A peri-pancreas viscerális zsírszövet robusztus korai gyulladása diéta okozta elhízás során a hasnyálmirigyrák KrasG12D modelljében

Kathleen M. Hertzer

1 Sebészeti Osztály, Laboratóriumi Orvostudomány, David Geffen Orvostudományi Kar, UCLA

Mu Xu

1 Sebészeti Osztály, Laboratóriumi Orvostudomány, David Geffen Orvostudományi Kar, UCLA

Aune Moro

1 Sebészeti Osztály, Laboratóriumi Orvostudomány, David Geffen Orvostudományi Kar, UCLA

David W. Dawson

2 Patológiai és laboratóriumi osztály, David Geffen Orvostudományi Kar, UCLA

Lin Du

3 Biostatisztikai Tanszék, Fielding School of Public Health, UCLA, Los Angeles, Kalifornia

Gang Li

3 Biostatisztikai Tanszék, Fielding School of Public Health, UCLA, Los Angeles, Kalifornia

Hui-Hua Chang

1 Sebészeti Osztály, Laboratóriumi Orvostudomány, David Geffen Orvostudományi Kar, UCLA

Alexander P. Stark

1 Sebészeti Osztály, Laboratóriumi Orvostudomány, David Geffen Orvostudományi Kar, UCLA

Xiaoman Jung

1 Sebészeti Osztály, Laboratóriumi Orvostudomány, David Geffen Orvostudományi Kar, UCLA

O. Joe Hines

1 Sebészeti Osztály, Laboratóriumi Orvostudomány, David Geffen Orvostudományi Kar, UCLA

Guido Eibl

1 Sebészeti Osztály, Laboratóriumi Orvostudomány, David Geffen Orvostudományi Kar, UCLA

Absztrakt

Célkitűzések

Az elhízás növeli a rák több típusának előfordulását. Korábbi munkánk kimutatta, hogy a magas zsírtartalmú, magas kalóriatartalmú étrend (HFCD) zsigeri elhízáshoz, hasnyálmirigy-gyulladáshoz és felgyorsult hasnyálmirigy-neopláziához vezet KrasG12D (KC) egerekben. Ebben a tanulmányban a HFCD viscerális zsírgyulladásra gyakorolt hatásainak vizsgálatát tűztük ki célul, különös tekintettel a különféle visceralis zsírraktárak közötti lehetséges különbségekre.

Mód

Megvizsgáltuk mind a vad típusú (WT), mind a KC egerek súlyát és zsigeri elhízását kontroll diétán (CD) vagy HFCD-n. Három hónap elteltével az egereket feláldoztuk szövettani vizsgálatra. Multiplex vizsgálatokat is végeztek a különböző zsírraktárak közötti citokinprofilok megszerzésére.

Eredmények

A HFCD-n lévő WT és KC egerek egyaránt szignifikánsan megnövelt gyulladást mutattak a zsigeri zsírszövetben (VAT), különösen a hasnyálmirigy peri zsírjában (PPF), összehasonlítva a CD-n lévő állatokkal. Ez a hasnyálmirigy jelentősen megnövekedett gyulladásával járt. A citokinprofilok különbözőek voltak a zsigeri zsírraktárakban, valamint a HFCD-n és CD-n lévő egerek között.

Következtetések

Eredményeink egyértelműen bizonyítják, hogy a HFCD elhízáshoz és gyulladáshoz vezet az áfában, különösen a PPF-ben. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az elhízással társult gyulladás a PPF-ben felgyorsíthatja a hasnyálmirigy neopláziáját a KC egerekben.

Bevezetés

A hasnyálmirigyrák (PaCa) továbbra is az egyik legnehezebben kezelhető betegség, és most azt jósolják, hogy 2030-ra a tüdőrák után a második leggyakoribb daganatos haláleset lesz 1. Bár nagyon aktív kutatások folynak a korai felismerés új kezelési módjaival és módjaival kapcsolatban, a megelőzés és a kockázatmódosítás javítása ugyanolyan vagy talán fontosabb e halálos betegség lefolyásának megváltoztatásában. Az egyik ilyen kockázati tényező, az elhízás, számos tudományos vizsgálat tárgyát képezi, mert régóta elismert tényező számos jelentős krónikus egészségügyi probléma, köztük a cukorbetegség, a szívbetegségek, a többszörös ráktípus mellett 2 .

