A pioglitazon hatása az alkoholmentes zsírmáj betegségre konstitutív androsztán receptor expresszió hiányában

1 Belgyógyászati Klinika, Csung-Ang Egyetem Orvostudományi Főiskola, 102., Heukseok-ro, Dongjak-gu, Szöul 06973, Koreai Köztársaság

2 Szöuli Nemzeti Egyetemi Kórház Orvostudományi Kutatóintézet, 101. Daehak-ro, Jongno-gu, Szöul 03080, Koreai Köztársaság

3 Preklinikai Kísérleti Központ, Szöuli Nemzeti Egyetem Bundang Kórház, 82, Gumi-ro 173 Beon-gil, Bundang-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do 13620, Koreai Köztársaság

4 Clinical Trials Center, Severance Hospital, Yonsei University Health System, 50-1, Yonsei-ro, Seodaemun-gu, Szöul 03722, Koreai Köztársaság

5 Belgyógyászati Klinika, Szöuli Nemzeti Egyetem Orvostudományi Főiskolája, 101, Daehak-ro, Jongno-gu, Szöul 03080, Koreai Köztársaság

Absztrakt

1. Bemutatkozás

Az alkoholmentes zsírmájbetegség vagy a steatohepatitis (NAFLD/NASH) egy zsírmájbetegség, amelyet étrend okozta elhízás okoz. Egy nemrégiben végzett epidemiológiai tanulmány szerint a NAFLD prevalenciája világszerte 25,24%, a gyermekeknél pedig 7,6% [1]. Az elhízás, a 2-es típusú diabetes mellitus és a dyslipidaemia szorosan összefüggenek a NAFLD-vel [2], és hozzájárulnak a betegség előrehaladásához a májfibrózishoz és a cirrhosishoz [3]. Az inzulinrezisztencia jól elismert kockázati tényező a NAFLD számára [4]. Az inzulinrezisztencia következtében fellépő hiperinsulinémia nemcsak a lipidszintézist, hanem a májsejtek zsírsavfelvételét is növeli az adipociták fokozott lipolízise miatt [2]. Életmódbeli beavatkozást (diéta és testmozgás) és farmakológiai kezeléseket, például E-vitamint, pioglitazont és pentoxifillint alkalmaznak a NAFLD kezelésére [3].

Ezek közül a gyógyszerek közül néhány pioglitazon egyes humán vizsgálatokban kimutatta, hogy javítja a NAFLD-t [5, 6]. A pioglitazon csökkenti az éhgyomri és az étkezés utáni glükózszintet is azáltal, hogy javítja az inzulinérzékenységet a 2-es típusú diabetes mellitusban [7], és jelenleg antidiabetikus gyógyszerként alkalmazzák. A pioglitazon a peroxiszóma proliferátor által aktivált gamma receptorhoz (PPARγ), a nukleáris receptor szupercsalád tagja, amely kulcsszerepet játszik a glükóz szabályozásában és a lipid anyagcserében [8]. A pioglitazon a máj hidroxilezésével és oxidációjával nagymértékben metabolizálódik, és legalább négy elsődleges metabolitot (M-I, M-II, M-IV és M-V) és két másodlagos metabolitot (M-III és M-VI) képez [9]. A farmakológiailag aktív M-IV és M-III a fő metabolitok, amelyek megtalálhatók az emberi szérumban.

A pioglitazont többféle citokróm P450 (CYP) enzim, elsősorban a CYP2C8, a CYP3A4 és a CYP2C9 metabolizálja [9, 10], amelyeket a xenobiotikus receptorok konstitutív androsztán receptorai (CAR) szabályoznak [11]. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a CAR a gyógyszer metabolizmusának mértékének megváltoztatásával különbségeket okozhat a gyógyszer hatékonyságában. Például az acetaminofent metabolizáló enzim CYP1A2, CYP3A11 és glutation S-a transzferáz CAR-függő módon aktiválódik a vad típusú egerek acetaminofénnel történő kezelése és májkárosodás indukálása után, a CAR null egerekben azonban nem [12]. Ezért a CAR aktivitása befolyásolhatja a pioglitazon metabolizmusát, és a pioglitazone hatása az anyagcsere mértékétől függően változhat.

Ezenkívül a CAR aktivitása befolyásolja a máj steatosisát. A CAR expressziójának CAR agonistával (TCPOBOP) történő stimulálása csökkentette a steatohepatitist metionin kolinhiányos étrenddel táplált egerekben [13]. A CAR az NR1 alcsalád tagja; számos más nukleáris receptor, például a pregnán X receptor; PPARα, β, γ; máj X receptorok α, β; és a farnezoid X receptor α tagjai az NR1 alcsaládnak és kapcsolatban állnak a NAFLD patogenezisével [14]. Így a pioglitazon és a NAFLD közötti hatások közötti különbségeket befolyásolhatja a CAR aktivitása és több gén közötti kölcsönhatás.

