A miR-21-5p szabályozza a II-es típusú alveoláris hámsejtek apoptózisát hiperoxikus akut tüdőkárosodásban

Song Qin

Intenzív terápiás egység, a Zunyi Orvosi Főiskola kapcsolt kórháza, Zunyi, Guizhou 563000, Kína

Miao Chen

Intenzív terápiás osztály, a Zunyi Orvosi Főiskola kapcsolt kórháza, Zunyi, Guizhou 563000, Kína

Hui Ji

Intenzív terápiás egység, a Zunyi Orvosi Főiskola kapcsolt kórháza, Zunyi, Guizhou 563000, Kína

Guo-Yue Liu

Intenzív terápiás egység, a Zunyi Orvosi Főiskola kapcsolt kórháza, Zunyi, Guizhou 563000, Kína

Hong Mei

Intenzív terápiás egység, a Zunyi Orvosi Főiskola kapcsolt kórháza, Zunyi, Guizhou 563000, Kína

Kang Li

Intenzív terápiás egység, a Zunyi Orvosi Főiskola kapcsolt kórháza, Zunyi, Guizhou 563000, Kína

Tao Chen

Intenzív terápiás egység, a Zunyi Orvosi Főiskola kapcsolt kórháza, Zunyi, Guizhou 563000, Kína

Társított adatok

A vizsgálat során generált elemzett adatkészletek ésszerű kérésre a megfelelő szerzőtől elérhetőek.

Absztrakt

A hiperoxia okozta akut tüdőkárosodás (HALI), mint a mechanikus lélegeztetés szabadalmainak egyik leggyakoribb szövődménye, ennek leküzdésére jelenleg nincsenek hatékony módszerek. Feltételezték, hogy a 21-5p mikroRNS (miR-21-5p) elősegítheti a II. Típusú alveoláris hámsejtek (AECII) túlélését, enyhítve a HALI-t. Jelen tanulmány célja a génchip-elemzés és a miR-21-5p túlzott expressziójának összekapcsolása volt, a HALI új terápiás lehetőségének kidolgozása céljából. Megállapították, hogy az AECII apoptózis fontos kórokozó esemény volt a HALI kialakulásában, és a miR-21-5p túlzott expressziója megakadályozta az AECII apoptózis csökkentésével járó HALI-t. Ezeket az eredményeket adenovirális/lentivirális vektorok alkalmazásával kaptuk, amelyek a miR-21-5p-t túlexpresszálták, az AECII sejtek in vitro és in vivo transzfektálásához. Megállapították, hogy a miR-21-5p túlzott expressziója csökkentette az AECII sejtek apoptotikus sebességét. Ezenkívül a miR-21-5p csökkentette a B-sejtes lymphoma 2 (Bcl-2) asszociált X fehérje/Bcl-2 arányát és a kaszpáz-3 expresszióját. Kiderült az is, hogy a miR-21-5p túlzott expressziója enyhítette az akut tüdőkárosodást hiperoxiás környezetnek kitett felnőtt patkányokban. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a miR-21-5p új terápiás lehetőséggé válhat a HALI-ban szenvedő betegek számára azáltal, hogy megvédi az AECII sejteket az apoptózistól.

Bevezetés

Anyagok és metódusok

Anyagok

Az első kísérletben a patkány AEC-II sejteket a Xiangya Medical School központi laboratóriuma biztosította (Changsha, Kína). A sejteket kinyertük és szubkultúráztuk, és RPMI-1640 táptalajban (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) tenyésztve 37 ° C-on 36 órán keresztül, a tenyészetet két csoportra osztottuk. A H2O2 károsító csoportokban 0,5/l H2O2-t adtunk hozzá, és a tenyésztést folytattuk; a vak kontrollcsoportban azonos térfogatú sóoldatot adunk hozzá, és a tenyésztést folytatjuk.