Az általános elhízás mellett a zsigeri zsírszövet feleslege (VAT) kifejezetten az anyagcsere-rendellenességek és a különféle rákos megbetegedések fokozott kockázatához kapcsolódik, ideértve a nyelőcső-, a vastagbél-, a máj- és a hasnyálmirigy-rákot. Számos epidemiológiai tanulmány megállapította, hogy a túlzott áfa (derék kerülete vagy CT/MRI képalkotás alapján mérve), valamint a nyelőcső- és a vastagbélrák közötti pozitív összefüggés a BMI-től 6. A túlzott áfa a rák prekurzor elváltozásainak előfordulását is növeli. Például pozitívan korrelál a gastrooesophagealis reflux betegséggel (GERD) és a Barrett-nyelőcsővel, valamint a nyelőcső adenocarcinoma 8,9-vel. A túlzott áfa növeli az alkoholmentes steatohepatitis (NASH) előfordulását is, amely a hepatocelluláris carcinoma egyre növekvő oka 10,11 .

Korábbi vizsgálataink során kimutattuk, hogy a magas zsírtartalmú, magas kalóriatartalmú étrend jelentős súlygyarapodáshoz, anyagcserezavarokhoz, hasnyálmirigy-gyulladáshoz és a hasnyálmirigy-neoplazia felgyorsulásához vezetett a hasnyálmirigyrák feltételes KrasG12D egérmodelljében 20. Jelen munka során bizonyítékokat szolgáltatunk arra vonatkozóan, hogy ebben az egérmodellben az elhízás hozzájárul a robusztus VAT gyulladáshoz, különösen a hasnyálmirigy peri zsírjában, amely viszont felelős lehet a gyulladás felgyorsításáért és a neoplasztikus progresszióért a szomszédos hasnyálmirigyben.

Anyagok és metódusok

Egér modell

A hasnyálmirigyrák modelljének feltételes KrasG12D (KC) modellje Hingorani et al. erre a vizsgálatra használták 21. Az LSL-KrasG12D és PDX-1-Cre (vagy p48-Cre) egerek keresztezésének utódait véletlenszerűen 10 hétig kontroll kontroll étrendbe (CD) vagy magas zsírtartalmú, magas kalóriatartalmú étrendbe (HFCD) osztottuk. Az egyedileg megjelölt egerek szabadon hozzáférhettek az étrendhez, valamint a vízhez. Az egyes állatok táplálékfelvételét és testtömegét hetente kétszer mértük. Az állatkísérleteket a Los Angeles-i Kaliforniai Egyetem kancelláriai állatkutatási bizottsága hagyta jóvá az NIH laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatójának megfelelően.

Genotipizálás elemzése

A vizsgálati étrendbe történő randomizálás előtt a Kras G12D és Cre allél jelenlétét a genomi DNS PCR-analízisével határoztuk meg, másutt leírva 22. A Kras G12D és a Cre alléllal rendelkező állatokat mutánsnak (KRAS +/G12D) jelöltük meg, és azokat az állatokat sem, amelyeknek sem a Kras G12D, sem a Cre allél nem volt vad típusúnak (KRAS +/+). Az áldozathoz tartozó vizsgálat végén a sikeres kivágási-rekombinációs eseményeket PCR-rel igazolták, a hasnyálmirigyben egyetlen LoxP-hely volt jelen, ahogy azt másutt leírták 22 .

Kísérleti diéták

A diétákat a Dyets, Inc.-től (Pennsylvania) szereztük be. Az elválasztott egereket CD-hez vagy HFCD-hez rendeltük, ahogy azt korábban leírtuk 20. Röviden: a kalóriák 40% -a és 12% -a zsírból származik (kukoricaolaj alapú) a HFCD-ben és CD-ben. Az étrendeket gyenge fényviszonyok között kezelték, és –20 ° C-on tárolták. Az étrendeket hetente kétszer pótolták. Az étrendben lévő zsírsavak stabilitását az UCLA Nutritional Biomarker and Phytochemistry Core rendszeresen ellenőrizte.

A minta előkészítése

A zsigeri szerveket (beleértve a májat és a hasnyálmirigyet), valamint a különféle zsírraktárakat vagy azonnal lefagyasztottuk folyékony nitrogénben történő boncolás után, és további feldolgozásig -80 ° C-on tároltuk, vagy 10% -os formalin oldatba rögzítettük, majd ezt követően paraffinba ágyazottuk. Az ivarmirigyek közelében lévő zsírszövetet zsigeri zsírnak (VF), a hasnyálmirigy szomszédos és átfedő zsírszövetét peri-hasnyálmirigy zsírnak (PPF) jelöljük.

