A mikrobiom értékelése a gyermekek vakbélgyulladásában

Absztrakt

Háttér/cél

A mikrobiom szerepét széles körben megvitatták az appendicitis etiológiájában. Az elsődleges cél a normális vakbélben és a vakbélgyulladásban lévő mikrobiómák értékelése volt, amelyek a gyulladás három klinikailag és hisztopatológiailag meghatározott fokozatára voltak osztva. Másodlagos célkitűzés volt annak vizsgálata, hogy vannak-e mikrobiómás különbségek a proximális és a distalis függelékek között, és a mikrobiómát összefüggésbe hozzák hisztopatológiai leletekkel.

Mód

Prospektív kísérleti vizsgálatot végeztek olyan gyermekekről, akiknek vakbélműtétet végeztek vakbélgyulladás miatt. A diagnózis hisztopatológiai elemzésen alapult. Véletlen vakbélműtétben szenvedő gyermekeket használtunk kontrollként. A függelékek proximális és disztális nyálkahártyáját 16S rRNS génszekvenálással elemeztük.

Eredmények

Összesen 22 gyermek, 3 kontroll és 19 vakbélgyulladásos beteg; 11 phlegmonous, 4 gangrenous és 4 perforált függelék került kilátásba. Az összeg a Fusobacterium megnövekedett és Bacteroides csökkent a flegmonos és perforált vakbélgyulladásban a kontrollokhoz képest, de a statisztikai szignifikanciát nem érték el, és ezt a mintát nem láttuk a gangrenosus vakbélgyulladásban. A különböző baktériumok és a gyulladás mértéke között nem volt látható összefüggés, és a betegek minden egyes csoportjában a bőség, a nemzetség és a fajok szintjén nagy volt a különbség. Továbbá, a mikrobiom proximális és disztális nyálkahártyán történő összehasonlításakor nem volt kimutatható szignifikáns különbség, ennek oka lehet, hogy a tanulmány nem volt megfelelő. A disztális nyálkahártyánál nagyobb mennyiségű Fusobacteria-tendenciát figyeltek meg obstrukciós appendicitisben szenvedő betegeknél (25, illetve 13%, o = 0,06).

Következtetés

A mikrobiómák mintázata nemcsak csoportonként, hanem csoportonként is különbözött. A mikrobiómában azonban nem találtunk statisztikailag szignifikáns különbséget a csoportok vagy a klinikai állapotok között. Nem találtak összefüggést egy adott baktérium és a gyulladás fokozata között. Az appendicitis eseteinek túlnyomó többségében a mikrobiómában bekövetkező változások nem tűnik elsődleges eseménynek. Mivel úgy tűnik, hogy a mikrobiom minták a mintahelytől függően különböznek, a biopsziás mintavétel pontos lokalizációját a későbbi tanulmányokban le kell írni.

Bevezetés

A vakbélgyulladás gyakori betegség a gyermekek és a felnőttek körében, életének kockázata 7% [1]. Annak ellenére, hogy az első vakbélműtétet több mint 130 évvel ezelőtt hajtották végre [2], a vakbél fiziológiás funkciója és az apendicitis patogenezise nem teljesen ismert.

A vakbélgyulladás kialakulásának több oka is van, de az elsődleges esemény leggyakoribb magyarázata a lumen elzáródása a váladék későbbi felhalmozódásával, növekvő intraluminális nyomással, a nyirok- és vénadrenázs károsodásával, a nyálkahártya gátjának megsértésével és a túlnövekedéssel. és a mikrobák inváziója a vakbél falán belül [3–6]. A fekáliák, az anatómiai elhelyezkedés, a limfoid hiperplázia, az idegen testek és a daganatok miatti elzáródás azonban a jelentések szerint csak az esetek körülbelül harmadában található meg [7–9]. Az intraluminális nyomás nem nőtt, ha prospektív módon tanulmányozták [7]. Összefoglalva, világos, hogy a lumen elzáródásával járó elmélet nem képes megmagyarázni az appendicitis összes esetének többségét [10], ezért az obstrukciótól másodlagos mikrobák túlnövekedésének és inváziójának elmélete gyenge. Ehelyett vannak olyan jelentések, amelyek egy elsődleges fertőző eseményre utalnak [11], és egy tanulmány a klaszterekben megjelenő vakbélgyulladásról számolt be [12]. Beszámolnak az akut vakbélgyulladás előfordulásának szezonális változásáról is [13, 14].

