A Q Exactive HF, egy Benchtop tömegspektrométer előszűrővel, nagy teljesítményű kvadrupollal és ultramagas terű Orbitrap analizátorral *

Richard Alexander Scheltema

Max Planck Biokémiai Intézet ‡ Proteomikai és Jelátviteli Tanszékéről, Am Klopferspitz 18, D-82152 Martinsried, Németország;

Jan-Peter Hauschild

§Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Strasse 11, 28199 Bremen, Németország

Oliver Lange

§Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Strasse 11, 28199 Bremen, Németország

Daniel Hornburg

Max Planck Biokémiai Intézet ‡ Proteomikai és Jelátviteli Tanszékéről, Am Klopferspitz 18, D-82152 Martinsried, Németország;

Eduard Denisov

§Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Strasse 11, 28199 Bremen, Németország

Eugen Damoc

§Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Strasse 11, 28199 Bremen, Németország

Andreas Kuehn

§Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Strasse 11, 28199 Bremen, Németország

Alekszandr Makarov

§Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Strasse 11, 28199 Bremen, Németország

Matthias Mann

Max Planck Biokémiai Intézet ‡ Proteomikai és Jelátviteli Tanszékéről, Am Klopferspitz 18, D-82152 Martinsried, Németország;

Társított adatok

Absztrakt

A tömegspektrometriával online összekapcsolt nanoméretű folyadékkromatográfia a jelenlegi választott technika a komplex peptidkeverékek elemzéséhez. A top-N sörétes puskás stratégiában a teljes vizsgálatot, amely teljes körű áttekintést nyújt az ionizált peptidekből származó izotópmintákról, N töredezettség-leolvasások követik, amelyek a jelenleg még teljes szkennelés során látható legbőségesebb, még nem szekvenált izotópmintákon történik. A töredezés során a cél a kívánt prekurzor peptidion tiszta elkülönítése, amelyet manapság általában vagy lineáris ioncsapdával, vagy kvadrupól tömegszűrővel végeznek. A töredékionokat ezután Orbitrap tömegelemzővel, repülési idő-analizátorral, vagy ritkábban ion-ciklotron-rezonancia – Fourier transzformációval vagy lineáris vagy háromdimenziós ioncsapdákkal mérik.

Az MS-készülékeken kívül a proteomikai munkafolyamat legújabb fejleményei magukban foglalják az automatizált online minőségellenőrzési rendszerek (7, 8) és az egyszeri futtatású elemzések (9) felé történő elmozdulást, amelyekhez nagyon nagy teljesítményű peptid-kromatográfia szükséges (10, 11).

Itt leírjuk a Q Exactive Plus és a Q Exactive HF eszközökbe beépített előrelépéseket. Ezek közé tartozik a megnövelt robusztusság, amelyet a kvadrupól előtti alacsony felbontású szűrő, egy szegmentált kvadrupol és a Q Exactive HF műszer esetében egy ultramagas térerősségű Orbitrap analizátor, a felbontás vagy a felvétel sebességének megduplázása eredményez. Ezeket a képességeket a peptidek és foszfopeptidek egyszeri lövéses komplex keverékelemzésének összefüggésében írjuk le.

KÍSÉRLETI ELJÁRÁSOK

A Q Exactive Plus építése

A Q Exactive HF építési részletei. Ez a műszer a Q Exactive sorozaton alapul, és továbbfejleszti azt az injektálási flatapolánál (A) elhelyezett tömegszelekciós előszűrővel, egy aktívan vezető hajlított flatapolával (B) és egy szegmentált kvadrupollal (C). Ez a kombináció megakadályozza, hogy a szennyeződés messze eljusson a készülékbe, és csaknem kétszeresen javítja az ionátvitelt. Az ultramagas terű Orbitrap analizátor (D) opcionális.