A zsírszövet mennyiségének meghatározása

Az áldozatot megelőzően az összes egeret mikro-CT-vel készítettük az UCLA Pre-Clinical Imaging Center-ben. A teljes áfát a teljes hasi lágyrész térfogatának hányadaként határoztuk meg a Hounsfield-egységek alapján a has felső részének kiválasztott területén. A zsírszövetet a -270-100 Hounsfield egység közötti szövetként definiálták, míg a teljes lágyrészhez -270-500 Hounsfield egységet használtak.

A zsírszövet szövettana

Citokinvizsgálatok

A bepattintott fagyasztott egér zsírszövetet (VF vagy PPF) jégen leolvasztottuk, és 1xPBS-ben (pH 7,2), 1 mmol/l fenil-metil-szulfonil-fluoridban (Sigma-Aldrich) mechanikus homogenizátorral homogenizáltuk proteázgátlókkal (komplett proteázgátló koktéltabletta, Roche). szonikált. A lizátumokat ezután 4 ° C-on 15 percig 14 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk, és a felülúszót 26 g-os tűvel és fecskendővel elválasztottuk a pellettől. A fehérjekoncentrációkat bicinchonininsav fehérje esszével (Thermo Scientific) határoztuk meg, standardként szarvasmarha szérum albumint. A lizátumokat 1 mg/ml teljes fehérjekoncentrációra hígítottuk, és 96 lyukú lemezformátumban egér citokin mágneses gyöngy panelre (EMD Millipore) vittük fel. Mindegyik minta másolatát egy éjszakán át inkubáltuk rotációs orbitális rázógépen, 4 ° C-on. Ezután a lemezeket a gyártó ajánlása szerint dolgoztuk fel, és a mintákat Bio-Plex 200 HTF Analyzer Luminex rendszer (Bio-Rad) segítségével futtattuk. Az adatokat a Bio-Plex Manager 6.1 szoftverrel (Bio-Rad) nyertük, és tovább elemeztük a Microsoft Excel alkalmazással.

Hasnyálmirigy szövettana

Az egyes állatok hasnyálmirigy-szakaszait hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festettük, és egy GI-patológus (D. Dawson) elemezte a kezelés körülményeitől elvakítva. A gyulladást a korábban leírtak szerint osztályozták (Dawson 2013). Röviden, az acináris veszteség a teljes keresztmetszet százalékos veszteségén alapult, és 0 = hiányzott; 1 = 1–25%; 2 = 26–50%; 3 = 51–75%; 4> 75%. A gyulladás alapja a lobularis gyulladásos sejtek 40 × nagy teljesítményű mezőre vetített átlagos száma (HPF; 10 nem átfedő HPF-ben számolva) és 0 = hiányzik; 1 = 1–30 sejt; 2 = 31–50 sejt; 3 = 51–100 sejt; 4> 100 sejt. A fibrózis a teljes hasnyálmirigy stromalis fibrózisának kumulatív területén alapult, és 0 = hiányzott; 1 = 1–5%; 2 = 6–10%; 3 = 11–20%; 4 => 20%. Az egér PanIN-eket a korábban leírt hisztopatológiai kritériumok szerint osztályozták 20. Meghatároztuk a ductalis elváltozások teljes számát és fokozatát. A hasnyálmirigy-lobulánként csak a legmagasabb fokú elváltozást értékelték. Mintegy 100 hasnyálmirigy-csatornát elemeztek a teljes rögzített mintából (a hasnyálmirigy feje, teste és farka) minden állat esetében. Az egyes mPanIN-ek és az elemzett csatornák teljes számának relatív arányát feljegyeztük minden állat esetében.

