A papaverin és származékai a mitokondriális anyagcsere gátlásával sugárérzékenyítik a szilárd daganatokat

Szerkesztette: Gregg L. Semenza, a Johns Hopkins Egyetem Orvostudományi Kar, Baltimore, MD, és 2018. augusztus 10-én jóváhagyta (2018. május 24-én kapott felülvizsgálatra)

Ez a cikk rendelkezik Javítással. Lásd:

Kapcsolódó tartalom megtekintése:

Jelentőség

Az oxigénfeszültség kritikus szerepet játszik a sugárterápiára adott válaszban. Itt megmutatjuk, hogy a hipoxiás daganatok a mitokondriális légzés célzásával érzékenyek az RT-re. A 150 éves FDA által jóváhagyott papaverint tartalmazó gyógyszert mitokondriális komplex I inhibitorként azonosítottuk. A gyógyszer egyetlen adagja az RT előtt enyhíti a hipoxiát a modelldaganatokban, és feltűnően fokozza az RT-re adott választ. A jól oxigénnel táplált normál szövetek nem sugárérzékenyek. A papaverin 10A foszfodiészteráz gátló aktivitásának strukturális módosítással történő eltávolítása azonosította a komplex I-gátló radioszenzibilizátorok potenciálisan biztonságosabb generációját.

Absztrakt

A tumor hypoxia csökkenti a sugárterápia hatékonyságát azáltal, hogy korlátozza a biológiailag hatékony dózist. A daganat oxigénellátásának akut növekedése a sugárkezelés előtt ezért jelentősen javítja a daganatsejtek sugárzás utáni elpusztulását. A daganat oxigénbe juttatásának növelésére tett erőfeszítések nem mutattak pozitív klinikai eredményt. Itt megmutatjuk, hogy a mitokondriális légzés célzása a daganatos sejtek oxigénigényének jelentős csökkenését eredményezi, ami fokozott daganat oxigénellátást és sugárzási reakciót eredményez. Az FDA által jóváhagyott papaverin gyógyszer aktivitását az I. mitokondriális komplex gátlójeként azonosítottuk. Genetikai bizonyítékokat szolgáltatunk arra is, hogy a papaverin I komplex gátlása közvetlenül felelős a megnövekedett oxigénellátásért és a fokozott sugárreakcióért. Ezenkívül leírjuk a papaverin származékait, amelyek potenciálisan kevesebb mellékhatással járó klinikai sugárérzékenyítőkké válhatnak. Fontos, hogy ez a radioszenzibilizáló stratégia nem érzékenyíti a jól oxigénnel táplált normál szövetet, ezáltal növeli a sugárterápia terápiás indexét.

A hipoxia a szilárd daganatok (1) gyakori mikrokörnyezeti jellemzője, amely azért létezik, mert az oxigénellátás nem elegendő a tumor metabolikus igényének kielégítésére (2, 3). A rosszul kialakult tumoros erek megnehezítik az oxigénellátás terápiás növelését a hipoxia csökkentése érdekében (4). Több mint hat évtizeddel ezelőtt ismerték fel, hogy a hipoxia gátja a hatékony sugárterápiának (5). Ez komoly klinikai problémát jelent, mivel a daganatok több mint 50% -a sugárterápiát kap a kezelés részeként (6).

A molekuláris oxigén egy elektrofil, amely rögzíti a sugárzás okozta DNS károsodást (7, 8), 2,5-szeresére fokozva a toxicitást (9). A daganatos hipoxia csökkentése a sugárterápia előtt ezért növeli a sugárzás hatékonyságát anélkül, hogy fokozná a toxicitást a jól oxigénes normál szövetekben. A tumor hypoxia enyhítésére szolgáló korábbi stratégiák elsősorban a daganatba történő oxigénbeadás növelését célozták (10, 11). A daganat érrendszerének korlátozott funkcionalitása azonban bebizonyosodott, hogy a klinikákra történő transzláció fő korlátja.

A tumor oxigénellátásának növelésére szolgáló alternatív stratégia a tumor oxigénigényének csökkentése a mitokondriális légzés gátlásával (12). Számítási modellek azt jósolták, hogy az oxigénfogyasztás (OCR) sebességének csökkentése hatékonyabban csökkenti a hipoxiás frakciót, mint a szállítás sebességének növelése (13). Bár a közelmúltban számos gyógyszert javasoltak erre a célra (14), transzlációs potenciáljukat korlátozzák a felvételre vonatkozó követelmények, a vegyület biológiai felezési ideje, a mellékhatások okozta toxicitás vagy a vezető mutációkra vonatkozó követelmények, amelyek korlátozzák alkalmazhatóság a rák specifikus alcsoportjaira. Az optimális gyógyszer univerzális OCR-gátlással rendelkezik, gyors felvétel nélkül hordozófehérjékre, rövid felezési idő, jó biztonsági profil és gyors eltávolítás a betegtől.

