A propolisz és a gamma-ciklodextrin hatása a normál testsúlyú és elhízott egerek bél neopláziájára

A Commonwealth Medical College, Scranton, Pennsylvania, 18509

Wilkes Egyetem, Wilkes-Barre, Pennsylvania, 18766

A Commonwealth Medical College, Scranton, Pennsylvania, 18509

Penn State Hershey Orvostudományi Főiskola, Hershey, Pennsylvania, 17033

A Commonwealth Medical College, Scranton, Pennsylvania, 18509

Levelezés

Darina L. Lazarova, a Commonwealth Medical College, Scranton, PA 18509. Tel: 570-504-9645; Fax: 570-504-9636; E-mail: [email protected]

A Commonwealth Medical College, Scranton, Pennsylvania, 18509

Wilkes Egyetem, Wilkes-Barre, Pennsylvania, 18766

A Commonwealth Medical College, Scranton, Pennsylvania, 18509

Penn State Hershey Orvostudományi Főiskola, Hershey, Pennsylvania, 17033

A Commonwealth Medical College, Scranton, Pennsylvania, 18509

Levelezés

Darina L. Lazarova, a Commonwealth Medical College, Scranton, PA 18509. Tel: 570-504-9645; Fax: 570-504-9636; E-mail: [email protected]

Absztrakt

Bevezetés

Noha a vastagbélrák általános előfordulása az elmúlt 35 évben csökken, a betegség előfordulása a 20-34 éves korosztály körében nőtt, és 2030-ig a vastagbélrák (CC) akár 90% -kal is növekedhet ) előfordulása ebben a korcsoportban 1. Az incidencia életkorának ez a változása részben a gyermekek és serdülők körében tapasztalható növekvő elhízásnak tudható be 2. Noha vitatják az elhízás hajlamát a bél neopláziájára, az egyik lehetőség az, hogy az elhízással összefüggő citokinek (adipokinek) együttműködnek a rákot kiváltó mutációkkal, hogy támogassák a vastagbél neoplasztikus fejlődését. Az ebbe a szövetbe beszivárgó zsírszövet és makrofágok magas szintű citokint választanak ki, beleértve a TNFalpha-t, az interleukinokat és a WNT5A-t, amelyek aktiválják az AKT, az ERK, a JNK és a JAK/STAT jelátvitelt 3. A közelmúltban a The Cancer Genome Atlas (TCGA) adatainak elemzése feltárta, hogy az elhízott CC betegeknél (testtömeg-indexük 30 vagy annál nagyobb) alacsonyabb a vezető génmutációk száma, mint a normál testsúlyú CC betegeknél 4. Ennek a megfigyelésnek az egyik lehetséges magyarázata, hogy az elhízott egyének túlélési útvonalának neoplazmát elősegítő szintjét az adipokinek, nem pedig a vezető génmutációk tartják fenn.

Vizsgálatunk célja annak megállapítása volt, hogy vajon a propolisz kiegészítés elnyomja-e a diéta okozta elhízással járó egerek további neoplasztikus terhelését. Használtuk Propolisz a Cyclopowerrel (Manuka Health New Zealand), amelyet korábban jellemeztünk in vitro 14, 16. Ez a propolisz-kiegészítő az oligoszacharid gamma-ciklodextrinnel van megfogalmazva; ezért az oligoszacharidot kontroll kiegészítőként vonták be az intervenciós étrendbe.