A második kísérletben összesen 160 Sprague-Dawley (SD) patkány (

180–220 g; férfi és női informalitás) a Harmadik Katonai Orvostudományi Egyetem állatkísérleti központja [Chongqing, Kína; állatengedély száma: SCXK (Chongqing) 2012-0005]. A patkányokat 18–22 ° C-on, 50–60% relatív páratartalmat és 12 órás világos/sötét ciklust tartottuk, szabad hozzáféréssel a patkány chow-hoz és vízhez. A patkányokat véletlenszerűen négy csoportba osztották: i) normál kontroll csoport (2,5% pentobarbitális nátrium hasi érzéstelenítésen keresztül); ii) PBS-csoport (2,5% pentobarbitál-nátrium hasi érzéstelenítésen keresztül és 200 µl PBS beadása orrcseppen keresztül); iii) Üres víruscsoport (2,5% pentobarbitális nátrium hasi érzéstelenítésen keresztül és 200 µl lassú vírus beadása az orrcseppen keresztül); iv) miRNS-21-5p csoport (2,5% pentobarbitál-nátrium hasi érzéstelenítésen keresztül, és 200 µl lassú vírus beadása miRNS-21-5p-vel orrcseppen keresztül). A magas oxigénszintű akut tüdőkárosodás modelljét mind a négy csoportban (mindegyik n = 40) hozták létre, egy korábbi tanulmánynak megfelelően (19). A modellezési folyamat során elhullott patkányokat kizártuk a kísérletből.

A harmadik kísérletben a szubkultúrájú AEC-II sejteket véletlenszerűen négy csoportra osztottuk: normál kontroll csoport (sóoldat), H2O2 károsodás csoport (0,5 mmol/l H2O2), miR-21-5p túlzott expressziós csoport (adenovírus vektor miR-21-vel -5p + 0,5 mmol/l H2O2), miR-21-5p negatív transzfekciós csoport (üres adenovírus + 0,5 mmol/l H2O2). Az indikátorokat 6, 12, 24 és 48 órakor mértük.

AEC-II detektálás

A transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM) alkalmazása a lamelláris corpuscle ozmium kimutatására az AEC-II azonosításának arany szabványának számít. A mintákat elektronmikroszkóppal azonosítottuk a Zunyi Orvosi Főiskola Elektronmikroszkópos Központjában (Zunyi, Kína).

Az apoptózis morfológiai kimutatása

A H2O2 modellsejteket 24 órán át 0,5 mmol/l H2O2-mal inkubáltuk 24 órán keresztül. Ezt követően TEM-et alkalmaztunk az apoptotikus morfológia kimutatására, az AEC-II azonosításához fent leírt módszer alkalmazásával.

A korai apoptotikus sebesség kimutatása

Mindegyik csoportban a sejteket öt időpontban gyűjtöttük össze: A modellezés előtt (T0) és 2,5, 6, 12, illetve 24 órával a modellezés után (T2,5, T6, T12 és T24) az egysejtű szuszpenziók előállításához . A sejteket 4 ° C-on és 125xg-vel centrifugáltuk 5 percig, a felülúszót eldobtuk, és a sejteket egyszer PBS-sel mostuk.

Génchip-szűrés és apoptózissal kapcsolatos miRNS-ek bioinformatikai elemzése

A sejteket a T0 és a T24 sejtcsoportokból gyűjtöttük össze, hogy elvégezzük a miRNS mikroarray-t, hogy összehasonlítsuk a miRNS-ek differenciális expressziós profilját a két időpont között, valamint az apoptózissal kapcsolatos miRNS-ek szűrésére. Az RNS mennyiségét NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Inc.) alkalmazásával mértük, és a mintákat a miRCURY LNA ™ microRNS Array Hi-Power Labeling kit (Qiagen, Inc., Germantown, MD, USA) segítségével jelöltük, majd hibridizáltuk miRCURY LNA ™ miRNS tömb (18.0 verzió; Qiagen, Inc.). A tárgylemezeket szkennelés előtt mossuk Axon GenePix 4000 B mikrorajzolókkal (Molecular Devices, LLC., Sunnyvale, Kalifornia, USA). A beolvasott képeket ezután a GenePix Pro 6.0 programba (Molecular Devices, LLC.) Importálták a rács igazítása és az adatok kinyerése céljából. A replikált miRNS-eket átlagoltuk, és az összes mintában> 50-es intenzitású miRNS-eket alkalmaztuk a normalizációs faktor kiszámításához. Az expresszált adatokat medián normalizálással normalizáltuk. Ezt követően a miRNS-eket, amelyek jelentősen eltérően expresszálódtak, egy vulkán ábrázolásával azonosítottuk. Végül hierarchikus klaszterezést végeztünk a miRNA expressziós profilok közötti különbségek meghatározására a minták között WebMeV szoftver segítségével (4.6 verzió; http://mev.tm4.org/) (20).

