A rágcsálók étrend-összetételének szezonális variációjának értékelése DNS vonalkódolás és valós idejű PCR alkalmazásával

Tárgyak

Absztrakt

Az állatok étrendjének és etetési viselkedésének vizsgálata alapvető eszköz a fajok ökoszisztémában betöltött ökológiai szerepének szemléltetésére. A táplálékfelvételi minták mérete és minősége azonban megnehezíti a kutatók számára, hogy leírják sok kis faj étrend-összetételét. Tanulmányunk során genomi eszközöket használtunk fel a Savi fenyővirágának étrendi összetételének elemzéséhez (Microtus savii) DNS vonalkódolási és qPCR technikák alkalmazásával a gyomor tartalmából kinyert bevitt növényfajok azonosítására. A korábbi vizsgálatokkal ellentétben azt tapasztaltuk, hogy annak ellenére, hogy a fosszíliai faj, a Savi fenyővirág szelektív etetőanyag, amely intenzív felületes aktivitáson megy keresztül az élelmiszer keresése során. Ezenkívül tanulmányunk azt mutatja, hogy a eleve Az állati étrendben szereplő jelölt növényfajok ismerete, a qPCR hatékony eszköz a bevitt fajok jelenlétének/hiányának, előfordulási gyakoriságának és elektromosságának felmérésére. Arra a következtetésre jutunk, hogy ez a megközelítés új lehetőségeket kínál a kisállatok táplálék-kiválasztásának elemzésére, ezáltal részletes képet tárva fel a növény-állat kölcsönhatásokról.

Bevezetés

Az állatok etetési ökológiájának vizsgálata kulcsfontosságú az ökológiai közösségekben élő fajok közötti táplálkozási kapcsolatok szoros hálózatának és az ökoszisztémákon belüli energiaáramlás dinamikájának megértéséhez. Az élelmiszer-webláncok bemutatják az egyes fajok fontosságát a közösségek integritásának fenntartásában, és elmagyarázzák, hogy egy faj hogyan befolyásolhatja más fajok populációinak növekedési sebességét 1. Visszafogott testméretük ellenére a növényevő és a magevő rágcsálók, amelyek nagy számban fordulnak elő világszerte, jelentősen megváltoztathatják a táplálékukkal rendelkező növénytársulások faji összetételét, és a trofikus szinteken keresztül fontos lépcsőzetes hatásokat válthatnak ki. Emiatt a rágcsálókat kulcstartó fajoknak tekintik, amelyek képesek az ökoszisztémák szerkezetének és működésének alakítására, étrendjük és táplálkozási viselkedésük ökológiai kutatások alá vonásával 2,3. A kisemlősök étrend-összetételének elemzése azonban évtizedek óta zavarba hozza a kutatókat, mert a gyomortartalomban és a székletmintákban található kis méretű élelmiszerek kihívást jelentenek az azonosítás és a mérés szempontjából.

Mintegy 1800 fajnál, a rágcsálók az ökológiai kutatások középpontjában állnak 4, mivel világszerte jelentős hatással vannak a növényekre és az agroökoszisztémákra5. Annak ellenére, hogy a rágcsálókat gyakran kártevőként írják le, kulcstartó fajok is, amelyek hozzájárulnak az ökoszisztéma stabilitásának fenntartásához azáltal, hogy elősegítik az olyan folyamatokat, mint a beporzás és a vetőmag eloszlása 6,7,8, a szén és nitrogén körforgása 9,10, valamint a talaj levegőztetése fúrási és alagútfúrási tevékenységek révén. 10,11 .

