A perifériás vér T-limfocitáiban az 5-metil-citozin expressziójának rövid távú, magas zsírtartalmú étrend által kiváltott növekedését az alacsony dózisú aszpirin csillapítja.

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
ORCID rekord Bongani B. Nkambule számára
Levelezés céljából: [email protected]

Absztrakt

Célkitűzés A perifériás limfocita DNS metilációs profiljának értékelése prediabéteszben magas zsírtartalmú étrenddel táplált C57BL/6 állatmodell alkalmazásával. Továbbá megvizsgáltuk, hogy az alacsony dózisú aszpirin vagy az alacsony dózisú aszpirin metforminnal kombinálva módosíthatja-e a globális DNS-metilációs szintet a perifériás vér limfocitáiban.

Mód Huszonnyolc (28) hím C57BL/6 egeret alkalmaztunk két kísérleti fázisban. Az első kísérletben olyan állatokat (n = 16) vontak be, akiket randomizáltak, hogy 10 hétig alacsony zsírtartalmú étrendet (LFD) vagy magas zsírtartalmú étrendet (HFD) (n = 8/csoport) kapjanak. Míg a második kísérletben a HFD-vel táplált egereket (n = 15) randomizálták 3 kezelési csoportba, egy alacsony dózisú aszpirin (LDA), LDA és metformin csoportba és egy klopidogrel csoportba. A DNS metilációs profilját áramlási citometriával határoztuk meg.

Eredmények A HFD csoport mérsékelt súlygyarapodást és emelkedett étkezés utáni vércukorszintet mutatott, összehasonlítva az LFD csoporthoz 2 hetes HFD-etetés után (p Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése
Powerpoint letöltése

Diéta összetétele (g/kg)

Kísérletezzen egyet

Az első kísérlet az izolált B és T limfociták kiindulási DNS-metilációs profiljának mérésére irányult, 8 hetes magas zsírtartalmú étrend után. A vizsgálat 5 hetes hím C57BL/6 egerekből állt (n = 16). Az egereknek hetet hagytak akklimatizálódásra, miközben normál egereket kaptak, és szabadon hozzáférhettek a vízhez ad libitum. Az egereket ezután két csoportba randomizáltuk, az LFD és a HFD csoportba (n = 8/csoport). Az állatokat ezután külön ketrecekben helyeztük el (n = 8/ketrec) a megfelelő étrendjük alapján (1. ábra). Kétszáz mikroliter vénás vért vettünk minden állatból, és meghatároztuk az alapszintű hematológiai méréseket, a glükóz-, inzulin- és DNS-metilációs méréseket (% 5-metil-citozin) (2. kiegészítő fájl). A monocitákat és a granulocitákat kimerítettük a teljes vérmintákból, majd a B és T limfocitákat a BD ™ IMag sejt szeparációs rendszer (BD Bioscience, USA) segítségével izoláltuk (2. kiegészítő fájl).

Második kísérlet

A második kísérletben megvizsgáltuk, hogy az alacsony dózisú aszpirinnel (LDA), az LDA metforminnal (LDA + MET) és a klopidogrellel végzett rövid távú kezelés módosítja-e a HFD-vel táplált (HFF) egerek DNS-metilációs profilját. Tizenöt (n = 15) HFF egeret randomizáltunk három kezelési csoportba (n = 5/csoport). Ide tartoztak; (1) alacsony dózisú aszpirin (LDA) (3 mg/kg) (Kroesen és mtsai, 2018) csoport; (2) LDA és metformin (150 mg/kg) (Saisho, 2015) csoport és klopidogrel (0,25 mg/kg) (Iannacone et al., 2007). Az egerek 6 hétig kapták a megfelelő kezelést napi szájon át történő szoptatással (1. ábra). Ezután vért vettünk, és meghatároztuk a szérum inzulinszintet, a hematológiai indexeket és a DNS metilációs profilját (2. kiegészítő fájl).