A vakbélgyulladás kialakulásához vezető események sorrendjével kapcsolatos bizonytalanság ellenére feltételezzük, hogy a függelékben található mikrobiom központi szerepet játszik a patogenezisben [11, 15–18]. A legtöbb korábbi tanulmány hagyományos tenyésztési technikákat használt a baktériumok akut vakbélgyulladásban betöltött szerepének értékelésére [19, 20]. Ez a technika hatékony a magányos baktériumfajok értékelésében, de nem képes a polimikrobiális sokféleség jellemzésére [11]. Ezekkel a hagyományos tenyésztési módszerekkel a mikrobák 90–99% -a hiányzik [21]. A mikrobiális sokféleség értékeléséhez el kell végezni a függelék mikrobiota 16S rRNS génalapú vizsgálatát [22].

Anyag és módszerek

A vizsgálatot a Helsinki Nyilatkozat szerint hajtották végre, amelyet a Regionális Etikai Felülvizsgálati Testület (nyilvántartási szám 2013/614) és a Regionális Biobank Központ (gyűjteményi azonosító: SC1956) hagyott jóvá. Az adatokat anonimizálták a számítások előtt, és olyan módon mutatják be őket, hogy lehetetlen egyetlen beteget azonosítani. A gondozók írásbeli és szóbeli tájékoztatást kaptak a vizsgálatról, mielőtt beleegyezésüket adták volna.

Beállítások és gyerekek

Valamennyi gyermeket 2013 augusztusától 2014 júliusáig a gyermeksebészeti felsőoktatási központban operálták. A központ 340 000 lakosú területet szolgál ki, ahol a gyermekek elsődleges sebészeti ellátása

Eredmények

A beteg jellemzői

Mikrobiom elemzések

Menekültügyi szint

A menekültügyi szinten tíz különböző phylát találtak. Öt phyla képviseltette magát minden csoportban,> 2%> Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes, Fusobacteria és Proteobacterium jelenlétében; míg a phyla Spirochaetes, a Cyanobacteria, a Synergistetes, a Tenericutes és a Verrucomicrobia mindegyikében jelen volt az 1. ábra.

Mikrobiomanalízis a disztális nyálkahártya törzsének szintjén különböző fokú apendicitisben szenvedő betegeknél, összehasonlítva egy kontrollcsoporttal. Phyla, amelynek jelenléte> 2% -ot tartalmaz az ábra

Nemzetségszint

A nemzetség szintjén a mellékletekben összesen 80 nemzetség található. Csak öt nemzetség jelenléte> 5% volt; Athrobacter, Bacteroides, Porphyromonas, Parvimonas, és Fusobacterium bármelyik vizsgált csoportban. Csak a kezelőszervekben Bacteroides (24%)> 5% -ban volt jelen. Flegmonous vakbélgyulladás esetén, Fusobacterium (19%), Athrobacter (17%), és Bacteroides (12%) volt bőven. A gangrózisos vakbélgyulladás hasonló volt a kontrollokkal Bacteroides amelynek nagy a bősége (23%), de hozzáadva Porphyromonas (8%), bőségük meghaladja az 5% -ot. Perforált vakbélgyulladás esetén öt nemnél több mint 5% volt jelen Fusobacterium (32%) és Athrobacter (22%) többségben (2. ábra). A fent leírt nemzetségi szinten nem találtunk statisztikailag szignifikáns különbséget a bőségben (az adatokat nem mutatjuk be). Az egyes csoportokban a betegek különféle nemzetségi szintjeit vizsgálva (például a vakbélgyulladás és a kontrollok eltérő súlyossága) a bőségek széles skálája változott minden egyes csoporton belül. Ezért az azonos vakbélgyulladás súlyosságú betegeknél a különböző nemzetségek szintje nagyon eltérő volt (az adatokat nem közöljük).

Mikrobiom elemzés a disztális nyálkahártya nemzetségi szintjén, különböző fokú apendicitisben szenvedő betegeknél, összehasonlítva egy kontroll csoporttal. Az ábrán 5% -nál nagyobb jelenlétű nemzetség szerepel

Az LEfSe bioinformatikai eszköz segítségével tovább vizsgáltuk, hogy az appendicitis társulhat-e bármilyen baktériumfajhoz, de faji szinten nem volt különbség a csoportok között, és mint a menedékjog és a nemek szintjén végzett elemzésekben, nagy eltéréseket tapasztaltunk (adatok nem Látható).