Az Orbitrap analizátor fedett tömegtartománya m/z 50–6000. A prekurzor tömegének kiválasztása a kvadrupól 2500 m/z-ig lehetséges, és az izolációs ablakok 0,4 és 5600 Th között állíthatók be. A műszer szoftver automatikusan beállítja a szükséges ionbefecskendezési időt, hogy kompenzálja az átviteli veszteséget az izolációs szélesség csökkentésekor. A klasszikus Orbitrap analizátorral szerzett felvételi sebesség ugyanaz marad, mint azt korábban beszámoltuk, míg a nagy terű Orbitrap esetében 27 Hz-től 15 000-es felbontási teljesítményig terjed 200 m/z értéknél (ami 10 000-nek felel meg m/z 400-nál), és 1,5 Hz-ig. felbontási teljesítmény 240 000 m/z 200-nál (170 000-nek felel meg m/z 400-nál). Az Orbitrap rekeszben lévő vákuum elektronikusan ~ 5-szer beállítható, lehetővé téve a legtöbb elemző elem nagy felbontású elemzését, beleértve a nagy peptideket és a kis fehérjéket.

HeLa-lizátumok elkészítése

Stimulálatlan HeLa sejtek foszforilezése

LC-MS/MS elemzés

Az online kromatográfiát a Thermo Easy nLC ultra-nagynyomású HPLC rendszerrel (Thermo Fisher Scientific) online módon csatlakoztattuk vagy eredeti Q Exactive, vagy Q Exactive HF-hez NanoFlex forrással (Thermo Fisher Scientific). Az analitikai oszlopokat (50 cm hosszú, 75 μm belső átmérőjű) ReproSil-Pur C18 AQ 1,9 μm fordított fázisú gyantával (Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch-Entringen, Németország) A-pufferbe (0,5% ecetsav) csomagoltuk. ). Az on-line analízis során az analitikai oszlopot egy oszlopfűtőbe (Sonation GmbH, Biberach, Németország) helyeztük 55 ° C hőmérsékletre szabályozva. 2 μg száraz tömegű peptidkeveréket az A pufferrel 980 bar maximális ellennyomáson (általában 450 nL/perc áramlási sebességet eredményezve) töltöttünk az analitikai oszlopra, és 5-30% lineáris gradienssel elválasztottuk. % B puffer (80% ACN és 0,5% ecetsav) 250 nL/perc áramlási sebességgel, IntelliFlow technológiával 90 percen keresztül (általában 500 bar körüli ellennyomás mellett). A betöltési, bevezetési és mosási lépések miatt az LC-MS/MS futtatásának teljes ideje körülbelül 40-50 perccel volt hosszabb. Az online minőségellenőrzést, ideértve a nagy cseppképződés, a HPLC paraméterek és az adatgyűjtéshez kapcsolódó számítógép állapotának automatikus detektálását, a SprayQc-vel (8).

Átviteli jellemzők tömegválasztó szűrő. A, izolációs ablak hatékonyságának összehasonlítása a Q Exactive és a Q Exactive Plus között a calmix ionok teljes készletével. B, a Q Exactive és a Q Exactive HF izolációs átviteli hatékonyságának összehasonlítása a teljes calmix ionkészlet felhasználásával. C, az összes egyedi peptid egy komplex HeLa teljes sejtlizátumból, szekvenálva számos izolációs ablakkal. A szekunder y tengely az Andromeda opció „második peptid” százalékos arányát jelöli (SecPep). D, izolációs tisztaság egy komplex HeLa teljes sejtlizátumtól, különféle izolációs ablakokkal szekvenálva.

A Q Exactive és a Q Exactive HF összehasonlításában észrevettük, hogy a Q Exactive HF-en a Q Exactive futtatásokhoz képest 1,5-szeresére becsülték a fragmentálásra felkínált ionok számát. Annak megállapítására, hogy ez további hatást gyakorolt-e a műszer teljesítményére, megvizsgáltuk a különböző célértékek teljesítményét. Ebből azt találtuk, hogy az 1e5 ionok eredeti Q Exactive célértéke továbbra is optimális maradt a Q Exactive Plus és a Q Exactive HF számára (kiegészítő S6. Ábra).