Statisztikai analízis

Az összes statisztikai elemzést a GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc.; La Jolla, Kalifornia, USA) segítségével végeztük. A két étrendcsoport, az LFD és a HFD kiindulási méréseinek összehasonlítását párosítatlan t-teszt alkalmazásával végeztük el a paraméteres adatokhoz, és átlagként és szórásként adtuk meg őket. Ezenkívül az egyirányú varianciaanalízist (ANOVA) alkalmazták a DNS-metilációs szintek összehasonlítására a három kezelési csoportban, majd Bonferroni post-hoc tesztet követett. Míg a nem parametrikus adatokat a Mann Whitney U teszttel elemezték, és medián és interkvartilis tartományként jelentették őket. A három kezelési csoport összehasonlításához a Kruskal-Wallis tesztet, majd a Dunn többszörös összehasonlító tesztjét használtuk. A függő változó a globális DNS-metilációs szint (% 5-metil-citozin), míg a független változók a limfocita-alcsoportok, a kezelési gyógyszer és az étrend-csoport voltak. A p-érték 0,05).

Alapvető metabolikus és hematológiai jellemzők

Globális DNS-metilációs szintek összehasonlítása a prediabetikus egerek különböző sejtállományai között (HFD)

A HFF-csoport% 5mC-expressziója megnőtt a keringő perifériás vér limfocitáin, összehasonlítva az LFF csoporthoz (p = 0,049). Nevezetesen, a HFD csoportból izolált T-limfociták szintén emelkedett% 5mC-értéket mutattak (p = 0,038) az LFD-csoporthoz képest. Ugyanakkor az izolált B limfocitákban a% 5mC szint összehasonlítható volt a két étrendcsoport között (p = 0,43) (3. táblázat).

Az 5-metil-citozin szint% -a HFD-vel táplálva az LFD-vel táplált egerekhez képest

A hematológiai indexek változásai a HFD-vel táplált egerekben

Jelentős különbségek voltak a keringő limfociták (F (3,16) = 5,44, p = 0,010), a monociták (F (3,16) = 3,69, p = 0,033) és a vérlemezkék (x 2 = 9,08, p = 0,028). A post-hoc teszt azt mutatta, hogy a limfociták szignifikánsan megemelkedtek a HFD csoportban az LDA + MET csoporthoz képest (p 0,05) (4. táblázat).

Az 5-metil-citozin szint% -a kezeletlen HFD-vel táplálva, összehasonlítva a kezelt HDF-vel táplált egerekkel

Globális DNS-metilációs szintek HFD-vel táplálva a kezelt egerekhez képest

Annak értékelésére, hogy a DNS-metilációs profilok modulálódnak-e 6 hét rövid távú kezelést követően, három kezelési csoportban összehasonlítottuk a% 5mC szintet. Jelentős változások történtek az 5mC-t expresszáló T-sejtek szintjén (F (4, 20) = 6,34, p = 0,0016), a teljes limfocitában azonban nem (F (3, 16) = 1,59, p = 0,2311) és B sejtpopuláció (F (3, 16) = 1472, p = 0,2597). A T-sejtek% 5mC expressziójának szintjét összehasonlító post-hoc teszt azt mutatta, hogy az LDA szignifikánsan csökkentette a T5 sejtek% 5mC szintjét (p = 0,0045). Ezenkívül a klopidogrel-kezelés csökkentette a T-sejteken expresszált% 5mC szintjét az LDA + MET csoporthoz képest (p = 0,0051) (4. táblázat).

Vita

Az epigenetikus módosítás, pontosan a DNS-metiláció befolyásolhatja a klopidogrél választ (Zhang és mtsai, 2017). Az életkor és a testtömeg-index (BMI), amelyek a 2-es típusú cukorbetegség és a metabolikus szindróma kockázati tényezői közé tartoznak, szintén jelentősen összefüggenek a klopidogrél-válasszal (Cuisset et al., 2009; Khalil et al., 2016) . Beszámoltak arról is, hogy a cukorbetegek gyenge vérlemezke-gátló hatást mutatnak a klopidogrél-kezelés során a nem cukorbetegekhez képest (Angiolillo et al., 2005; Serebruany et al., 2008), ezt a jelenséget még ki kell deríteni.