Anyagok és metódusok

Állatok

Szövetelemzések

A beleket (vékonybél és vastagbél) boncoltuk, Histochoice MB-ban (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) rögzítettük 24 órán át, és 70% -os etanolba helyeztük. A reprezentatív szöveteket sérüléssel vagy anélkül folyékony nitrogénben lefagyasztották. A bél neoplazmáit három kutató számlálta, és az átlagos számot e független számlálások alapján számoltuk ki. Az elváltozások méretének becsléséhez az elváltozásokról készült képeket AmScope MA ‐ 1000 kamerával készítettük Nikon SMZ645 boncoló mikroszkópon, képeket készítettünk a Nikon ACT ‐ 1 szoftver segítségével, és az elváltozások méretét (felületét) Image segítségével állapítottuk meg. J. A bélenkénti összes elváltozás legalább 70% -át feldolgozták az átlagos méret eléréséhez. A szövettani vizsgálatokhoz a „svájci tekercs” technikát alkalmaztuk a belek teljes hosszának elemzésére 24. A hisztopatológiai értékelések hematoxilinnal és eozinnal festett tárgylemezeken alapultak, amelyeket két vak vakított az intervenciós patológusok számára, és az egerek bélneopláziájának nomenklatúrája szerint 20. Az alacsony és magas fokú diszpláziát a bél neoplazia nomenklatúrájának ajánlásával határoztuk meg egérmodellekben 20 .

Sejtkultúra és vegyszerek

Az emberi kolorektális rákos HCT-116 sejtvonal, a normál humán magzati vastagbél sejtvonala, a CCD841CoN és az egér fibroblaszt 3T3-L1 sejtvonala az American Tissue Culture Collection cégből származik. A sejteket alfa-MEM táptalajon tenyésztettük, 10% marha magzati szérummal. Koffeinsav-fenetil-észter (CAPE) -javított propolisz (Propolisz a CycloPower segítségével) a Manuka Health New Zealand Ltd. ajándéka volt in vitro vizsgálatok során a propoliszt 100 mg/ml dimetil-szulfoxidban oldottuk; a törzsoldatot –80 ° C-on tartottuk.

Western blot elemzések

Exome szekvenálás és elemzés

Az egér exóm szekvenálását parafinba ágyazott vékonybélből származó genomi DNS-en végeztük. DNS-kivonás, könyvtár előkészítés, Agilent SureSelect egér (51 Mb) rögzítés; A HiSeq2500 PE100-125 és a DNSnexus platform exómanalízisét (In/Del, SNV és CNV elemzés) Otogenetics (Norcross, GA) végezte. Az összes adatot elemeztük a BWA térképészeti szoftverrel (az alacsony divergens szekvenciák feltérképezéséhez egy nagy referencia genomhoz képest) és a Genomelemző eszközkészlettel (SNP/Indel pipeline, a nagy teljesítményű szekvenálási adatok elemzésére szolgáló szoftver, amelyet a Broad Institute fejlesztett ki). Az egy nukleotid polimorfizmus (SNP) annotálását GRCm38/mm10 referenciagenomra végeztük. A szomatikus mutációk adatbázisát rákhoz kapcsolódó gének mutációira kerestük (felsoroljuk a COSMIC-ben, a rákos szomatikus mutációk katalógusában (http://cancer.sanger.ac.uk/census/).

Statisztika

Az adatokat átlag ± szórásként (SD) adtuk meg. A páros nélküli Student-féle t-teszt analízist alkalmaztuk a statisztikai különbségek jelentőségének meghatározására a mutációk számában a kontroll étrendben lévő egerek és a nyugati típusú étrenden lévő egerek között. A különbségeket jelentősnek tekintették a P

Eredmények

Testtömeg és élelmiszer-fogyasztás

A kontroll étrendnek, gamma-ciklodextrinnel ellátott kontroll étrendnek és a propolisz-kiegészítõ kontroll étrendnek kitett egerek átlagos testtömeg-növekedése összehasonlítható volt (5,8 ± 1,9, 5,9 ± 1,7, illetve 6,1 ± 0,9 gramm, egyirányú) ANOVA csoportok: P = 0,960). A nyugati étrendnek, a gamma-ciklodextrinnel ellátott nyugati étrendnek és a propolisz-kiegészítéssel ellátott nyugati étrendnek kitett egerek átlagos testtömeg-növekedése 9,0 ± 4,3, 9,1 ± 2,0 és 5,2 ± 1,0 gramm volt, egyirányú az ANOVA csoportok között: P = 0,052 (1A. Ábra). Mind a hat beavatkozási csoport között az egyirányú ANOVA jelentős különbségeket állapított meg a testtömeg-növekedésben [F(5, 26) = 3,2063, P = 0,022]. Az élelmiszerfogyasztás hasonló volt a kontroll, a kontroll-ciklodextrin és a kontroll-propolisz diéta egerei között (10,3, 8,8 és 8,3 kcal/egér/nap). Hasonlóképpen, az élelmiszer-fogyasztás nem különbözött szignifikánsan a nyugati étrendben, a gamma-ciklodextrinnel ellátott nyugati étrendben vagy a propoliszos nyugati étrendben (14,6, 13,0, 14,0 kcal/egér/nap).