Adatelemzés

Eredmények és vita

A Q Exactive HF (valamint a Plus) quadrupole izolálása során az ionutat frissítették azzal a céllal, hogy javítsák a robusztusságot és optimalizálják az ionátvitelt a quadrupole izoláció során annak érdekében, hogy képesek legyenek megfelelni a megnövekedett sebességgel az ultramagas terű Orbitrap tömegelemző. Az útvonalat alkotó különféle hardverkomponenseket a „Kísérleti eljárások” részben részletezzük. Beszélgetésünket azzal kezdjük, hogy megvizsgáljuk a viselkedésüket a standard infúzióval elektrospray-ben szórt ESI pozitív ion kalibrációs oldattal (Thermo Fisher Scientific). Ezután a készülék teljesítményét a puskás top-N módszerekkel mért HeLa teljes sejtlizátumok eredményei alapján jellemezzük.

Injekciós Flatapole előszűrőként

Az injekciós flatapol előtömeg-szűrő teljesítményének részletei. A, a calmix-spektrum, ha az MRFA-t (524,27 m/z) izoláljuk 80 Th-os izolációs ablakban. A betét nagyítja az izolációs ablakot és annak közvetlen környezetét. B, az előtömeges szűrő izolációs hatékonysága egy sor izolációs ablakon. C, az előtömeg-szűrő hatékonysága egy HeLa teljes sejt-lizátum izolációs ablakán. D, az injekciós flatapol képe 3 hónap folyamatos mérés után.

Szegmentált Quadrupole

Az eredeti hiperbolikus rúddal rendelkező kvadrupolt egy szegmentált verzió váltotta fel, amely nagyobb téglalap alakú izolációs hatékonyságot képes elérni a teljes izolációs ablakon keresztül (3. ábra A). Ez releváns az olyan akvizíciós stratégiák esetében, mint a SWATH (23) és a SILAC partnerek együttes izolálása (például kiválasztott ionfigyelési vizsgálatoknál), amelyek téglalap alakú izolációs ablakokat igényelnek annak érdekében, hogy szélükön pontos mennyiségi információkat hozzanak létre. A Q Exactive quadrupoljához képest az izolációs ablak kis tömegű oldalán szignifikánsan javult az izolálás hatékonysága. Továbbá javult a kvadrupol átvitele keskeny szigetelőablakok esetén. Mértük ezt a javított hatékonyságot a calmix ionok halmazánál, és csaknem kétszeres növekedést találtunk (2. ábra B). Ne feledje, hogy az ábra a nagyobb szigetelőablakok, különösen a magas m/z ionok esetében is egy átviteli előnyt mutat, ami a kvadrupol kilépési szegmensének fókuszáló hatásának köszönhető. Ez a javulás nagyjából megfelel az ionáram növekedésének, amely szükséges a szkennelési sebesség megkétszerezéséhez, amire az Orbitrap nagytérségű analizátor képes (mivel a töltési idő megegyezik a műszer teljesen párhuzamos működésének tranziens idejével).

Az ultra-high-field Analyzer teljesítménye

A Q Exactive HF teljesítménye ultramagas terű Orbitrap analizátorral. A, a standard (bal) méretek összehasonlítása a kompakt, ultramagas terű Orbitrap analizátorral (jobb). B, a különböző felbontásokhoz szükséges Orbitrap átmeneti idők összehasonlítása, valamint az egyes átvizsgálásokhoz szükséges rezsi idő becslése. C, a komplex HeLa teljes sejtlizátumból kimutatott csúcsok mért felbontása. D, a Q Exactive és a Q Exactive Plus statisztikai összehasonlítása HeLa összes sejtlizátumon.

