Momordica charantia (keserű dinnye) gátolja az elsődleges humán adipocita differenciálódást az adipogén gének modulálásával

Absztrakt

Háttér

Az elhízás és a társult 2-es típusú cukorbetegség (T2D) fokozódó tendenciái az alternatív és kiegészítő funkcionális ételek használatának növekedését váltották ki. Momordica charantia vagy keserű dinnye (BM), amelyet hagyományosan cukorbetegség és szövődmények kezelésére használnak, bebizonyosodott, hogy enyhíti a hiperglikémiát, valamint csökkenti a rágcsálók zsírosodását. Az emberi zsírsejtekre gyakorolt hatása azonban ismeretlen. Vizsgálatunk célja a BM-lé (BMJ) lipid-felhalmozódásra és adipocita-differenciálódási transzkripciós faktorokra gyakorolt hatásainak vizsgálata volt az elsődleges humán differenciálódó preadipocitákban és adipocitákban.

Mód

A kereskedelemben kapható krioprezervált primer humán preadipocitákat BMJ-vel és anélkül kezelték a differenciálódás alatt és után. A citotoxicitást, a lipid felhalmozódást és az adipogén géneket Az mRNS expresszióját kereskedelmi enzimatikus vizsgálati készletekkel és félkvantitatív RT-PCR-rel (RT-PCR) mértük.

Eredmények

A differenciálódás során változó BMJ-koncentrációval kezelt preadipocyták szignifikánsan csökkentették a lipidtartalmat, és egyidejűleg csökkentették az adipocita transzkripciós faktorok mRNS-expresszióját, mint például a peroxiszóma-proliferátorhoz társított receptor γ (PPARγ) és a szterin szabályozó elemet megkötő 1c fehérje (SREBP-1c) ) és adipocitokin, rezisztin. Hasonlóképpen, a BMJ-vel 48 órán át kezelt adipociták csökkent lipidtartalmat, perilipin mRNS expressziót és fokozott lipolízist mutattak a glicerin felszabadulásával mérve.

Következtetés

Adataink azt sugallják, hogy a BMJ a lipogenezis hatékony gátlója és stimulálja a lipolízis aktivitását emberi adipocitákban. A BMJ tehát hatékony kiegészítő vagy alternatív terápiának bizonyulhat az emberekben az adipogenezis csökkentésére.

Háttér

Az Egyesült Államokban körülbelül 127 millió felnőtt túlsúlyos (testtömeg-index, BMI> 25 kg/m 2), míg több mint 60 milliót elhízottnak (BMI> 30 kg/m 2), és körülbelül 9 millió súlyosan elhízottnak (BMI> 40 kg/m 2). Az elmúlt két évtizedben a túlsúlyos egyedek előfordulása 40% -kal (46,0% -ról 64,5% -ra), az elhízás előfordulása pedig 110% -kal (14,5% -ról 30,5% -ra) nőtt [1]. Az elhízás olyan anyagcserezavarokkal is társul, mint például a 2-es típusú cukorbetegség (T2D), amely a megelőzhető halál második legfontosabb oka az Egyesült Államokban [3.0.CO; 2-O. "Href ="/articles/10.1186/1472-6882 -10-34 # ref-CR2 "> 2].

Mód

Keserű dinnye lé (BMJ) elkészítése

A fiatal BM fiatal kínai változatát (amely még nem érett meg és nem vált sárgára/narancssárgára) a helyi gazdálkodók piacáról szerezték be, mosták és vetették el. A BMJ-t a korábban közzétett protokollnak megfelelően extraháltuk [26, 27]. Röviden, fiatal, zöld BM gyümölcsöket vetettek ki és a pépet eldobták. A levet szokásos háztartási facsaróban készítettük, és 4500 fordulat/perc sebességgel 4 ° C-on 30 percig centrifugáltuk. Körülbelül 8000 g felszabadított BM-gyümölcs 3500 ml BMJ-t eredményezett. A BMJ felülúszót alikvotizáltuk és -80 ° C-on tároltuk a további elemzésig. Mindegyik alikvot csak egyszer fagyott le és olvasztott fel. A BM fajtát etnobotanikus ellenőrizte és azonosította, Dr. Will McClatchey és az utalványmintát a hivatalos herbáriában, a Manoa Hawaii Egyetemen, Herbáriumban (HAW) helyezték el, és PratibhaBM0001 és PratibhaBM0002 címkével látták el [26].