Statisztikai analízis

Az értékeket átlag ± SEM formában mutatjuk be. A szignifikanciát párosítatlan t teszt alkalmazásával határoztuk meg, a szignifikanciát az 1. ábra p-értékénél határoztuk meg. Annak meghatározása érdekében, hogy a teljes súlygyarapodás hogyan korrelál az VAT növekedésével, az összes egeret leölés előtt mikro-CT-vel készítettük. A felső has meghatározott területének felhasználásával az összes áfa-nyereséget az azonos régió teljes lágyrészének frakciójaként mértük. A HFCD-n lévő WT egerek hozzávetőlegesen kétszer nagyobb összes áfát nyertek, mint a CD-vel táplált WT egerek (p 1. ábra). Az áfa növekedése szorosan korrelált a súlygyarapodással (Pearson-korrelációs együttható> 0,9; nem látható). A KC egerek a VAT-mennyiség növekedését mutatták a mikro-CT-vel számszerűsítve. Míg a hím KC egerek gyarapodtak

Kétszer nagyobb áfatérfogat, mint CD társaiknál (hasonlóan a WT egerekhez), a HFCD-vel táplált nőstény KC egerek nem növelték szignifikánsan a teljes áfa mennyiségüket (1. ábra). Általában a nőstény egerek súlya kevesebb, mint hím társaiké, a KC egereké pedig kevesebb, mint a WT egereké. Ezek az eredmények azonban azt mutatják, hogy a WT és a KC egerek egyaránt híznak egy HFCD-n, és a súlygyarapodás összességében szorosan összefügg a teljes áfa növekedésével.

A CD és a HFCD hím és nőstény WT (A) és KC (B) egerek gyulladásos gócait számszerűsítettük. A reprezentatív szövettani képek a felső sorokban láthatók. *, p 2A ábra, nyílhegy). Ezután megszámoltuk az egerek számát, amelyekben a VF-ben vagy a PPF-ben nagy limfoid aggregátumok láthatók (2C. Ábra). Összességében a lymphoid aggregátumok gyakrabban fordultak elő a PPF-ben, mint a VF-ben (p 2C. Ábra). Ezenkívül kimutatták, hogy a limfoid aggregátumok gyakrabban fordulnak elő a KC egerekben, mint a WT egerekben, és a HFCD-vel táplált egerekben (összehasonlítva a CD-vel) (2C. Ábra).

Az irodalom bizonyítja, hogy a különféle zsigeri zsírraktárak eltérő metabolikus fenotípusai gyakran megfelelnek az egyes adipociták különböző méretének 13. Annak értékelésére, hogy modellünkben a PPF és a VF potenciálisan eltérő metabolikus fenotípusokat mutat-e, kvantifikáltuk az egyes adipociták méretét (területét) mind VF-ben, mind PPF-ben. Mind a WT, mind a KC egereknél a PPF-ben lévő adipociták lényegesen kisebbek, mint a VF-ben (3A, B ábrák). Ezenkívül a HFCD jelentősen megnövelte az adipocita méretet mind a VF, mind a PPF esetében. A HFCD hatása az adipocita méretére azonban szignifikánsan erőteljesebb volt a VF-ben, mint a PPF-ben.

A zsigeri (VF) és a peri-hasnyálmirigy-zsír (PPF) depóban lévő adipociták méretét mind WT (A), mind KC (B) egerekben megmértük. Egérenként tíz képet készítettek, és képenként 10 adipocitát mértek. A terület az átlag ± SEM. *, p 4A, B ábra. Leggyakrabban ezen citokinek kiindulási expressziója nőtt a PPF-ben a VF-hez képest. Ezenkívül a HFCD növelte bizonyos citokinek expresszióját specifikusan a PPF-ben, de nem a VF-ben (4C. Ábra). Ezek az adatok együttvéve egyértelműen jelzik, hogy a citokin expresszióval mért funkcionális különbségek (kiindulási érték és az étrendre adott válasz) mind a WT, mind a KC egerekben fennállnak a VF és a PPF között.