Ebben a tanulmányban feltételeztük, hogy a pioglitazon NAFLD-re gyakorolt hatását a CAR aktivitása befolyásolja. Ennek a hipotézisnek a megerősítéséhez megvizsgáltuk a CAR deléció hatását az egér májban a pioglitazon által kiváltott NAFLD változásokra és a kapcsolódó génexpresszióra.

2. Anyag és módszerek

2.1. Állatok és vizsgálati gyógyszerek

A CAR +/+ (vad típusú, C57BL/6J) egereket az Orient Bio, Inc. (Seongnam, Korea) szállította. A vad típusú egereket két csoportra osztottuk (kontroll versus CAR aktiváció). A CAR-aktiváció kiváltására hetente egyszer 3 mg/kg TCPOBOP (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) intraperitoneális injekciót adtunk be. A homozigóta CAR knockout (CAR -/-) egereket géncélzással állítottuk elő, ahogy azt korábban leírtuk [15], majd visszakereszteztük C57BL/6J egerekre a tizedik generációig. Visszakereszteztük őket CAR +/+ C57BL/6J egerekkel (Orient Bio), és kontrollként használtuk őket. Az egereket szobahőmérsékleten (23 ± 1 ° C) helyeztük el, 12: 12-órás világos-sötét ciklusokkal és vízhez jutással ad libitum.

Normál chow étrendben (Purina besugárzott laboratóriumi chow 38057, Purina Korea, Szöul, Korea) és magas zsírtartalmú étrendben (60 kcal% zsírtartalmú étrend, D12492, Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ, USA) táplálkozási körülmények között, 8 –10 hetes CAR +/+ hím (kontroll és TCPOBOP kezelt) és CAR -/- egereket vivőanyag- vagy kezelési csoportokba soroltuk a pioglitazon-hidroklorid beadása szerint (Takeda Chemical Industries, Osaka, Japán). A pioglitazon-hidrokloridot 10 mg/kg/nap dózisban adták be orálisan, 12 hétig keverve az étrenddel. Minden kísérleti csoport legalább 4 egeret tartalmazott, és a kísérletet háromszor megismételtük.

Különböző koncentrációjú pioglitazon-hidroklorid (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA) beadása során a CAR +/+ és a CAR -/- egereknek (1, 3, 10, 20 vagy 30 mg/kg), a pioglitazont szondával adták naponta egyszer, 14 napig. A pioglitazon-hidrokloridot feloldottuk Solutol HS-15-ben (9% foszfáttal pufferolt sóoldatban). Hasonló szérum pioglitazon-koncentrációt észleltünk, amikor a pioglitazon különböző koncentrációját adtuk CAR +/+ egereknek (10 és 20 mg/kg) és CAR -/- egereknek (1 és 3 mg/kg).

A pioglitazon kezelés utáni rövid távú génexpressziós változások kimutatásához rövid távú (6 órás) kísérletet hajtottunk végre. Az egereket 4 CAR +/+ és CAR -/- egércsoportra osztottuk, attól függően, hogy pioglitazont és/vagy lipidet adtunk be. Minden csoportba három egér került. A pioglitazon-hidrokloridot (20 mg/kg) és 3 g/kg 20% -os intralipidet (LIPO MCT injekció, Dongkook Pharmaceutical Co., Chungbuk, Korea) intraperitoneális injekcióval adtuk be.

Az összes állatot 6 órás éhgyomorra feláldoztuk 06: 00-tól kezdődően. Az egereket Zoletil® (Virbac, Carros, Franciaország) intraperitoneális injekcióval érzéstelenítettük, és az összes testzsírt egy kis állat testösszetétel-analizátorral, a PIXImus-mal (GE Healthcare, Kis Chalfont, Egyesült Királyság). A májat gyorsan eltávolítottuk, lemértük és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk az RNS extrahálásához. A fehér és barna zsírt is eltávolítottuk, lemértük és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. A vizsgálati protokollt a Szöuli Nemzeti Egyetem Bundang Kórházának (Koreai Köztársaság, Seongnam) intézményi állatgondozási és felhasználási bizottsága hagyta jóvá (BA1012-074/068-1).