A miRNS funkcionális szerepeinek további vizsgálatához a miR-449a-5p, miR-34b/c-5p és miR-21-5p feltételezett célpontjait a TargetScan (http://www.targetscan.org/), miRecords jósolta meg. (http://c1.accurascience.com/miRecords/) és a miRTarBase (http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php) adatbázisok.

Az apoptózissal kapcsolatos miRNS-ek fordított transzkripció-polimeráz láncreakcióval (RT-PCR) történő validálása

A hyperoxia tüdősérülési modell felállítása

A magas oxigéntartalmú tartály egy plexiüveg tartályt (45 × 30 × 35 cm) tartalmazott, amelynek felső oxigén csatlakozója és oxigéndetektora volt. Az SD patkányokat a magas oxigéntartályba helyeztük, a belső hőmérsékletet 25–27 ° C-on és 50–70% páratartalmat tartottuk, az oxigén áramlási sebességét úgy állítottuk be, hogy az oxigén koncentrációja bent> 90% legyen. A tartály belsejében lévő szóda meszet használták fel a CO2 felszívására a CO2 koncentráció fenntartása érdekében 3), ezt követően fluoreszcens mikroszkóppal figyelték meg a zöld fluoreszcencia eloszlását. Ugyanezt a módszert alkalmazták ugyanolyan dózisú PBS és lentivírus cseppjeinek beadására, amelyeket kontrollcsoportként használtunk.

Az optimális transzfekciós titer a 200 µl lenti vírusos oldat hat titerét tartalmazta (1 × 10 6, 2 × 10 6, 4 × 10 6, 6 × 106, 8 × 106 és 10 × 106 TU/ml) orrcsepegtetéssel patkány tüdőbe. A tüdőszöveti változásokat általában megfigyelték, és fluoreszcens mikroszkóppal figyelték meg a tüdőszövet fluoreszcenciájának változásait. Az a koncentráció, amelynél a fluoreszcencia sűrűség növekedését nem figyelték meg, az optimális transzfekciós titernek tekinthető, a megnövekedett transzfekciós titern kívül.

A légzési paraméterek kimutatása

A 0, 24, 48 és 72 órás modellpatkányokban artériás vért vontak ki gázanalízishez, és az oxigénezési indexet (OI) és a légzési indexet (RI) a következő képlet alapján számolták ki a vérgázelemzési eredmények alapján: OI = PaO2/FiO2. A PaO2 az artériás oxigénnyomás, a FiO2 az inspirált O2 vagy az inspirált oxigénkoncentráció frakciója. A FiO2-t 90% -ban rögzítették. RI = P (A-a) O2/PaO2. P (A-a) O2 az alveoláris-artériás oxigénfeszültség-gradiens (alveoláris-artériás oxigénkülönbség).

A tüdőszövet fénymikroszkópos vizsgálata és kóros pontozása

A szövetmintákat a magas oxigéntartalmú 0, 24, 48 és 72 órás patkányokból nyertük le, áldozatokat követően. A jobb tüdőszövet 0,3 × 0,3 × 0,5 cm 3 mintáját 10% -os formalinos folyadékban rögzítettük, dehidratáltuk, paraffinba ágyazottuk és 5–8 µm-es szakaszokra vágtuk, dimetil-benzol viaszmentesítéssel a hematoxylin és eozin festéssel. A metszeteket ismét dehidratáltuk, xilolban tisztítottuk és gumit lezártuk, majd ezt követõen Leica DM4M mikroszkóppal (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Németország) figyeltük meg a tüdõszövet patológiás változásait. Mindegyik szövetbiopsziát három véletlenszerűen kiválasztott nagy teljesítményű mezőben (nagyítás, × 400) értékeltük, és az átlagértéket pontozási rendszerrel (22,23) számoltuk ki, a tüdőszövet szerkezeti károsodásának és gyulladásos sejtbeépülésének megfelelően.