Optimális paraméterérték-ellenőrzés

A Q Exactive HF paramétereinek külön-külön történő optimalizálása után az egyes paraméterek optimális értékeinek független ellenőrzését hajtottuk végre a kísérlet tervezésének megközelítésével (29, 30) a MODDE (Umetrics, Frankfurt, Németország) alkalmazásával. Az ilyen megközelítés előnye, hogy betekintést nyújt azokba a paraméterekbe, amelyek potenciálisan kölcsönhatásba lépő tulajdonságokkal rendelkeznek. Az elemzéshez azokat a paramétereket választottuk, amelyek korábban a legnagyobb hatást adták kísérleteinkben, amelyek a normalizált ütközési energia (20–40), az S-lencse rf-szintje (40–80) és az izolációs ablak (0,4–3 Th) voltak. A paraméterek tartományát nagynak és a korábban megtalált optimális értékeknek középpontjába választottuk. Az összes RAW adatot a szoftver által létrehozott kísérleti tervezés alapján rögzítettük. E vizsgálat eredményeiből arra a következtetésre jutottunk, hogy a korábban leírt értékek optimálisak, és készletünkben nem voltak olyan szignifikánsan kölcsönhatásban lévő paraméterek, amelyekből teljesítményelőny származhatott volna. Mivel a következtetés ugyanaz maradt, és a kísérlet megtervezése megközelítéssel ritka adatokkal lehet foglalkozni, ez vonzó tanulmánytípus lehet az LC-MS/MS mérőszámok gyors optimalizálására a különböző típusú mintákhoz és a kromatográfiás elválasztáshoz (kiegészítő S10. Ábra).

Q Exaktív teljesítmény a teljes sejtlizátum-elemzéshez

A Q Exactive HF teljesítménye ultramagas terű Orbitrap analizátorral. A ciklus-idő összehasonlítása a Q Exactive és a Q Exactive HF számára egy komplex HeLa teljes sejtlizátumon. B, a Q Exactive és a Q Exactive HF közötti csúcs-mélység összehasonlítás szekvenálása. C, a látható peptidek (kumulatív zöld, piros és szürke), szekvenált peptidek (zöld és vörös kumulatív) és sikeresen azonosított peptidek (zöld) összehasonlítása a Q Exactive és a Q Exactive HF között. D, a Q Exactive és a Q Exactive HF gradiens összehasonlítása során kumulatív módon azonosított fehérjék. A szaggatott vonalak lineáris illeszkedést jelölnek a görbe legmeredekebb részén.

A ciklusidő grafikon egyik kiemelkedő jellemzője, hogy a Q Exactive a gradiens korai szakaszában elérte a teljes N csúcsot, míg a Q Exactive HF a gradiens során jóval később érte el a teljes N csúcsot. Ezt úgy értelmezzük, hogy még a nagyon bonyolult mintákban is, mint például a HeLa teljes sejtlizátumok, a gradiens kezdeti része nem tartalmaz elegendő prekurzor-iont, amely megfeleljen a fragmentáció szelekciójának kritériumain ezeken a nagyon nagy szekvenálási sebességeken.

Az azonosított peptidek dinamikai tartományának további vizsgálata feltárta, hogy mindkét eszköz megbízhatóan szekvenciázott 3 nagyságrend felett, jelezve, hogy a Q Exactive HF teljesítménynövekedése annak tulajdonítható, hogy képes több peptidet szekvenálni a kromatográfia forgalmas területein. Ez a további sebesség felelős a replikációk nagyobb reprodukálhatóságáért a peptidazonosítási szinten is, ahol az eszköz jobb reprodukálhatóságot ér el alacsonyabb peptiddússág esetén (S8. Kiegészítő ábra). A Q Exactive HF teljesítményének különböző gradiens hosszakon történő vizsgálatához és a műszer optimális teljesítményének jelzéséhez ezen felül egy gradiens titrálási sorozatot futtattunk a standard HeLa mintákon, amelyekből kiderült, hogy a 4 órán át tartó gradiensek nem javították tovább az azonosítási teljesítményt. mintánk. Az időegységenkénti növekedés alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy egy 150 perces gradiens képviseli az optimális hosszúságot. A mi és más laboratóriumaink 4 órás vagy hosszabb gradiensek feletti mérési tendenciája bizonyos mértékig megfordítható (kiegészítő S9. Ábra).

Optimalizált kromatográfiai teljesítmény. A, kumulatív fehérjék a gradiens felett. B, a kimutatott fehérjék sejtenkénti példányszáma.