Intuitív értelme van, hogy egy faj által elfogyasztott élelmiszerek relatív mennyiségét tükrözi a kinyert DNS mennyisége, és végül az egyes elemekhez rendelt DNS-szekvenciák száma. Azonban az amplikon szekvenálásából származó mennyiségi adatok megszerzése nem olyan egyszerű 26,27,35. A kloroplaszt DNS mennyisége változhat a szöveti sejtsűrűség függvényében, a különböző típusú szövetekből származó DNS az emésztés során különbözőképpen lebontható, és természetesen a végpont PCR amplifikációjának hatékonysága jelentősen változhat a reakciók között. A szekvenálási adatok validálása 35,36,37 etetési kísérletek létrehozásával érhető el. Az alternatív amplifikációs technikák, például a valós idejű, kvantitatív PCR, érvényes alternatívát jelent a HTS-hez, ha a mennyiségi adatok várhatóan 38,39,40,41,42. A kvantitatív PCR (qPCR) a HTS-hez hasonló adathalmazokat képes biztosítani, ugyanakkor érzékenyebb, különösen az alacsony sablonmennyiségekre 43,44 .

DNS-vonalkódolási és qPCR-technikákat alkalmaztunk egy földalatti rágcsálófaj étrend-összetételének és az olasz közeli endemizmus, a Savi fenyővirágának (Microtus savii). A Savi fenyőbakja gyepeken, ökotón területeken, ugarterületeken, a partok és árkok mentén fordul elő 54. A termőföldekre és a gyümölcsösökre gyakran tekintik károsítónak, mivel jelentős károkat okozhat a növényeken és a gyümölcsfákon 55,56. Széles körű előfordulása ellenére a Savi fenyővirágának étrendjét rosszul értik, és az élelmiszer-preferenciáiról szóló információk gyakorlatilag hiányoznak. Anekdotikus megfigyelések szerint a Savi fenyővirág étrendje többnyire egynyári és évelő lágyszárú növényekből áll, különösen Graminaceae, Leguminosae, Chenopodiaceae és Compositae, a barázda kimeneti nyílásaitól rövid távolságon belül fogyasztják. Elektromosság Rosaceae, amelyek több gazdaságilag fontos gyümölcsfát tartalmaznak, még meg kell határozni.

Megközelítésünk a fenyőlepkék takarmányozási tartományában elérhető növényfajok előzetes ismeretén alapult. A növényekből mintákat vettünk és dichotóm kulcsok segítségével azonosítottuk őket. Használtuk a rbcAz L gén mint DNS vonalkód a fajok azonosításához mind a relatív nagyobb felbontóképesség (pl. 57), mind az adatkészletünk számára a Vonalkód az élet adatai (BOLD) rendszerben elérhető viszonylag nagyobb vonalkódok száma miatt. Ezután fajspecifikus Taqman-vizsgálatokat terveztek a pólók gyomrából kivont DNS qPCR-amplifikálására. A végpont, félkvantitatív PCR-rel ellentétben a qPCR lehetővé teszi az amplifikált termékek felhalmozódásának detektálását és mérését a reakció előrehaladtával, az amplifikáció exponenciális szakaszában. A növényfaj jelenlétének vagy hiányának értékelése mellett a kiindulási sablon példányszám pontosan és nagy érzékenységgel meghatározható a DNS-minták széles skáláján.

A Savi fenyőbolygó diétás összetételét értékelték, hogy mérjék a növények fogyasztását elérhetőségük függvényében, és értékeljék az ételpreferencia szezonális változásait. Tudomásunk szerint ez az első olyan vizsgálat, amely a qPCR-t alkalmazza a kisméretű növényevő emlősök étrendjének és fajpreferenciájának kvantitatív értékelésére, célzott vizsgálatok alkalmazásával a HTS alternatívájaként. Ezenkívül az endemikus fajok táplálkozási ökológiájának mélyreható megértése, amelyek jól alkalmazkodnak az ember által módosított tájakhoz, kiemelkedő jelentőséggel bír az antropo-ökoszisztémákra gyakorolt szerepük és hatásuk meghatározása érdekében 58 .

Anyagok és metódusok

Tanulmányi terület

Ezt a vizsgálatot egy hektáros barackültetvényben végezték egy mezőgazdasági területen, az észak-olaszországi Emilia Romagna-ban (ÉSZ 44 ° 21′, KH 11 ° 42′) 2014 novemberétől 2015 szeptemberéig. Az átlagos éves csapadékmennyiség 750 mm volt, és a hőmérséklet változó volt +2,6 ° C és +23,7 ° C között van. A gyümölcsösben 5 és 15 év közötti fákat ültettek egymástól 4,5 m-es sorokba, egymástól 1,5 m és 3 m távolságra. A területet a hagyományos gyakorlatok szerint művelték, és rendszeresen rovarölő, gombaölő és gyomirtó szerekkel kezelték. Nem használtak rágcsálóirtókat.