A mikrobiota összehasonlítása hisztopatológia szerint

A proximális nyálkahártya és a disztális nyálkahártya összehasonlításakor nem találtunk statisztikailag szignifikáns különbséget törzs vagy nemzetség szintjén (az adatokat nem mutatjuk be). Phlegmonous és perforált vakbélgyulladás esetén a Fusobacteriumok a proximális nyálkahártyában 3, illetve 24% -kal voltak jelen, szemben a disztális nyálkahártya 36, illetve 57% -ával. A Bacteroidetes megfelelő száma a proximális nyálkahártyában 45, illetve 26%, a disztális nyálkahártyában pedig 38, illetve 21% volt (3. ábra).

Mikrobiomanalízis a proximális és disztális nyálkahártya törzsszinten az apendicitis és a kontroll különböző fokozataiban

Ezen a helyen nem volt különbség a makroszkopikus gyulladással vagy anélkül szenvedő vakbélgyulladásos betegek között a proximális nyálkahártya törzsszintjében (az adatokat nem közöltük). A disztális nyálkahártya törzsszintjének összehasonlításával obstrukcióval vagy anélkül (appendicolith) szenvedő appendicitisben szenvedő betegek körében tendencia mutatkozott az obstrukcióban szenvedő betegeknél a Fusobacteriumok nagyobb gyakorisága felé (25, ill., o = 0,06). Más phyla esetében nem tapasztaltunk különbséget (az adatokat nem közöljük).

A taxonok gazdagságának értékelésénél nem találtunk statisztikai szignifikanciát, de az egészséges függelékekkel és a proximális mintákkal magasabb α-diverzitású tendencia mutatkozott. A perforált vakbélgyulladásból származó distális minták mikrobiális változatossága a legkevesebb volt (4. ábra). A súlyozatlan és súlyozott Unifrac metrikák nem mutattak szignifikáns csoportosulást a csoportokban egy fő koordináta-elemzésben (az adatok nem láthatók).

Alfa-sokféleség különböző fokú apendicitisben és kontrollban szenvedő betegeknél. Az alfa-változatosságot filogenetikai sokféleséggel (PD egész fa) és a megfigyelt fajok (az adatokat nem közöljük) indexekkel vizsgáltuk egyenletes mintavételi mélységben, 4831 szekvencia/minta. Az értékek átlag ± SD. Nem találtunk szignifikáns különbséget a csoportok között

Vita

Ez volt az első vizsgálat, amelyben a mikrobiómát értékelték az appendicitis mindhárom klinikailag meghatározott szakaszában, valamint a különböző helyekhez és klinikai állapotokhoz viszonyítva. Csoportszinten egyértelmű különbségeket lehetett tapasztalni a törzs és a nemzetség bőségében, amikor összehasonlítottuk a kontrollokat a három vakbélgyulladásos csoporttal. Mindazonáltal a bőségek minden egyes csoporton belül nagyon változatosak voltak, ami megmagyarázhatja a tanulmány során tapasztalt jelentős különbségek hiányát. Az egyes csoportokon belül a mikrobiómában is volt eltérés a proximális és a distalis nyálkahártya között. Az egyetlen különbség, amely statisztikailag szignifikánsnak bizonyult, a fuzobaktériumok bősége volt az obstrukciótól disztálisan.

Fusobacterium nőtt a flegmonous és különösen a perforált vakbélgyulladás bőségesen a kontrollokhoz képest. Ennek azonban jelen volt

Következtetés

A mikrobiómák mintázata nemcsak csoportonként, hanem csoportonként is különbözött. A mikrobiómában azonban nem találtunk statisztikailag szignifikáns különbséget a csoportok vagy a klinikai állapotok között. Nem találtak összefüggést egy adott baktérium és a gyulladás fokozata között. Az appendicitis eseteinek túlnyomó többségében a mikrobiómában bekövetkező változások nem tűnik elsődleges eseménynek. Mivel úgy tűnik, hogy a mikrobiómaminták eltérnek a minta helyétől függően, a biopsziás mintavétel pontos lokalizációját a későbbi tanulmányokban le kell írni.

A közreműködők nyilatkozatai

Martin Salö: megtervezte a vizsgálati protokollt, összegyűjtötte a klinikai és laboratóriumi adatokat, elkészítette a kezdeti kéziratot, kritikusan áttekintette a kéziratot és jóváhagyta a végleges kéziratot benyújtásként.

Nittaya Marungruang: közreműködött a mikrobiota adatok elemzésében és bioinformatikai feldolgozásában, kritikusan áttekintette a kéziratot, és jóváhagyta a végleges kéziratot.

Tiaa Sundberg: elvégezte a mikrobiota 16S rRNS génszekvenálását, kritikusan áttekintette a kéziratot, és jóváhagyta a végleges kéziratot.