2.2. A testtömeg és a glükóz tolerancia mérése

A testtömeget hetente ellenőriztük. A táplálékfelvételt 3 naponta mérték. A vércukorszintet glükométerben leolvasott reagenscsíkokkal ellenőriztük (ACCU-CHEK Active, Roche, Mannheim, Németország). Az intraperitoneális glükóz tolerancia tesztet 12 órás éhgyomorra végeztük 1 g/kg glükóz intraperitoneális injekcióval a kísérletek utáni 12. héten. A farokvénából származó vércukorszintet glükométerrel határoztuk meg glükózinjekció előtt és 15, 30, 60, 90 és 120 perccel a glükózinjekció után.

2.3. A lipidprofil és az inzulin mérése

A szérum összes koleszterinszintet, trigliceridet, nagy sűrűségű lipoprotein koleszterint és alacsony sűrűségű lipoprotein koleszterint egy Beckman Coulter AU480 automatikus biokémiai elemző rendszerrel (Brea, CA, USA) határoztuk meg a gyártó által biztosított reagenskészletekkel. A lipidek extrahálásához a szöveteket jéghideg PBS-sel öblítették, hogy a felesleges vért és apró darabokat alaposan eltávolítsák, majd 100-200 ° C-on homogenizálták őket.μL PBS üveg homogenizátorral jégen. A kapott szuszpenziót egy éjszakán át -20 ° C-on tároltuk. A sejtmembránok további elszakadásához két fagyás-olvadási ciklust hajtottunk végre. Ezt követően a homogenizátumokat 5 percig centrifugáltuk 5000x-nél

. A vizsgálathoz a felülúszót használtuk. Triglicerid ELISA kitet (Aviva Systems Biology, San Diego, Kalifornia, USA) és teljes koleszterin vizsgálati készletet (BioVision Inc., Milpitas, CA) használtunk a vizsgálathoz. Az inzulint egér inzulin ELISA készlettel (ALPCO Diagnostics, Windham, NH, USA) mértük a gyártó protokolljának megfelelően.

2.4. Szövettani elemzés

A máj bal lebenyét eltávolítottuk, PBS-sel öblítettük, 10% formaldehid-PBS oldatban rögzítettük és paraffinba ágyazottuk. A szöveteket 5-nél metszettük μm vastagságú és hematoxilinnel és eozinnal festett.

2.5. A pioglitazon koncentráció mérése

A pioglitazon koncentrációit nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával elemeztük (Agilent 1200 sorozat, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). A pioglitazon-hidrokloridot 50% -os acetonitrilben hígítottuk, így 100% -os oldatot kaptunk μg/ml munkaoldat. Ezt a munkaoldatot vak plazmával hígítottuk különböző koncentrációjú standard oldatok előállítására (5, 10, 50, 100, 500, 1000 és 2000 ng/ml). Ezt a standard oldatot (0,2 ml) összekeverjük 10-gyel μL/1 μL/ml formoterol és 600 μ1 acetonitrilt, majd 5 percig centrifugáltuk 13226x-on. Ezután 100 μg/ml felülúszót összekeverünk 500-tal μ1 5 mM ammónium-formiát: acetonitril (20:80, 0,1% trifluor-ecetsav). Ez a keverék (0,1 μL) folyadékkromatográfiával-tömegspektrometriával/tömegspektrometriával vizsgáltuk, és a grafikonokat elemeztük.

2.6. RNS izolálás és kvantitatív valós idejű PCR

2.7. Statisztikai analízis

A statisztikai elemzést nem-paraméteres analízissel végeztük Mann – Whitney teszt alkalmazásával. Statisztikai szignifikanciát a P +/ + és CAR -/- egerek (1. ábra (a)). A teljes testzsír százalékos aránya megnőtt a pioglitazonnal kezelt CAR +/+ egerekben, de ezt a hatást a CAR deléció megfordította (1. ábra (b)). Az étkezés mennyisége hasonló volt a csoportok között (bemutatott adatok). A máj súlya nem különbözött a csoportok között (1. ábra (c)). Bár az éhomi inzulinszint nem mutatott szignifikáns különbséget (1. ábra (d)), a pioglitazon-kezelés szignifikánsan gátolta a vércukorszint emelkedését a CAR -/- egerek minden idõpontjában, és a CAR +/+ egerek csoportjában szignifikánsan megemelte a vércukorszintet, kivéve a glükózterhelés után 120 percig (1. ábra (e)). A szérum összes és nagy sűrűségű lipoprotein koleszterinszintje szignifikánsan magasabb volt a CAR -/- egerekben, mint a CAR +/+ egerekben. A pioglitazon-kezelést követően azonban nem volt szignifikáns változás a lipidprofilokban (1. ábra (f)). A máj koleszterin- és trigliceridszintje sem különbözött a pioglitazon-kezelés után (1. ábra (g)).