Eredmények

A papaverin csökkenti az OCR-t az I mitokondriális komplex gátlásával.

Nemrégiben azt találták, hogy a papaverin (PPV) lassítja a sejtek növekedését olyan táptalajokban, amelyek szénforrásként csak galaktózt tartalmaznak (20), ami a mitokondriális funkció gátlására utal. In vitro teszteltük a PPV-t 28 rákos és normál sejtvonalból álló panelen, és azt tapasztaltuk, hogy ez csökkentheti a mitokondriális funkciót az összes tesztelt sejtben, percek alatt, alacsony mikromoláris koncentrációk mellett (1A. Ábra és SI függelék, S1. Hatásmechanizmusának meghatározásához teszteltük a PPV-t bevett mitokondriális mérgekkel kombinálva, és megállapítottuk, hogy dózisfüggően blokkolhatja a klasszikus I komplex gátló rotenon aktivitását (1B. Ábra), ami a két gyógyszer bizonyos versenyére utal. A Piericidin A vagy a kapszaicin más komplex I inhibitorokkal végzett hasonló vizsgálatban nem volt interakció (SI függelék, S1 A és B ábra). Ez azt sugallja, hogy a PPV kötődhet a rotenon helyhez, vagy esetleg, hogy kötődése blokkolja ezt a helyet, a közzétett adatokkal egyetértésben (21). Annak igazolására, hogy a PPV gátolja az I komplexet, permeabilizált EO771 sejteket kezeltünk PPV-vel vagy rotenonnal, majd egy komplex II szubsztrát-szukcináttal, amely megkerülheti az I komplex gátlását. Az 1C. Ábra azt mutatja, hogy a szukcinát mind a rotenonnal, mind a PPV-vel kezelt sejtek OCR-jét megmentette, a komplex 3 inhibitor antimicin A-val kezelt sejtekét azonban nem, megerősítve, hogy a PPV hatása a 2. komplexus előtt van (1C. Ábra).

A papaverin csökkenti az OCR-t az I. mitokondriális komplex gátlásával. (A) Reprezentatív Seahorse-adatok az OO csökkenését mutatják az EO771 sejtekben. (B) Az EO771 sejtekben jelzett módon injektált papaverin és rotenon közötti versenyvizsgálat. (C) Szukcinát mentő vizsgálat permeabilizált EO771 sejtekben. A PPV-t vagy a rotenont önmagában vagy a komplex III inhibitor antimycin A-val (AntA) kombinálva injektáltuk az A időpontban; szukcinátot (Succ) injektáltunk a B. időpontban. (D) Dózis-válasz elemzés A549 sejtvonalban. (E) Kábítószer-kimosási kísérlet A549 sejtekben, az OCR-redukció 3 órán keresztül 10 μM PPV-vel vagy 1 μM rotenonnal (bíborvörös), majd T-2 órás (kék) vagy 1 óra (fekete) eltávolítás után. A hibasávok az SD-t jelentik.

A PPV komplex I inhibitorként való hatékonyságának értékeléséhez az A549 sejteket növekvő dózisú PPV-vel és rotenonnal kezeltük. A dózis-válasz elemzés azt mutatja, hogy az OCR esetében a PPV IC50-értéke ~ 100 × magasabb, mint a rotenoné (1D. Ábra). Összehasonlítottuk a PPV hatását más, metabolikus radioszenzibilizátorként való alkalmazásra javasolt gyógyszerekkel, metforminnal és atovakvonnal is (SI függelék, S1C. Ábra). Az in vitro Seahorse-elemzés azt mutatta, hogy míg a PPV és az atovaquone 30 percet vett igénybe (1A. Ábra), a metforminnak 24 órára volt szüksége (mM koncentrációban) a teljes mitokondriális gátlás eléréséhez. Az ideális metabolikus sugárérzékenyítőknek visszafordítható aktivitással kell rendelkezniük, hogy a toxicitás lehetősége korlátozott legyen. Érdekes módon a PPV mitokondriális hatása visszafordítható in vitro, összehasonlítva a rotenon (22) és az atovaquone potenciálisan mérgezőbb irreverzibilis hatásával. A gyógyszer kimosási kísérleteiben a PPV-vel kezelt sejtek kevesebb, mint 1 óra alatt visszatértek az alapszintű OCR-be, míg a rotenonnal és az atovakvonnal kezelt sejtek 3 óra elteltével nem mutattak helyreállást a mitokondriális funkcióban. Ez a tulajdonság magyarázhatja a papaverin kiváló biztonsági profilját (15) (1E. Ábra és SI függelék, S1D ábra). Biztonságának alátámasztása érdekében sem normoxiában, sem hypoxiában nem észleltünk sejttoxicitást a PPV-vel kezelt sejtekben (SI függelék, S1 E és F ábra).

