A RARRES2 kemerint kódoló gén molekuláris evolúciója és expressziós profilja páviánban és csimpánzban

Absztrakt

Háttér

A reterinsav-receptor-válaszadó 2 (RARRES2) gén által kódolt Chemerin egy adipociták által kiválasztott fehérje, amelynek autokrin/parakrin funkciói vannak a zsírszövetben, anyagcserében és gyulladásban, a közelmúltban leírt funkcióval az érrendszeri tónus szabályozásában, a májban, a steatosisban stb. hogy az elhízást és a cukorbetegséget összekapcsoló kritikus endokrin jelet képviselje. Nem állnak rendelkezésre adatok a RARRES2 evolúciójáról főemlősökön és majmokon. A RARRES2 gének expressziós profilja és ortológiája ismeretlen szempont a főemlősök ezen multigén családjának biológiájában. Így; megkíséreljük az expressziós profilt és a filogenetikai kapcsolatot mint kiegészítő tudást leírni a főemlősökben a gén működésében. Ehhez RT-PCR-t végeztünk a boncolások során nyert különböző szövetekből. Teszteltük a pozitív evolúció, a tisztító szelekció és a semlegesség hipotéziseit is. Végül filogenetikai elemzést végeztek a főemlősök RARRES2 fehérje között.

Eredmények

RARRES2 transzkriptum volt jelen a májban, a tüdőben, a zsírszövetben, a petefészek, a hasnyálmirigy, a szív, a hipotalamusz és az agyalapi mirigy szöveteiben. A vese- és leukocitákban történő expresszió egyik fajban sem volt kimutatható. Megállapították, hogy a vizsgált gének ortológusak.

Következtetések

A RARRES2 evolúció illeszkedik a szelekció tisztításának hipotéziséhez. A RARRES2 gén expressziós profilja hasonló a páviánokban és a csimpánzokban, és filogenetikailag is rokon.

Háttér

A kemerin egy olyan fehérje, amely a ChemR23 - G fehérjéhez kapcsolt hét transz-membrán domén receptor receptor ligandumon keresztül indítja el a kemotaxist, amelyet adipokineként osztályoztak az adipocita differenciálódásban és a glükózfelvételben játszott szerepe miatt [1]. Potenciális szerepet játszik az immunválaszok szabályozásában is a szöveti sérülés és gyulladás helyén [2], ideértve az elhízás során a zsírszövet krónikus gyulladását is [1, 3-5]. A kemerint emellett alapvető endokrin jelként javasolják, amely összekapcsolja az elhízást az inzulinrezisztenciával [3, 6–8], ezért a metabolikus szindróma független biomarkere [9–12]. A kemerin a zsírszövet mellett fontos szerepet játszik a máj és a vázizomzat metabolikus szabályozásában [6, 13]. Nemrégiben meghatározták a kemerin új szerepét az angiogenezis stimulátoraként [9].

A kemerint kódoló retinsav-receptor-válaszfehérje 2 (RARRES2) gén (más néven RAR-reagáló fehérje TIG2, kemerin és tazarotén által indukált 2. génfehérje) a 7-es kromoszómában található 7q36.1-nél. A RARRES2 mRNS magas mértékben expresszálódik a fehér zsírszövetben, a májban és a tüdőben, míg a kemerin receptor mRNS-je túlnyomórészt az immunsejtekben és a zsírszövetben expresszálódik [14–20].

Az óvilági főemlősök (OWM) és a majmok fejlődésének vizsgálata kiváló megközelítést jelentett az emberi patológia, például a metabolikus szindróma megértéséhez. Jelenleg a pávián (Papio spp) ideális modellnek bizonyult az anyagcserezavarok tanulmányozására. Korábbi tanulmányok jelentős eltérést állapítottak meg a testsúlyban és a testösszetételben az ugyanazon étrenden és életkörülmények között élő felnőtt páviánoknál. A páviánok spontán elhízást [21], 2-es típusú diabetes mellitust (T2DM) [22] fejlesztenek ki, és metabolikus szindrómához hasonló fenotípust írtak le ezen a fajon [23]. Míg a RARRES2 génszekvenciát emberben írták le, a páviánról és a csimpánzról nincs információ. Jelen tanulmány a pávián és a csimpánz RARRES2 génjének expressziós profilját és filogenetikai kapcsolatát elemezte.