Elsődleges humán adipocita kultúrák

Krioprezervált primer humán preadipocitákat (SP-F-SL katalógus, SL0028 tétel) a ZenBio-tól (Research Triangle Park, NC) szereztük be és tenyésztettük a gyártó utasításai szerint. Az egyesített primer preadipociták hat női donor szubkután zsírszövetéből származtak, átlagéletkoruk 43 év, átlagos BMI 27,25 kg/m 2. A preadipocytákat "Preadipocyte táptalajban" (cat # PM-1, ZenBio) tartottuk, és összefolyás után a sejteket 96 lyukú, 24 üreges vagy 6 üreges lemezekre szélesztettük 13 500, 62 500 vagy 333 333 sejt/sűrűséggel. hát ill. Két nappal a szélesztés után a sejteket "differenciálódási tápközeggel" (# DM-2 katalógus, ZenBio katalógus) differenciáljuk, és "0" napnak tekintjük. A táptalajt kétnaponta cseréltük, 2., 4., 6., 8., 10. és 12. sejteket gyűjtöttünk elemzés céljából a 14. napon, majd a sejtek lipidcseppeket halmoztak fel, és érett adipocitáknak tekintették őket. Egy kísérletsorozatban a preadipocitákat BMJ-vel kezeltük a „0” és a 12. nap közötti differenciálódás során, és a különféle elemzés céljából a 14. napon gyűjtöttük össze. Egy másik kísérleti sorozatban, amikor a sejteket 14 nap elteltével teljesen differenciálták adipocitákká, 0,5, 1,0 és 2% BMJ-vel kezeltük őket 24 és 48 órán keresztül.

Citotoxicitás mérések

A kísérleti periódusok végén a változó BMJ-koncentrációval (0,5, 1,0, 2,0, 5,0 és 10,0%, v/v) kezelt sejtek életképességét az ATPlite lumineszcencia detektáló vizsgálati rendszer (kat. # 6016941, Perkin Elmer, Boston, USA) alkalmazásával határoztuk meg. MA) a gyártó protokollja szerint. A sejtek citotoxicitásának meghatározásához a táptalajt gyűjtöttük a laktát-dehidrogenáz (LDH) felszabadulásának mérésére CytoTox-ONE Homogén Membrán Integrity Assay (Cat # G7891, Promega) alkalmazásával, az előzőekben leírtak szerint [27, 28]. A sejtek ATP szintje a sejt életképességének a markere, mivel az ATP minden metabolikusan aktív sejtben jelen van, és a koncentráció gyorsan csökken apoptotikus vagy nekrotikus sejtekben.

Olajvörös festés

Az adipociták olajvörös O-festését a közzétett protokollok szerint hajtották végre [29]. Röviden, jéghideg PBS-ben történő mosás után a sejteket egy éjszakán át 10% -os formalinban rögzítettük, vízzel mostuk és 0,3% -os olajvörös színnel festettük 1 órán át. Alapos vízzel végzett mosás és a felesleges víz bepárlása után az olajvöröset izopropil-alkoholban extraháltuk, és az abszorbanciát 490 nm-en követtük nyomon a Wallac Victor 2 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA) alkalmazásával.

Sejtes triglicerid (TG) elemzés

A preadipocitákat vagy a differenciálás során, vagy a differenciálás után, a fent említett BMJ változó koncentrációival kezeltük. A sejteket jéghideg PBS-sel mostuk és 0,5 N nátrium-hidroxiddal (NaOH) lizáltuk. A sejtes TG-tartalmat az Infinity TG Liquid Stable Reagent kereskedelmi készlettel (Thermo-DMA, St Louisville, CO, USA) mértük, és az abszorbanciát 540 nm-en mértük Wallac Victor 2 1420 Multilabel Counter alkalmazásával. A TG-értékeket a fehérje mg-ra normalizálták, amelyet a gyártó utasításainak megfelelően Bradford-módszerrel határoztak meg (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

A lipolízis meghatározása

A lipolízist a tápközegbe felszabaduló szabad glicerin függvényében mértük. Röviden, 14 nappal a differenciálás után az elsődleges humán adipocitákat 0,5, 1 és 2% BMJ-vel kezeltük 24 és 48 órán keresztül. A szabad glicerint a kereskedelemben kapható glicerinmentes reagens és glicerin standardok alkalmazásával mértük a gyártás protokollja szerint (Sigma, St. Louis, MO).