Bodil Roth: elvégezte a mikrobiota 16S rRNS génszekvenálását, kritikusan áttekintette a kéziratot és jóváhagyta a végleges kéziratot.

Pernilla Stenström: felügyelte az adatgyűjtést, kritikusan áttekintette a kéziratot és jóváhagyta a végleges kéziratot benyújtásként.

Einar Arnbjörnsson: megtervezte a tanulmányt, kritikusan áttekintette a kéziratot, és jóváhagyta a végleges kéziratot.

Frida Fåk: közreműködött a mikrobiota adatok bioinformatikai feldolgozásában, kritikusan áttekintette a kéziratot és jóváhagyta a végleges kéziratot benyújtásként.

Bodil Ohlsson: megtervezte a tanulmányt, felügyelte a statisztikai számításokat, kritikusan áttekintette a kéziratot és jóváhagyta a végleges kéziratot benyújtásként.

Minden szerző jóváhagyta a végleges kéziratot benyújtásként, és vállalta, hogy elszámoltatható a munka minden aspektusáért.

Hivatkozások

Addiss DG, Shaffer N, Fowler BS, Tauxe RV (1990) A vakbélgyulladás és a vakbélműtét epidemiológiája az Egyesült Államokban. Am J Epidemiol 132 (5): 910–925

Hutchinson R (1993) Amyand sérv. J R Soc Med 86 (2): 104–105

Bundy DG, Byerley JS, Liles EA, Perrin EM, Katznelson J, Rice HE (2007) Van-e ennek a gyermeknek vakbélgyulladása? JAMA 298 (4): 438–451

Walker ASI (1990) Mi okozza a vakbélgyulladást? J Clin Gastroenterol 12 (2): 127–129

Humes DJ, Simpson J (2006) Akut vakbélgyulladás. BMJ 333 (7567): 530–534

Singh JP, Mariadason JG (2013) A faecolith szerepe a mai vakbélgyulladásban. Ann R Coll Surg Engl 95 (1): 48–51

Arnbjörnsson E, Bengmark S (1984) Az obstrukció szerepe az akut vakbélgyulladás patogenezisében. Am J Surg 147: 390–392

Jones BA, Demetriades D, Segal I, Burkitt DP (1985) A vakbélgyulladás prevalenciája vakbélgyulladással és anélkül szenvedő betegeknél. Összehasonlító tanulmány Kanadából és Dél-Afrikából. Ann Surg 202 (1): 80–82

Chang AR (1981) 3003 függelék patológiájának elemzése. Aust N Z J Surg 51 (2): 169–178

Carr NJ (2000) Az akut vakbélgyulladás patológiája. Ann Diagn Pathol 4 (1): 46–58

Swidsinski A, Dörffel Y, Loening-Baucke V, Theissig F, Rückert JC, Ismail M és mtsai. (2011) Az akut vakbélgyulladást helyi invázió jellemzi fusobacterium nucleatum/necrophorummal. Bél 60 (1): 34–40

Andersson R, Hugander A, Thulin A, Nystrom PO, Olaison G (1995) Az akut vakbélgyulladás klaszterei - további bizonyítékok a fertőző etiológiára. Int J Epidemiol: 829–833

Deng Y, Chang DC, Zhang Y, Webb J, Gabre-Kidan A, Abdullah F (2010) A perforált vakbélgyulladás szezonális és a hét napjának variációi az amerikai gyermekeknél Pediatr Surg Int 26 (7): 691–696

Zangbar B, Rhee P, Pandit V, Hsu C-H, Khalil M, Okeefe T és mtsai. (2015) A sürgősségi általános műtét szezonális eltérései. Ann Surg

Guinane CM, Tadrous A, Fouhy F, Ryan CA, Dempsey EM, Murphy B és mtsai. (2013) Az appendectomiát követő páciensek humán mellékleteinek mikrobiális összetétele. MBio 4 (1): e00366–12

Jackson HT, Mongodin EF, Davenport KP, Fraser CM, Sandler AD, Zeichner SL (2014) A vakbélgyulladás és a végbél mikrobiómájának kultúrától független értékelése apendicitisben és anélkül. PLoS One 9 (4): e95414

Swidsinski A, Loening-Baucke V, Biche-ool S, Guo Y, Dörffel Y, Tertychnyy A és mtsai. (2012) A fuzobaktériumok által okozott nyálkahártya invázió az akut vakbélgyulladás gyakori jellemzője Németországban, Oroszországban és Kínában. Saudi J Gastroenterol 18 (1): 55