A szöveti citokinszinteket a VF és a PPF depóban mértem a multiplexemet. A VF-ben a kiválasztott citokinek szöveti szintjét normalizáltuk 1-szeresére, és a WT (A) és a KC (B) egerekben ábrázolt PPF-változás többszörösére változott. Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be. A CD-vel és HFCD-vel táplált egerek VF és PPF szöveti IFN-y szintjét a C) ábrán mutatjuk be. *, p. 5A. ábra), amelyet a normál acináris szerkezet elvesztése mutat (12 ± 4% CD vs. 37 ± 10% HFCD), a gyulladásos sejtek beszivárgásának növekedését (11 ± 4 CD vs. 26 ± 6 HFCD) és a stromális fibrózis növekedésével (5 ± 2% CD vs. 20 ± 6% HFCD). HFCD-n lévő KC egerekben valamivel több PanIN1b és PanIN2 irányába mutató tendencia figyelhető meg (összehasonlítva a CD-vel), bár ezek a változások a 10. héten nem érték el a statisztikai szignifikanciát (5B. Ábra). WT egerekben nem tapasztaltak neopláziát, bár a HFCD-vel táplált egerekben hasnyálmirigy-gyulladás bizonyítékát tapasztalták (az adatokat nem közöltük). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a HFCD 10 hétig történő etetése lényegesen robusztusabb gyulladásos környezetet hoz létre a hasnyálmirigyben (összehasonlítva a CD-vel táplált egerekkel); ebben a korai stádiumban azonban nem mutatható ki szignifikáns különbség a hasnyálmirigy neoplasztikus elváltozásaiban a CD- és a HFCD-vel táplált KC egerek között.

A kontroll diétával vagy HFCD-vel táplált egerek hasnyálmirigyének gyulladásos paramétereinek szemikvantitatív elemzése. (A) Az intakt acinik százalékos arányát (%), az acinarsejt-veszteség százalékos arányát (%), a gyulladásos sejtek számát egy HPF-re és a stromális fibrózis százalékos arányát (%) elemeztük. *, 13,26,27 .

Nagyon kevés ismeret áll rendelkezésre a PPF emberi hasnyálmirigy-betegségben betöltött szerepéről. Súlyos akut hasnyálmirigy-gyulladás esetén a PPF-nekrózis összefüggésben van a betegség súlyosságával 28. A PaCa-ban a rákos sejtek invázióját a PPF-ben a pancreatoduodenectomia 29–31 utáni rossz eredmény független előrejelzőjeként azonosították. Az Ela (elasztáz) -Kras egér modell PEDF (pigmentált epitheliumból származó faktor) hiánya invazív PaCa-hoz vezetett, amely a megnövekedett PPF 32-hez társult, ami összefüggést sugall a PPF és a hasnyálmirigy ductalis adenocarcinoma progressziója között. Nemrégiben azt találták, hogy a PEDF elhízásellenes hatást fejt ki az inzulinrezisztencia ellensúlyozásával és magas koncentrációban elnyomja a hasnyálmirigy daganat növekedését 33. Ezzel szemben a PEDF null egereknél csonka elhízás és fokozott PPF 34 van .

Eredményeink arra utalnak, hogy az elhízással járó VAT gyulladás érdekes célpont lehet a PaCa fejlődésének megakadályozásában. A bariatrikus műtét a kórosan elhízott betegek szokásos kezelésévé vált. Csökkentheti a PPF 40 méretét. A bariatrikus műtétet követő hosszú távú nyomon követés megerősítette a súlycsökkenést, valamint a többféle ráktípus, különösen a mell- és az endometrium rák 41–43 előfordulásának csökkenését. Az orvosi terápia is ígéretes eredményeket hozott. Egy nemrégiben végzett tanulmány kimutatta, hogy a tiazolidinedionok (TZD), a PPAR (peroxiszóma proliferátor-aktivált receptorok) liganduma csökkentheti a zsírszövet gyulladását és csökkentheti a PPF 44 méretét. A metformin, amely közismerten növeli az inzulinérzékenységet és súlycsökkenést okoz elhízott betegeknél, kimutatták, hogy csökkenti a PaCa kockázatát a II. Típusú cukorbetegségben, valamint számos más rákos megbetegedésben. .

Összefoglalva: eredményeink azt mutatják, hogy egy HFCD a VAT fokozott gyulladásához vezet, különösen a peri-pancreas régióban, a PaCa KC egérmodelljében. A fokozott VAT gyulladás fokozott hasnyálmirigy-gyulladással járt, de a hasnyálmirigy neoplazia kialakulása előtt következett be. Korábbi beszámolónkkal együtt, amely kimutatta a fokozott hasnyálmirigy neopláziát a KC egerekben, akik hosszabb ideig tápláltak HFCD-t, ezek az eredmények határozottan utalnak az VAT gyulladás fontos és korai szerepére a hasnyálmirigyrák kialakulásában.

Köszönetnyilvánítás

Országos Egészségügyi Intézetek (P01CA163200, DK41301, UL1TR000124, T32 Gasztroenterológiai képzési támogatás DK07180-40) és a Hirshberg Alapítvány a Hasnyálmirigyrák Kutatásához