Növényi mintavétel

Vole mintavétel

Savi fenyőlepkéit 70 almacsíkos rablócsapdával csapdába ejtették, amelyek körülbelül 10 cm-re helyezkedtek el a réce barlangjának bejáratától. Az aktív barlangokat úgy azonosítottuk, hogy először a kutatási területeken kerestük a mélyedések bejáratait. Ezeket később talajjal lezárták. Ezután 24 órán belül meglátogatták a barlangokat, és csapdákat helyeztek el azokhoz a bejáratokhoz közel, amelyeket 61 sáska nyitott. Összesen hat mintavételi ülést hajtottak végre vegetációs mintavétellel együtt. Minden mintavételi ülés hat egymást követő 24 órás csapdázási eseményből állt, amelyek során a csapdákat nyolc óránként ellenőrizték. Összesen 84 lepényt (50 hímet és 34 nőstényt) csapdába ejtettek és mintát vettek 144 órás mintavételi erőfeszítéssel. Meghatározták a súlyt, a nemet, a korosztályt és a reproduktív státuszt. A gyomrokat Parkinson szerint eltávolították et al. 62 ° C-on tároltuk -18 ° C-on a DNS lebomlásának minimalizálása érdekében.

A DNS vonalkód-szekvencia azonosítása

A BOLD és a Genbank szekvencia adatbázisban kerestük a matot K és rcbL génszekvenciák a felmérésünk során jellemzett 45 növényfaj mindegyikéhez, amelyek potenciálisan a Savi fenyővirágának étrendjébe tartoztak. Azonosítottunk egy 417 bp-os régiót rcbA Genbankban 40 jelölt faj számára elérhető L gén (1. kiegészítő táblázat). A részleges rcbAz L génszekvencia a 455 és 872 pozíció között található Arabidopsis thaliana referencia rcbL teljes génszekvencia (GenBank csatlakozás: U91966.1). A fajspecifikus szegregációs helyeket 30 növényfaj vonalkód-szekvenciájának összehasonlításával azonosítottuk, míg egy nemzetspecifikus szegregációs helyet öt fajcsoportra jellemeztünk, mindegyik csoport két, ugyanazon nemzetségbe tartozó fajból állt (2. kiegészítő táblázat). A szétválasztó helyeket célpozícióként 35 egyedi Taqman-vizsgálat megtervezéséhez alkalmaztuk a Custom Taqman Assay Design Tool segítségével a génexpresszióhoz (Thermo Fischer Scientific).

DNS-kivonás

DNS-t nyertünk ki 30 növényfajból, amelyeknél fajspecifikus szegregációs helyeket azonosítottak, valamint egy-egy fajból az öt, a nemzetspecifikus szegregációs helyekkel rendelkező csoport mindegyikéből. Az extrakciókat a Doyle & Dickinson 63 által módosított protokoll alkalmazásával hajtottuk végre, 200 mg homogenizált növényi mintát inkubálva 1 ml lízispufferben, amely 200 mM Tris-HCl, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA, 20 mg cetil-trimetilammónium-bromid (CTAB), 0,2 % 2-merkaptoetanol és 10 mg szilícium-dioxid-por 2 órán át 65 ° C-on. A mintákat 15 percig 13 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. Egy térfogatú kloroform: izo-amil-alkoholt (24: 1) adunk a felülúszóhoz. Az elegyet 20 percig centrifugáltuk 13 000 fordulat/perc sebességgel, és a DNS-t úgy kicsaptuk, hogy először a felülúszót 1 térfogat izopropanollal inkubáltuk 30 percig -80 ° C-on. A centrifugálás második fordulója után az üledéket 500 μl 70% -os etanollal mossuk, 15 percig 13 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk és DNase-mentes vízben újraszuszpendáljuk. A DNS-t pontosan meghatároztuk Qubit dsDNA BR vizsgálati készlettel Qubit 4.0 fluorométerben, és referenciaként alkalmaztuk a gyomortartalomból származó DNS mennyiségi meghatározásához.