Neoplasztikus terhelés: a béldaganatok száma és nagysága

A mind a hat beavatkozás elemzésekor a három kezelés közötti fent említett különbségek mellett (a kontroll vagy a nyugati étrend összefüggésében) egy Tukey utólagos tesztje, amely 95% -os megbízhatósággal igazította a többszörös összehasonlításokat (P 2), közepes (5–10 mm 2) és nagy (> 10 mm 2). Ezt a kategorizálást az átlagos méretű elváltozások tartománya indokolja mind a hat beavatkozási csoportban (a tartományt a legkisebb 4,6 ± 0,8 mm 2 méret alapján határoztuk meg, amelyet gamma-ciklodextrinnel táplált nyugati étrendet tápláló egereknél észleltünk, és a legnagyobb 8,0 ± 0,7 mm 2 nyugati étrenddel etetett egerekben). A közepes méretű (5–10 mm 2) daganatok százaléka statisztikailag szignifikáns módon nem különbözött a hat diétás beavatkozás között [F(5, 26) = 0,4325, P = 0,822] (2B. Ábra). Azonban a kis és nagy adenómák százalékos aránya fordított korrelációt mutatott az elváltozások méretével (2A., C. Ábra). A kiegészített kontroll és a nyugati étrenddel rendelkező csoportok nagyobb számban mutattak ki kicsi (2, 2A. Ábra) daganatot és alacsonyabban a nagy (> 10 mm 2, 2C. Ábra) daganatot, összehasonlítva a megfelelő étrendekkel kiegészítők nélkül.

A 10 mm 2-nél nagyobb felületű neoplazmák százalékos arányának elemzése (2C. Ábra) szignifikáns különbséget mutatott ki a hat beavatkozási csoport között [F(5, 26) = 3,0335, P = 0,028]. A Tukey post hoc tesztje megállapította, hogy a nagy (> 10 mm 2) neoplazma magasabb volt a nyugati étrendet tápláló egerekben (23,5 ± 9,8%), összehasonlítva a propolisz-kiegészítéssel kontroll étrendet fogyasztó egerek százalékos nagy daganataival ( 8,2 ± 6,5%, P = 0,043) (W vs. CP, 2C. Ábra). Emellett a nagy (> 10 mm 2) neoplazma magasabb volt azoknál az egereknél, akik nyugati étrendet fogyasztottak étrend-kiegészítők nélkül (23,5 ± 9,8%), mint gamma-ciklodextrinnel nyugati étrendet fogyasztó egerekben (11,8 ± 8,1%)., P = 0,034) (W vs. WD, 2C. Ábra). Az 5 mm 2 -nél kisebb daganatok százalékos arányának elemzése szintén szignifikáns különbséget mutatott ki a hat beavatkozási csoport között [F(5, 26) = 2,6228, P = 0,048] (2A. Ábra). Tukey post hoc tesztje azt mutatta, hogy a kis (2) daganatok százaléka alacsonyabb volt a nyugati étrendet tápláló egerekben (42,3 ± 10,6%), összehasonlítva a propolisz-kiegészítéssel kontrollt fogyasztó egerekben elért kis daganatokkal (64,8 ± 8,2%, P = 0,030) (W vs. CP, 2A. Ábra).