Az mRNS gén expressziójának félkvantitálása

Statisztikai analízis

Az összes statisztikai elemzést a GraphPad Prism, Prism 5 for Windows, 5.01 verzió segítségével hajtottuk végre. Az adatokat átlagértékekként ± SEM fejezzük ki. Egy- vagy kétirányú ANOVA modellt alkalmaztunk a csoportok közötti átlag összehasonlítására. Minden mintát kétszer elemeztünk. Post hoc páronkénti többszörös összehasonlításokat a Tukey-féle többszörös összehasonlítási teszttel vagy Bonferroni utópróbával értékeltünk ANOVA után. Az eredményeket a p

Eredmények

A BMJ csökkenti a triglicerid (TG) tartalmat és fokozza a lipolízist az elsődleges humán adipocitákban

0,5, 1 és 2% BMJ (v/v) jól tolerálható volt, és nem volt toxikus az elsődleges humán preadipocitákra vagy adipocitákra, míg a BMJ magasabb koncentrációi (5 és 10%) citotoxikusak voltak, amint azt az LDH jelentősen megnövekedett felszabadulása és a sejtes sejtek csökkenése jelzi. ATP szintek. A differenciálódás során 5% és 10% BMJ-vel kezelt preadipocyták szignifikáns, 31% -os, illetve 57% -os növekedést mutattak az LDH felszabadulásában a kezelés során (1A. Ábra). Az 5% BMJ-vel végzett kezelés marginálisan toxikus volt (19% -os csökkenés), míg a 10% BMJ szignifikánsan 47% -kal csökkentette a sejtek életképességét (1B. Ábra), a sejtek ATP-szintjeivel mérve.

A változó BMJ-koncentrációval 24 és 48 órán át kezelt adipociták között a sejtek ATP-szintje és az LDH-felszabadulás tendenciái hasonlóak voltak a BMJ-vel kezelt differenciáló adipocitákhoz. A BMJ 5% és 10% egyaránt 21% -kal és 51% -kal növelte az LDH felszabadulást (1C. Ábra). Az 1D. Ábra azt mutatja, hogy 5% BMJ nem szignifikánsan csökkentette a celluláris ATP-t 20% -kal, míg 10% BMJ szignifikánsan 32% -kal csökkentette az ATP-szintet (p 2. ábra

A BMJ csökkenti a PPARγ, SREBP-1c és az ellenállás mRNS-expresszióját

Az adipocita transzkripciós faktorok, mint például a PPARγ és az SREBP-1c, valamint az adipocytokin, a rezisztin, döntő szerepet játszanak az adipocita differenciálódásban, az adipogenezisben és a sejtes lipidcseppek felhalmozódásában. Az a tény, hogy a BMJ csökkentette az adipocita differenciálódást, arra késztetett minket, hogy megvizsgáljuk a BMJ hatásait a PPARγ, SREBP-1c és rezisztin mRNS expressziójára. A differenciálás során 0,5, 1 vagy 2% BMJ-vel kezelt preadipociták szignifikáns csökkenést mutattak (p 4. ábra

A BMJ gátolja a perilipin mRNS expresszióját

A lipidcseppek képződését az adipocitákban, valamint a lipolízist a lipidcseppeket körülvevő membránfehérje, a perilipin szabályozza, amely szintén a PPARγ downstream célpontja az adipocitákban. A BMJ-hez társuló sejtes TG-csökkenés (3B. Ábra) és az adipociták fokozott lipolízise (3C. Ábra) jelentős csökkenéssel járt (p 7. ábra

Vita

Megfigyeltük továbbá, hogy az SREBP-1c-t, a lipid homeosztázis és az adipogenezis másik szabályozóját [40] a BMJ szignifikánsan csökkentette az elsődleges humán adipocitákban, a sejtek lipidtartalmának egyidejű csökkenésével, amelyet csökkentett olaj O-vörös festés jelzett. Huang és munkatársai tanulmányai. jelezte, hogy a teljes gyümölcsből előállított BM por gátolta az adipocita hipertrófiát az étrend által kiváltott elhízott (DIO) patkányokban, valószínűleg a lipogén gének, köztük a zsírsav-szintáz (FAS), az acetil-CoA karboxiláz (ACC 1), a lipoprotein-lipáz expressziójának csökkenése miatt. (LPL) és az adipocita zsírsavat megkötő fehérje (aP2) az epididymális zsírban, amelyek az SREBP-1c downstream áramlási célpontjai [25]. Huang és mtsai. nem figyelt meg semmilyen hatást sem a PPARγ, sem az SREBP-1c mRNS expressziójára a HFD-vel és BM-vel táplált patkányok zsírszövetében, de javasolta a BM lehetséges hatásait ezeknek a géneknek a fehérje szintjére vagy a poszttranszkripciós módosításokra [25].