Zhong D, Brower-Sinning R, Firek B, Morowitz MJ (2014) Az akut vakbélgyulladás gyermekeknél a fylum fusobacteriumokból származó baktériumok rengetegségével jár. J Pediatr Surg 49 (3): 441–446

Leigh DA, Simmons K, Norman E (1974) A vakbél bakteriális flórája vakbélgyulladásban és posztoperatív sebfertőzésben. J Clin Pathol 27: 997–1000

Roberts JP (1988) Az akut vakbélgyulladás kvantitatív baktériumflórája. Arch Dis Child 63 (5): 536–540

Hugenholtz P, Goebel BM, Pace NR (1998) A kultúrától független vizsgálatok hatása a baktériumok sokféleségének kialakuló filogenetikai nézetére (Journal of Bacteriology (1998) 180: 18 (4765–4774)). J Bacteriol. o. 6793.

Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, Purdom E, Dethlefsen L, Sargent M és mtsai. (2005) Az emberi bél mikrobiális flórájának sokfélesége. Science 308 (5728): 1635–1638

Samuel M (2002) Gyermekkori vakbélgyulladás pontszám. J Pediatr Surg 37 (6): 877–881

Peter SDS, Sharp SW, Holcomb GW, Ostlie DJ (2008) A perforált vakbélgyulladás bizonyítékokon alapuló meghatározása egy prospektív randomizált vizsgálatból. J Pediatr Surg 43 (12): 2242–2245

Andersson R (1998) Vakbélgyulladás - epidemiológia és diagnózis. Tézis. Linköpingi Egyetem, Svédország

Emil S, Gaied F, Lo A, Laberge JM, Puligandla P, Shaw K és mtsai. (2012) Gangrenous vakbélgyulladás gyermekekben: a definíció, a bakteriológia, a hisztopatológia és az eredmények prospektív értékelése. J Surg Res 177 (1): 123–126

Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD, Costello EK és mtsai. (2010) A QIIME lehetővé teszi a nagy áteresztőképességű közösségi szekvenálási adatok elemzését. Nat Methods 7 (5): 335–336

Benjamini Y, Hochberg Y, Benjamini Y, Hochberg Y (1995) A hamis felfedezési arány ellenőrzése: praktikus és hatékony megközelítés a többszörös teszteléshez. J R Stat Soc B 57 (1): 289–300

Clarke KR (1993) A közösségi struktúra változásainak nem paraméteres többváltozós elemzése. Aust J Ecol 18: 117–143

Segata N, Izard J, Waldron L, Gevers D, Miropolsky L, Garrett WS és mtsai. (2011) Metagenomikus biomarkerek felfedezése és magyarázata. Genome Biol 12 (6): R60

Bolstad AI, Jensen HB, Bakken V (1996) A fusobacterium nucleatum taxonómiája, biológiája és periodontális aspektusai. Clin Microbiol Rev 9 (1): 55–71

Andersson RE, Olaison G, Tysk C, Ekbom A (2001) vakbélműtét és védelem fekélyes vastagbélgyulladás ellen. N Engl J Med 344 (11): 808–814

Radford-Smith GL, Edwards JE, Purdie DM, Pandeya N, Watson M, Martin NG és mtsai. (2002) A vakbélműtét védő szerepe a fekélyes vastagbélgyulladás és a Crohn-kór megjelenésekor és súlyosságánál. Bél 51 (6): 808–813

Strauss J, Kaplan GG, Beck PL, Rioux K, Panaccione R, Devinney R és mtsai. (2011) A bél nyálkahártyájából származó fusobacterium nucleatum invazív potenciálja pozitívan korrelál a gazdaszervezet IBD státusával. Bélgyulladás Dis 17 (9): 1971–1978

Docktor MJ, Paster BJ, Abramowicz S, Ingram J, Wang YE, Correll M és mtsai. (2012) A szájüregi mikrobiom változatosságának változásai gyermekgyulladásos bélbetegségben. Bélgyulladás Dis 18 (5): 935–942

Falcony G, Joossens M, Vieira-Silva S, Wang J, Darzi Y, Faust K és mtsai. (2016) A bél mikrobiom variációjának populációszintű elemzése. Science (80-) 352 (6285): 560–564

Zhernakova A, Kurilshikov A, Bonder MJ, Tigchelaar EF, Schirmer M, Vatanen T és mtsai. (2016) A populációalapú metagenomikai elemzés feltárja a bél mikrobiom összetételének és sokféleségének markereit. Science (80-) 352 (6285): 565–569