A bélelváltozások fokozata

Molekuláris vizsgálatok

A nyugati étrend három intervenciós csoportja között a gamma-ciklodextrinnel kiegészített nyugati étrendben egerekben a neoplazmák mérete statisztikailag különbözött. Megállapítottuk, hogy ez a hatás annak köszönhető-e, hogy a gamma-ciklodextrin képes módosítani a túlélési utakat a bél neoplasztikus szöveteiben. A normál és neoplasztikus szöveti lizátumokkal végzett Western blot-analízis nem mutatott ki következetes változásokat az Akt/pAkt, Stat3/pStat3, Erk/pErk és c-Jun/pc-Jun szintekben (az adatokat nem mutatjuk be). Ezután azt vizsgáltuk, hogy a nyugati étrendet gamma-ciklodextrinnel táplált egerek kisebb méretének és alacsonyabb daganatoknak köszönhető-e a bélszövetek magasabb apoptózisa. Gamma-ciklodextrinnel ellátott nyugati étrenden az egerek szöveteiben megnőtt a Bax proapoptotikus fehérje és a hasított Caspase 3 (az apoptózis jellemzője) szintje (4A. Ábra).

Újabb megfigyelésünk in vivo Az elemzések szerint a propoliszos, nyugati étrenden lévő egerek nem híztak ugyanolyan mértékben a testtömegben, mint a gamma-ciklodextrinnel nyugati étrendet vagy nyugati étrendet tápláló egerek (1A. ábra). Ennek a megfigyelésnek a molekuláris szintű magyarázatához elemeztük a fő elhízással kapcsolatos jelátviteli utakat a nyugati étrendet tápláló egerek epididymális fehér zsírszöveteiben kiegészítőkkel vagy anélkül. A Western blot elemzések alacsonyabb pErk1/2 szintet mutattak ki a nyugati étrendben propolissal táplált egerek epididimális fehér zsírszövetében (4B. Ábra); azonban az Akt/pAkt, Stat3/pStat3 és pc-Jun/c-Jun szintekben nem következetesen változtak (az adatok nem láthatók). Korábban beszámoltunk arról, hogy a propolisz hiperaktiválja az ERK jelátvitelt a CC sejtekben in vitro 16. Ennek az eltérésnek a kezelésére két normál sejtvonalban elemeztük a propoliszra adott választ: egér fibroblaszt 3T3-L1 és humán hám bél CCD841CoN. Mint arról beszámoltunk, a propolisz megnövelte a pERK1/2 szintjét a colorectalis carcinoma HCT-116 sejtekben; a pERK1/2 szint azonban csökkent a normál sejtekben (4C. ábra).

A neoplasztikus teher mutációs profilja egerekben kontroll vagy nyugati étrend mellett

Vita

Az elhízás egyre növekvő egészségügyi probléma, mivel 10, 5 és 27 típusú rák kockázati tényezője, beleértve a CC-t is; ennek az asszociációnak a mechanizmusai azonban még mindig nem tisztázottak 4, 28. Ez a tanulmány az első fordítási lépés, amely utánunk következik in vitro megállapítások arról, hogy a propolisz hogyan modulálja a CC, 14, 16 sejteket, és azt tervezték, hogy meghatározzák, hogy a propolisz befolyásolja-e a bél neoplasztikus fejlődését in vivo, normális testsúly és elhízás összefüggésében.

A kontroll étrenden lévő egerek csoportjai közül a kiegészítőknek, a gamma-ciklodextrinnek és a propolisznak kitett csoportok csökkentek a daganatos progressziót, amelyet az összes elváltozás átlagos mérete és száma, valamint a dysplasia fokozata határoz meg. A propolissal kiegészített kontroll étrendet fogyasztó egerekben statisztikailag szignifikáns csökkenést észleltek az adenómák számában, összehasonlítva a kiegészítők nélküli kontroll étrendet fogyasztó egerekkel. Összehasonlítva a kiegészítők nélküli kontroll étrendben lévő egerekkel, a kontroll étrendet gamma-ciklodextrinnel táplált egereknél szintén csökkent az elváltozások száma és a dysplasia fokozata; ezek a különbségek azonban statisztikailag nem voltak szignifikánsak.