A táplálékbevitelben, az energia-anyagcserében és a súlygyarapodásban szerepet játszó adipocitokinek, mint például a leptin és az adiponektin, a BMJ kimutatta, hogy sejttenyészetben és rágcsálókban végzett vizsgálatok [41, 42]. Nemrégiben bebizonyosodott, hogy az adipocitokin, a rezisztin részt vesz az emberi adipocita differenciálódásban [12]. Vizsgálatunkban a BMJ szignifikánsan csökkentette a rezisztin mRNS-expresszióját a differenciálódás során kezelt primer humán adipocitákban. Hasonlóképpen Shih és mtsai. [42] BMF-el HFD-vel táplált egerekben szintén jelentős csökkenést mutatott a zsírrezisztin expresszióban. Az elhízott egyének körében kimutatták, hogy a megnövekedett plazma rezisztin pozitívan korrelál a BMI és a zsigeri zsír változásával, valamint az hasi zsír mRNS expressziójával [43, 44]. Az a tény, hogy mérsékelt testsúlycsökkenésű alanyokban csökken a plazma rezisztinszintje [45], és az elsődleges humán adipocitákban csökkent rezisztin expresszióra utaló adataink alátámasztják azt a hipotézist, miszerint a BMJ anti-adipogenikus potenciállal rendelkezik az emberben.

A jelenlegi vizsgálatban alkalmazott BMJ-koncentrációk tartománya összehasonlítható a korábbi vizsgálatokban használtakkal [26]. Az emberi fogyasztásra szánt BMJ pontos, hatékony és biztonságos dózisa azonban nem ismert, és további klinikai értékelést igényel. A BMJ számos aktív vegyszert tartalmaz, beleértve a karantint (egy szteroid-glikozidot), a "p" polipeptidet vagy a növényi inzulint (egy 166 maradék inzulin-utánzó peptidet) [50], a glikozidokat, például a mormordint, a C-vitamint, a karotinoidokat, a flavanoidokat és a polifenolokat [51, 3.0. CO; 2- #. "Href ="/articles/10.1186/1472-6882-10-34 # ref-CR52 "> 52]. Publikálatlan és az iszlám et al. [53] megfigyelései azt mutatják, hogy a BMJ különféle polifenolok, beleértve a kvercetint és a gallus savakat A kvercetinről kiderült, hogy gátolja az adipogenezist és apoptózist indukál a 3T3-L1 egér adipocitákban [54, 55], míg a gallus savról ismert, hogy a kultúrában növeli a korai és késői apoptotikus 3T3-L1 sejtek számát. A mitokondriális membránpotenciál elvesztése [56]. Ezért feltételezzük, hogy az inzulin-utánzó peptidek, valamint a polifenolok, például a kvercetin és a galluszsav részben felelősek lehetnek a BMJ anti-adipogén tulajdonságaiért. BMJ, amelyek rendelkeznek hipoglikémiás tulajdonságok [57], de a hipolipidémiás tulajdonságokkal rendelkező pontos hatóanyagok nem ismertek.

Vizsgálataink összességében azt mutatják, hogy a BMJ gátolja a primer humán adipocita differenciálódást azáltal, hogy csökkenti a PPARγ, SREBP és perilipin mRNS gén expresszióját és fokozza a lipolízist. Állatkísérletekben, bár a BMJ csökkentette az adipozitást, Shih és mtsai. kimutatta, hogy a zsíros PPARγ mRNS expressziója szignifikánsan megnőtt a BMJ-kivonatokkal és a HFD-vel táplált DIO egerekben, összehasonlítva mind a HFD-vel táplált, mind a kontroll egerekkel [42], míg Huang és mtsai. nem figyelt meg semmilyen hatást a zsírlipolízisre azoknál a patkányoknál, amelyek BM-et kaptak HFD-vel [25]. Ezek a különbségek valószínűleg a modellrendszer (primer humán adipociták és rágcsálók), a BM-készítmények és/vagy a kísérleti körülmények közötti különbségeknek tudhatók be.

Néhány klinikai tanulmány megvizsgálta a BMJ antidiabetikus hatását emberen [58–62], azonban hosszú távú vizsgálatok tesztelték a BMJ glükóz- és lipid-anyagcserére, testtömegre gyakorolt hatását, valamint meghatározták a A BMJ indokolt, mielőtt hatékony alternatív és/vagy kiegészítő terápiaként ajánlható. Terápiás hatásától függetlenül a BMJ-t más hipoglikémiás vagy hipolipidémiás szerekkel együtt óvatosan és orvosi felügyelet mellett kell végrehajtani, annak hipoglikémiás tulajdonságai miatt [63, 64], és a túlzott fogyasztást el kell kerülni az esetleges mellékhatások, például a hasmenés miatt [61 ].

Következtetések

A keserű dinnye hatékonyan csökkentette az elsődleges humán adipocitákban a lipidfelhalmozódást azáltal, hogy szabályozta az adipogén transzkripciós faktorokat és az adipocitokin génexpressziót. Jövőbeni vizsgálatok indokolttá teszik a BM-fogyasztás emberi testsúlycsökkenésre és testzsír-felhalmozódásra gyakorolt hatásának tesztelését.