Alkalmazás a foszfoproteomikára

Foszforilezéssel dúsított minták. A Q Exactive-on (felül) és a Q Exactive HF-n (alul) azonosított foszforilezett peptid egy fragmentum-spektruma. Mindkét esetben elérte a maximálisan megengedett ioninjekciós időt. B, a Q Exactive és a Q Exactive HF elért csúcsmélységének összehasonlítása. C, a sikeresen szekvenált I. osztályú foszforilációs helyek összehasonlítása.

Következtetések és kilátások

Itt ismertettük az Exactive tömegspektrométer-család, a Q Exactive Plus és a Q Exactive HF következő iterációját, és megvizsgáltuk annak teljesítményét analitikai standardokon és a puskás proteomika komplex peptidkeverékein a szokásos 90 perces gradiensünkkel. Az ultra nagy terű Orbitrap analizátor megduplázza a szekvenálási sebességet ugyanazon a felbontáson, amelyhez a szegmentált kvadrupol továbbfejlesztett ionátviteli jellemzői legalább részben biztosítják a prekurzor ionok bőségének szükséges növekedését. A nagyobb sebesség jól tükrözi a puskás proteomikai tényleges javulást, mivel az egyedi peptidszekvenciákban az előző generációhoz képest több mint 40% -os, a HeLa-sejtlizátummal végzett standard gradiensünknél pedig a fehérjék több mint 20% -os növekedését figyeltük meg.

Összegzésképpen elmondható, hogy a quadrupole Orbitrap készülékek új generációját lényegesen nagyobb robusztusságra tervezték, és kísérleteink megerősítették, hogy a nem kívánt ionok többsége a műszer elülső részére korlátozódott. Hasonlóképpen megfigyeltük az új szegmentált kvadrupol szignifikánsan megnövekedett szelekciós jellemzőit, amelynek számos proteomikai kísérletben hasznosnak kell lennie. Végül, és ami a legfontosabb, a Q Exactive HF ultramagas terű Orbitrap elemzője rutinszerűen megduplázott felbontást biztosított MS-vizsgálatokban hátrányok nélkül, és megduplázta a potenciális szekvenálási sebességet MS/MS módban.

Kiegészítő anyag

Köszönetnyilvánítás

Köszönetet mondunk a Thermo Fisher Scientific munkatársainak, különösen Andreas Wieghausnak, Markus Kellmannnak, Stevan Horningnak, Matthias Muellernek, Amelia Petersonnak, Erik Couzijnnak és Aivaras Venckusnak, valamint a Max Planck Intézetben, különösen Korbinian Mayrnek, Felix Meissnernek, Jan Rieckmannnak, Herbertnek Schiller és Marco Hein segítségért és eredményes beszélgetésekért. Ezúton is köszönjük Steven Dewitznak, Igor Paronnak és Gabriele Sowának a technikai segítséget.

Kihirdetjük a versengő pénzügyi érdekeket.

Az MS-alapú proteomikai adatokat a ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) a PRIDE partner adattárán keresztül, a PXD001203 adatkészlet azonosítóval rakták le. Az adatok eléréséhez látogasson el a http://tinyurl.com/nyj5hx9 weboldalra.

Lábjegyzetek

Szerző közreműködései: R.A.S. és M.M. tervezett kutatás; R.A.S., J. H., O. L., E. Denisov, E. Damoc, A. K. és A. M. végzett kutatás; R.A.S., J.H., O.L., D.H., E. Denisov, E. Damoc, A.K. és A.M. új reagensekkel vagy elemző eszközökkel járult hozzá; R.A.S., J. H., O. L., D. H., E. Denisov, E. Damoc, A. K., A. M. és M. M. elemzett adatok; R.A.S. és M.M. írta a lap.

* Az ezekhez az eredményekhez vezető kutatás az Európai Bizottság 7. keretprogramjából kapott támogatást (HEALTH-F4-2008-201648/PROSPECTS támogatási megállapodás).

Ez a cikk kiegészítő anyagokat tartalmaz.