A nyugati étrend három beavatkozási csoportja között a neoplazmák számának különbségei statisztikailag nem voltak szignifikánsak; míg a neoplazma méretbeli különbségei statisztikailag szignifikánsak voltak. Az a csoport, ahol az adenómák száma/mérete a legkevesebb volt, és az alacsony fokú diszpláziával járó elváltozások száma volt a legmagasabb, az a gamma-ciklodextrinnel kiegészített nyugati étrend volt. A propoliszos nyugati étrendben lévő csoport statisztikailag szignifikáns csökkenést mutatott a neoplazmák méretében, összehasonlítva a nyugat-típusú étrendben étrend-kiegészítők nélküli egerek csoportjával.

A neoplazmák hisztopatológiai értékelése feltárta, hogy a nyugati étrendet tápláló egerek nagyobb méretű elváltozásai összefüggenek a gyorsabb progresszióval; csak ezekben az egerekben a neoplazmák mutattak fokális nekrózist. Másrészt a gamma-ciklodextrinnel kiegészített nyugati étrendet tápláló egereknél a legkisebb daganatos progresszió sebességét nemcsak a daganatos elváltozások legkisebb száma és legkisebb mérete, hanem a szövetek szövettani értékelése is bizonyította. Ez a megállapítás egybevág az apoptotikus markerek megnövekedett szintjének megfigyelésével gamma-ciklodextrinnel etetett nyugati étrendet tápláló egerek bélszöveteiben. A belekben a gamma-ciklodextrin rövid láncú zsírsavakká, köztük a 30-as butiráttá fermentálható, és ha alkalmazzák in vitro, a butirát apoptózist indukál WNT/béta-catenin szignalizációt aktiváló mutációkkal rendelkező sejtekben, például a Apc 10. gén. Ezért a ciklodextrinnel kiegészített étrenden az egerek bélszöveteiben megnövekedett apoptózis a butirát apoptotikus hatásainak tudható be.

A nyugati étrendet tápláló elhízott egereknél a gyorsabb neoplasztikus progresszió oka lehet magasabb mutációs ráta, megnövekedett őssejtek és őssejt-osztódások, megnövekedett adipokinek, epigenetikai változások és a bél mikrobiota változásai 35. E lehetőségek némelyikét normál testsúlyú (kontroll étrendtel táplált) és elhízott (nyugati étrenddel táplált) egerek exomszekvenálásával elemeztük. Bár az elhízott egerekben a daganatos elváltozások átlagos mérete nagyobb volt, mint normál testsúlyú egereknél, a mérsékelt és nagy hatású mutációk által érintett gének száma és típusa alacsonyabb volt az elhízott egereknél. Ez az eredmény alátámasztja azon megállapításainkat, hogy a normál testsúlyú betegekhez képest az elhízott CC betegek rákgenomjainak kevesebb szomatikus mutációja van, és ennek megfelelően alacsonyabb a mutációk száma a vezető génekben 4. A szekvenálás elemzése nem mutatott ki következetes különbségeket az érintett gének típusában. Ennek oka lehet, hogy kísérletünkben a neoplasztikus fejlődés a prekarcinoma stádiumra korlátozódott; míg az emberi exóm elemzéseket a TCGA III. stádiumú vastagbélrák adataival végezték. A többszörös mutációk jelenléte azonban még a korai adenoma stádiumban is megerősítést nyert az embereknél 36, 37 .

Köszönetnyilvánítás

Ezt a tanulmányt a Manuka Health New Zealand Ltd kutatási támogatásával és a TCMC kutatási alapjaival finanszírozták. Köszönetet mondunk Dr. A. Suddes-nek a Manuka Health New Zealand Ltd-nél a szolgáltatás nyújtásáért Propolisz a Cyclopowerrel tanulmányainkhoz, Victor Mallory pedig az egerek gondozásához.