A papaverin csökkenti a tumor hipoxiáját és fokozza a sugárterápiára adott reakciót.

A papaverin az I. komplex gátlásán keresztül sugárérzékeny. (A) Az NDI1 expressziójának Western blotja az A549 szülő és az NDUFV1 KO sejtek mitokondriális frakcióiban. (B) A csak galaktózt tartalmazó táptalajban tenyésztett sejtek reprezentatív tripánkék életképessége (n = 3) (T = 96 óra). Az értékek az átlagos életképes sejtek ± SD értékét jelentik. (C) Az A549 és NDUFV1 KO ± NDI1 sejtek 10 μM papaverinre vagy 1 μM rotenonra adott válaszának csikóhal-elemzése. Az értékek átlag ± SD. (D) A pimonidazol festés mennyiségi meghatározása 2 mg/kg PPV-vel vagy vivőanyaggal kezelt NDUFV1 KO NDI1 oldalsó daganatokban (n = 3). Az érték átlagos pimonidazol-pozitív sejtek tumoronként 20 képből ± SEM. A P értéket t teszttel számoltuk. (E) A 8 Gy XRT-t (bíborvörös) vagy 2 mg/kg PPV-t kapó heterotópos NDUFV1 KO NDI1 szárnyas xenograftok daganatnövekedési késleltetésének számszerűsítése 8 Gy XRT (kék) előtt 35 perccel (n = 4). A görbék a tumor átlagos térfogatát mutatják ± SEM. A P értékeket az XRT-hez viszonyítva t-próbával számoltuk. n.s., nem jelentős.

A Papaverine újratervezhető a PDE-gátló aktivitás eltávolítására.

In vivo részleges oxigénnyomásmérések.

Pimonidazol festés.

A pimonidazol adduktokat hipoxiás régiókban vizualizálták a tumorszövet szövettani metszetein belül (39). Az EO771 és A549 oldalsó xenograftokat hordozó egereket 2 mg/kg PPV-vel vagy sóoldattal, majd 30 perccel később 60 mg/kg pimonidazollal kezeltük, és a tumorokat 90 perc múlva gyűjtöttük be. A fagyasztott metszeteket anti-pimonidazol nyúl antitesttel és anti-nyúl Alexa Fluor 488-val festettük. Az egyes tumorok hipoxiás frakcióját kvantitatívan meghatároztuk küszöbértékkel a kontroll szakaszok maximális jelének 50% -án. A pimonidazol-pozitív sejtek által lefedett területet állatonként 20 kép alapján értékeltük és átlagoltuk.

Daganatnövekedési kinetika.

A 2 × 10 6 EO771 vagy 5 × 106 A549 sejteket injektáltuk s.c. 6 hetes nőstény C57/B6 (EO771) vagy immunhiányos nu/nu (A549) egerek nőstényeibe. A daganat térfogatának kiszámításához ellentétes átmérőjű mérőeszközöket használtunk. A 150 mm 3 elérését követően a daganatokat kúpnyaláb-CT-vel vizualizálták, és a kezelési terveket kiszámították a SARRP szoftver segítségével. A röntgensugarakat egyetlen sugárral juttattuk el, 5 Gy-t juttatva a Kisállat-kutatási Sugárzási Platform (SARRP; Xstrahl) alkalmazásával. A daganatmennyiségeket addig mértük, amíg a kezelés utáni térfogat háromszorosára nőtt.

Bél kriptateszt.

A vad típusú C57/B6 egerek a hasi 7,5 Gy dózisban kapták az XRT-t a SARRP alkalmazásával. A boncolt vékonybelet 10% természetes pufferelt formalinnal (NBF) rögzítettük, mielőtt paraffinba ágyaznánk. Anti-Ki67 antitestet (Thermo Scientific RM-9106-S) a Vector Laboratories kecske anti-nyúl (DAB kromagén) detektált.

Köszönetnyilvánítás

Köszönetet mondunk Kyle Porternek a statisztikai adatokért és Navdeep Chandel az NDI1 expressziós plazmidért. A finanszírozást az NIH P01CA016776 és az R01CA163581 támogatások nyújtották.

Lábjegyzetek

↵ 1 Jelenlegi cím: Új Gyógyszerfejlesztési Intézet, Kínai Orvostudományi Egyetem, Taichung 404, Tajvan.

Szerző közreműködései: E.G., Q.-T.L., A.C.K., A.J.G., S.-C.C. és N.C.D. tervezett kutatás; M.B., X.H., S.V., S.S., J.W. és I.P. végzett kutatás; X.H. és B.Y. új reagensekkel/analitikai eszközökkel járult hozzá; M.B., S.V., J.W., E.G., Q.-T.L., A.C.K., A.J.G., S.-C.C., I.P. és N.C.D. elemzett adatok; és M.B. és N.C.D. írta a lap.

A szerzők nem jelentenek összeférhetetlenséget.