Ezután a Savi fenyővirágával bevitt növényekből DNS-t extraháltunk a teljes gyomortartalom (átlagos tömeg: 443,5 ± 44,8SE mg) inkubálásával 2 ml-es mikrocentrifuga csőben, 1 ml lízispufferrel, amely 0,1 mM Tris-HCl, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA és 20 mg CTAB 3 órán át 65 ° C-on. Ezután a DNS-izolálást a CTAB módszerben Mafra által leírt módon hajtottuk végre et al. 64. A teljes gyomortartalom elemzése biztosítja, hogy a gyomorban található összes növényfajból mintát vegyenek a DNS kivonására.

Valós idejű PCR vizsgálat, körülmények és hőprofilok

A gyomortartalom DNS-lebomlása miatt a PCR-rel sikeresen amplifikálható vonalkódoló régiók hossza általában 100–250 bázispár méretű fragmensekre korlátozódik (lásd 26. és azok hivatkozásait). Vizsgálatunk során valós idejű qPCR-t használtunk étrendi elemzéshez faj- és nemzetspecifikus Taqman-vizsgálatok tervezésével. Mindegyik vizsgálat két PCR-láncindítót és egy célspecifikus oligonukleotid-próbát tartalmazott, amelyet flourescin (FAM) riporterrel és nem fluoreszcens csillapítóval jelöltünk. Az előremenő és a hátramenet primereket egy 200 bp méretű régióra terveztük, amely 100 bp-ot nyúlik a 3'-5 'irányban, és 100 bp-ot az 5'-3' irányban a célhelytől. A Taqman DNS-próbákhoz konjugált kisebb horonykötő (MGB) rész kapcsolódott a 3'-véghez. A konjugált MGB a DNS-ben képződött kisebb barázdába hajlik, amikor a próba 5–6 bp terminálisa kötődik a templáthoz. Ez biztosítja a szonda magasabb olvadási hőmérsékletét (Tm), közel a Tm primerek, és megnövekedett specifitás az egy bázis eltéréseivel szemben megemelkedett hibridizációs hőmérsékleten, ezáltal erősítve a szonda kötődését. A PCR-termékek 59 és 102 bp között voltak (1. táblázat).

Összesen 97 qPCR-t végeztünk minden jelölt növényfajra (vagy nemzetségre) a növényfajok jelenlétének/hiányának számszerűsítése és értékelése érdekében Savi fenyőbél gyomortartalmában. Az amplifikációs reakciók negatív kontrollt, standard jelű hígítási sorozatot készítettek, amelyek a vizsgált növényfajok (vagy nemzetségek) négy ismert, ismert koncentrációjú négyszeres hígításának négyszeres hígításának három ismétléséből készültek, és DNS-mintákat célspecifikus Taqman-vizsgálattal. A minták tartalmaztak exogén belső pozitív kontrollt is (Thermo Fisher Scientific). A belső pozitív kontroll (IPC) egyszálú, rövid szintetikus DNS-templát, amelyet minden amplifikációs reakcióhoz hozzáadunk egy pár specifikus láncindítóval és egy VIC fluoreszcens riporterrel jelölt Taqman-próbával együtt. Az IPC-t alkalmazták a valódi negatív eredmények és a PCR-inhibitorok, a helytelen vizsgálati beállítás, vagy a reagens vagy a termociklusos meghibásodás okozta negatív eredmények megkülönböztetésére.

Standard görbe

Az ismert koncentrációjú DNS-templát négy, tízszeres sorozatbeli hígításának amplifikációját alkalmaztuk egy standard görbe előállításához, a DNS-templát logaritmikus kiindulási mennyiségének (N0) ábrázolásával az egyes hígítások amplifikálása során kapott küszöbciklus (CT) értékkel szemben. Az ismeretlen koncentrációjú minták CT-értékeit összehasonlítottuk a standard görbével, hogy meghatározzuk a kiindulási DNS-koncentráció mennyiségét. A statisztikai szignifikancia biztosítása érdekében a standard görbe minden hígítási pontját háromszor ismételtük.

