF, 4 μg/ml inzulin és 0,4% BSA. 7 napos tenyésztés után a 100 μm-nél nagyobb gömböket fénymikroszkóppal számszerűsítettük.

Chromatin immuncsapódás. A transzkripciós faktor kötőhelyét szekvenciaillesztéssel azonosítottuk. A kromatin immunprecipitációt (ChIP) a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (24). Az SMAD3 út aktiválásának kiváltására a sejteket 48 órán át 10 ng/ml TGF-β1-gyel kezeltük. A sejteket 1% formaldehiddel keresztkötjük és ultrahanggal kezeljük. A kromatint SMAD3 (H300; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia) elleni antitestekkel inkubáltuk 4 ° C-on immuncsapás céljából. Nyúl IgG-t használtunk negatív kontrollként. Az immunprecipitált kromatint valós idejű qPCR-rel elemeztük. A következő primereket használtuk: 5′-CCCCTGGCTTTCCTTCTATG-3 ′ és 5′-ACAGGACATGCAGCAGGAGT-3 ′.

Statisztikai analízis. A statisztikai elemzést Student t-próbájával végeztük. A 2016. augusztus 15-i P értékek.

Visszaadva módosításra 2016. szeptember 15.

Elfogadva 2016. november 19.

Elfogadott kézirat, amelyet 2016. november 28-án tettek közzé az interneten.