Eredmények

Kifejezési profil

A genomi DNS-ből származó PCR-ben mindkét főemlős számára egyetlen 3257 bp-os sávot vizualizáltak (az adatokat nem mutatjuk be). A cDNS-ből származó PCR-ben hasonló módon mindkét főemlős esetében csak egy 641 bp-os terméket figyeltünk meg. A PCR termékméretek és a nukleotidszekvencia nem elegendő a paralóg gének hiányának megállapításához, de a pillanatnyi bizonyíték arra utalhat, hogy a vizsgált két faj, a pávián és a csimpánz mindegyikére csak egy RARRES2 gén létezik. Mindkét gén hat exonba és öt változó méretű intronba szerveződik: 1110 pb exon; intron A, 948 pb; 2. exon, 194 pb; B intron, 231 pb; 3. exon, 105 pb; intron C, 1018 pb; 4. exon, 96 pb; intron D, 244 pb; 5. exon, 127 pb; E intron, 175 pb; és a 6. exon, 121 pb.

Minden faj esetében a RARRES2 transzkriptumokat amplifikálták a májból, a tüdőből, a zsírszövetből, a petefészekből, a hasnyálmirigyből, a szívből, a hipotalamuszból és az agyalapi mirigyből. A vese és a leukociták expresszióját nem sikerült kimutatni. Negatív és pozitív kontrollok adták a várt eredményeket (1. ábra). Az összes PCR-terméket klónoztuk és szekvenáltuk. Minden főemlős esetében legalább három független klónt szekvenáltunk minden génhez és transzkriptumhoz. A pávián és a csimpánz mRNS-szekvenciája minden szövet esetében azonos volt.

A RARRES2 gén RT-PCR profil expressziójának szűrése. A felső panel a pávián szöveteiből származó RT-PCR vizsgálatokat mutatja. A gombpanel a csimpánz szöveteiből származó RT-PCR vizsgálatokat mutatja. Mindkét panelen az 1–10 sáv a májat, a tüdőt, a zsírszövetet, a petefészket, a hasnyálmirigyet, a szívet, a hipotalamust, az agyalapi mirigyet, a vese és a leukocitákat képviseli. A sávok (-) a negatív RT-PCR kontrollokat jelzik. A pozitív kontrollokat (324 bp) együtt amplifikáltuk mintákkal (641 bp)

Filogenetikai elemzés

A filogenetikai fa (2. ábra) négy kládot mutat a fajspecifikus módon. Ezek a kládok megfelelnek a majmoknak, az OWM-nek, az NWM-nek és a maki (csoporton kívül). Megerősíti a főemlős RARRES2 gének közötti ortológiát. A rendszerindító értékek megjelennek a fa ágain. Hasonló eredményeket értünk el a Maximum Likelihood (ML), a Neighbor-Joining (NJ) és az UPGMA filogenetikai módszerekkel. Megerősítettük, hogy a RARRES2 evolúció illeszkedik a szelekció tisztításának hipotéziséhez (P 0,05), ebben a pillanatban nem világos, hogy mely erők irányítják evolúciójukat. Az orangután, a rhesusmajom és a rákfogyasztó makákó RARRES2 gének esetében semlegesség figyelhető meg (1. táblázat).

Különböző főemlősökből származó RARRES2 fehérjék filogenetikai fája. A fát MEGA 6.06 verzióval építették fel az ML, NJ és UPGMA módszerekkel, valamint 1000 replika további bootstrap elemzésével. Az ágakban lévő számok a Bootstrap értékét (félkövér) és az ág hossza alatt mutatják, mindkettőt három módszerrel becsülik meg (ML/NJ/UPGMA). A kládok bélésspecifikus módon, majmok, OWM, NWM és maki (csoporton kívül)

Beszélgetések

mRNS szöveti expressziók

Ez az első jelentés, amely bemutatja az új RARRES2 mRNS expressziós profilját a pávián és a csimpánz különböző szöveteiben. A tanulmány újszerű megállapítása az, hogy páviánnál és csimpánznál expresszió van az agyalapi mirigyben, míg az embereknél a RARRES2 nem volt kimutatható ebben a szövetben. Embereknél beszámoltak a vese expressziójáról (ETS profil az NCBI-nél, UniGene), míg vizsgálatunkban páviánon és csimpánzon nem észlelték. Ennek a különbségnek a kezelésére olyan tanulmányok, mint; promoterek összehangolása, bioinformatikai elemzések a transzcptionális faktorok kötődési helyeinek előrejelzésére, metilezésre hajlamos CpG-szigetek keresése, mint mások; szükségesek.