A valós idejű PCR reakciók teljesítményét a Pearson-korrelációs együtthatóval és a standard görbe regressziós vonalának meredekségével értékeltük. Ha feltételezzük a pontos alikvotálást és az amplifikáció hatékonyságának változását a DNS-koncentráció tartományában (azaz a PCR-termék mennyisége megduplázódik az exponenciális amplifikáció minden egyes ciklusa alatt, ami 100% -os reakcióhatékonyságot eredményez), akkor a hígítási sorozatnak olyan amplifikációs görbéket kell eredményeznie, amelyek egyenletesen vannak elosztva a hígítási tényező log2-jével megegyező ciklusszámmal. A DNS 10-szeres soros hígításával az egyes hígítások CT-értékeit vártuk, körülbelül 3,32 ciklusok elválasztva. Figyelembe véve, hogy a regressziós egyenes meredeksége az egyenlettel y = ax a változás y egységváltozáshoz x a vonal mentén, akkor egy logaritmikus egység DNS-koncentrációjának változásának (10-szeres növekedés) meg kell felelnie a 3,32 ciklus csökkenésének és a várható meredekségértéknek -3,32. Az amplifikációs hatásfokot (E) a standard görbe meredekségéből számoltuk az alábbi egyenlet felhasználásával:

a Rutledge & Côté 65-ből származik a CT felvételével a y-tengely és log (N0) a x-tengely.

Statisztikai analízis

Az egyes növényfajok és a csupasz talaj átlagos százalékos fedettségét, a hozzá tartozó varianciával együtt kiszámítottuk a 40 vegetációs felmérés kvadrátjaiból kapott Horvitz-Thompson százalékos lefedettség becsléseinek átlagával 66. Mivel csak a növényfajok arányos elterjedtsége érdekelt minket, kizártuk a csupasz talajra vonatkozó adatokat, és a növénytakarási adatokat átméreteztük 0–100 közé. A skálázott becslések mintavételi varianciáit delta módszerrel számoltuk (pl. 67).

Az egyes gyomortartalmakból qPCR segítségével kinyert növényi DNS mennyiségét használtuk proxyként az egyes növényfajok által az egy vole által bevitt arányhoz. Ahogy az őszibarack, Prunus persica, arborealis faj, és a Savi fenyővirágáról ismert, hogy a növény légi részei helyett gyökerekkel táplálkozik, nem tudtuk megbecsülni annak elérhetőségét. Ezért nem végezhető elemzés az élelmiszerek kiválasztásáról és mennyiségéről P. persica A gyomortartalomban visszanyert DNS-t nem vették figyelembe a bevitt növényfajok arányának számszerűsítésekor.

Eredmények

A 2. táblázat az egyes mintavételi ülések során összegyűjtött becsült növénytakarás százalékát mutatja a vizsgálati területen. Körülbelül 50% évelő faj, míg a másik fele egynyári növény volt. Kanapé fű (Elytrigia repens), ribwort útifű (Plantago lanceolata), széles levelű útifű (Plantago major) és a közönséges pitypang (Taraxacum officinale) voltak az uralkodó fajok, amelyek a növénytakaró szezonális változása ellenére a Savi fenyővirágának rendelkezésére álló növények többségét tették ki.

Novemberben 20, januárban 15, márciusban 10, májusban 15, júliusban 13 és szeptemberben 11 vesszőt csapdába ejtettünk. Minden gyomorminta átlagosan 17,5 ± 1,67SE növényfajt tartalmazott (tartomány: 8–24). A permutációs teszt eredményei azt mutatták, hogy a pólók gyomrában talált növényfajok aránya nem tükrözi azok elérhetőségét a vizsgálati területen (P 3. táblázat: Savi fenyő rigái százaléka táplálkozik növényfajokkal nagyobb arányban, mint a becsült rendelkezésre állása minden csapdázási munkamenet.