A tüdőszövet nedves/száraz (W/D) tömegarányának meghatározása

A patkányokat magas oxigénnel 0, 24, 48 és 72 órán át tenyésztettük, és felöltük őket. A bal tüdőt eltávolítottuk és lemértük, hogy meghatározzuk a tüdő nedves tömegét. A tüdőszövetet ezután állandó hőmérsékletű, 80 ° C-os kemencébe helyeztük 48 órán át, amíg a tömeg állandó nem volt, és a tüdő száraz tömegének számítottuk. A W/D arányt a fenti adatok alapján számoltuk ki.

AEC-II transzfekció

A logaritmikus növekedési fázis sejtjeit hat lyukú lemezekre (5x107 sejt/cm2) oltottuk, amíg a sejtek be nem borították a kút alját, majd ezt követően 0,125% tripszin/EDTA-t használtunk a sejtek emésztéséhez és megszámláltuk. Adenovírus folyadékot (10 ul) adtunk 10 ml szérummentes 1640 tápoldathoz, és meghatároztuk a fertőzés optimális sokaságát (MOI). A Lipofectamine® 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) sikeres transzfekcióját követően a legmagasabb transzfekciós hatékonysági időt a kibocsátott zöld fluoreszcencia alapján határoztuk meg.

MiR-21-5p RT-PCR elemzése

A miR-21-5p primereket a Beijing Booheng Kechuang Biological Technology Co., Ltd. (Peking, Kína) tervezte az AEC-II reverz transzkripciójához, minden csoportban a legnagyobb transzfekciós hatékonysági idővel. RT-PCR elemzést a fent leírtak szerint végeztünk, hogy minden csoportban kimutassuk a miR-21-5p expresszióját, belső kontrollként U6.

Korai apoptotikus sejtek detektálása áramlási citometriával (FCM)

Az optimális MOI 30. Az overexpressziós és negatív miR-21-5p adenovírus vektorokat transzfektáltuk az AEC-II-be, és a sikeres transzfekciót követően a sejteket 0,5 mmol/l H2O2 sérülésnek tettük ki 6, 12, 24 és 48 órán keresztül. . Minden egyes időpontra mindegyik sejt-szuszpenziót 5 percig 4 ° C-on és 125xg-n végzett centrifugálással, a felülúszó eltávolításával és egyszer PBS-ben végzett mosással készítettük. A kettős jelölésű FCM folyamata szerint meghatároztuk a sejtek korai apoptotikus sebességét.

A Bcl-2, Bax és Caspase-3 expressziójának Western-blot-analízise

Az AEC-II sejteket 48 órával a transzfekció után EP-csövekbe helyeztük, kétszer PBS-sel mostuk, a sejtlizátumhoz adtuk, ultrahang-megszakításnak vetettük alá és centrifugáltuk. A teljes fehérje extrahálását 100 ° C-on 5 percig tartó forralással hajtottuk végre. A fehérjekoncentrációt a bicinchonininsav fehérje esszével határoztuk meg. A fehérjéket (50 ug/sáv) 10% SDS-PAGE-vel elválasztottuk és polivinilidén-fluorid (PVDF) membránokra vittük át. 5% zsírmentes tejoldat szobahőmérsékleten 2 órán át történő blokkolását követően a membránokat anti-Bcl-2-vel (1: 1 000; kat. Sz. Ab117115; Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-Bax-szal (1) szondáztuk.: 1000, kat. Sz. Ab77566; Abcam), anti-kaszpáz-3 (1: 1200; kat. Sz. Ab13585; Abcam) és anti-β-aktin (1: 500; kat. Sz. Ab8226; Abcam) primer antitestek 4-nél ° C éjszakán át. A PVDF membránokat ezután torma-peroxidázzal konjugált szekunder antitestekkel (1: 2 000; kat. Sz. Ab6728; Abcam) inkubáltuk szobahőmérsékleten 1 órán át. A sávok vizualizálásához fokozott kemilumineszcencia szubsztrátot (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) használtunk, amelyeket ChemiDoc MP rendszer (Bio-Rad Laboratories, Inc.) elemzett. A fehérje szintet β-aktinná normalizálták.