Az expressziós mintázat hasonlósága arra utal, hogy a génexpresszió szabályozásának mechanizmusai hasonlóak a három fajban. Azt is sugallja, hogy a RARRES2 gén hasonló fiziológiai hatásokkal járhat. A funkcionális különbségekre vonatkozóan azonban további vizsgálatokra van szükség, például az expressziós profil tanulmányozására különböző körülmények között, például inzulinrezisztencia, elhízás, koplalás vagy más, metabolikus szindrómához kapcsolódóan.

Génszerkezet

Megállapítottuk, hogy a páviánban és a csimpánzban található RARRES2 cDNS szekvencia nagy hasonlóságot mutat más majmokkal. Az exon – intron határok megőrzése és a nyilvánvaló mutációk hiánya arra utal, hogy a pávián és a csimpánz RARRES2 génjei működőképesek.

Filogenetikai elemzés

A pozitív szelekció (dN> dS) azt jelenti, hogy a szubsztitúciók, amelyek többnyire nem szinonimák, funkcionálisak és hasznosak a szervezet számára, bizonyos evolúciós előnyt biztosítva. A szelekció tisztítása közben (dN

Következtetések

Megállapítottuk, hogy csak egy RARRES2 gén van a pávián és a csimpánz számára. RARRES2 transzkriptum volt jelen a májban, a tüdőben, a zsírszövetben, a petefészek, a hasnyálmirigy, a szív, a hipotalamusz és az agyalapi mirigy szöveteiben mindkét főemlősnél. A dN és dS arány meggyőzően azt mutatja, hogy ezek a gének nincsenek pozitív szelekcióval. A RARRES2 evolúció illeszkedik a szelekció tisztításának hipotéziséhez. A vizsgált szekvenciák egyértelműen ortológikusak.

Mód

Állattartás

A páviánok (Papio anubis) és csimpánzok (Pan trogloditák) a délnyugati nemzeti prímkutató központban voltak elhelyezve, San Antonio, TX; AAALAC által akkreditált létesítmény a Texas Biomedical Research Institute-ban. Ezeket az állatokat beltéri-kültéri bejárattal szokásos rozsdamentes acél ketrecekben helyezik el, fedett menedékházakkal, külső tartályokkal ellátva ad libitum vízhez való hozzáférés. A protokollt a Texas Biomedical Research Institute IACUC-ja hagyta jóvá minden eljárás esetében.

A szövetek betakarítása és feldolgozása

A májat, a tüdőt, a zsírszövetet, a petefészket, a hasnyálmirigyet, a szívet, a hipotalamust, az agyalapi mirigyet, a vesét és az összes leukocitát rutin boncoláskor összegyűjtöttük, és további értékelésig -80 ° C-on tároltuk. A pávián szövetek három különböző állatból származnak, míg a csimpánz szövetek egyetlen nőstényből származnak, akik a cukorbetegség szövődménye miatt humánus eutanáziát szenvedtek el. A különböző szövetek és leukociták teljes RNS-ét és DNS-ét Trizol reagenssel extraháltuk a gyártó utasításainak megfelelően (Invitrogen, Carlsbad, CA). Az RNS-t RQ1 DNase-zel (Promega, Madison, WI) kezeltük 15 percig 37 ° C-on, hogy eltávolítsuk a genomi DNS nyomait. Az RNS és a DNS tisztaságát és integritását standard spektrofotometriás módszerekkel, NanoDrop berendezéssel (Thermo Scientific, Wilmington, DE) és agaróz gélelektroforézissel értékeltük.

Fordított transzkripció (RT), polimeráz láncreakció (PCR), molekuláris klónozás és nukleotid szekvenálás

A fagyasztott szövetek összes RNS-je (

Filogenetikai elemzés

A szekvenálási vizsgálatokból nyert információkat BLAST tesztnek vetették alá az azonosság meghatározása céljából. A pávián és a csimpánz RARRES2 génjeinek intron-exon határainak struktúráját az NCBI szerveren megadott információk közvetlen lekérésével határoztuk meg. Az igazításokat a CLUSTAL W program segítségével hajtották végre [25]. Az ebben a vizsgálatban használt szekvenciák GenBank belépési számait a 2. táblázat tartalmazza. Az aminosav szekvenciákból filogenetikai fát építettünk a MEGA 6.06 szoftverrel [26], a Maximum Likelihood (ML), a Neighbor-Joining (NJ) és az UPGMA módszerekkel., majd egy bootstrap tesztet hajtottak végre 1000 ismétléssel [27].

A RARRES2 prímás gének divergenciájának folyamatát megalapozó evolúciós erők azonosítására törekedve teszteltük a pozitív vagy adaptív evolúció (dN> dS) hipotézisét, tisztítva a szelekciót (dN