Bár alacsony dózisú aszpirint és klopidogrélt alkalmaztak kettős terápiaként a T2DM-ben szenvedő betegek kardiovaszkuláris eseményeinek elsődleges megelőzésében. Jelentős jelentőségű súlyos nemkívánatos kardiológiai eseményekről (MACE) számoltak be. A T-sejt-specifikus DNS-metiláció és a klopidogrel-hatás összefüggésének és összefüggésének feltárása segíthet a változatos betegválaszokkal járó lehetséges tényezők tisztázásában (Khalil et al., 2016). Valójában Garcia-Calzon és mtsai arról számoltak be, hogy az emberi máj metformin transzporter génjeinek DNS-metilációja különbözött a beadott antidiabetikus gyógyszerektől függően (Garcia-Calzon és mtsai, 2017). Vizsgálatunk során az LDA prediabetikus állapotban szignifikánsan csökkentette a T-sejt-specifikus globális DNS-metiláció szintjét. Meglepő módon a T-sejt globális DNS-metilációjának szinergetikus modulációját nem figyelték meg tanulmányunkban. Ezek az új eredmények azt sugallhatják, hogy a T2DM-ben szenvedő betegek körében betekintést nyerhetnek a gyulladáscsökkentő gyógyszerekre adott változó válaszokba. A prediabetikus fázisban meginduló tartós T-sejt-aktiváció a kezelés alatt is fennmaradhat, és fokozott trombotikus kockázathoz vezethet.

A mostani vizsgálat a fő sejt limfocita vonalakra korlátozódott, és nem végeztek T-sejt altípust annak meghatározására, hogy léteznek-e különbségek a T-sejt alcsoportokban. Az aktivált T-sejtek szerepet játszanak a koszorúér-betegségben, a 2-es típusú diabetes mellitushoz társuló makrovaszkuláris szövődmények egyike. Ezenkívül egy epigenómára kiterjedő vizsgálat feltárta, hogy a tumor nekrózis faktor receptorhoz kapcsolódó 3-as faktor (TRAF3) génjének hipometilációja a megnövekedett vérlemezke-aggregációval és vaszkuláris kiújulással jár együtt ischaemiás stroke-os betegeknél, akik klopidogrél-kezelés alatt voltak (Gallego-Fabrega et al., 2016). Ezenkívül a csökkent metiláció miatti magasabb TRAF3 expresszió a CD40 szignálút növekedéséhez vezethet (Song és mtsai., 2011; Kuijpers és mtsai., 2015). A CD40 részt vesz a T-sejtek együtt-stimulálásában és aktiválásában (Song és mtsai., 2011). Egyelőre nem világos, hogy a hipermitilezett T-sejtek megtartják-e a funkcionális képességet, és hogy ez befolyásolhatja-e a T2DM-ben élő betegek immunológiai válaszait.

Következtetés

A T-sejtek részt vesznek a DNS-metilációs profilok kezdeti zavarában a gyulladás, az inzulinrezisztencia és ezt követően a 2-es típusú cukorbetegség patogenezisében. Az alacsony dózisú aszpirin hatékonyan képes módosítani a T-sejt-specifikus globális metilációt, míg a klopidogrél nem mutatott moduláló hatást a DNS-metilációs profilra rövid ideig tartó, magas zsírtartalmú étrendet követően. Ez arra utalhat, hogy a T-sejt DNS-metilációs profiljának korai változását gyulladás közvetíti, és visszafordíthatják alacsony dózisú aszpirin alkalmazásával.

Finanszírozás

Ezt a tanulmányt a KwaZulu-Natali Egyetem Egészségtudományi Főiskolája finanszírozta a Kutatási költségfinanszírozás keretében. Ezenkívül a munka azon a kutatáson alapul, amelyet részben a Dél-afrikai Nemzeti Kutatási Alapítvány támogatott [Grant Numbers: 107519]; valamint a Dél-afrikai Orvosi Kutatási Tanács egy saját kezdeményezésű kutatási támogatás keretében (9894-es szám). A kifejtett nézetek és vélemények a szerző (k) véleményét és véleményét tükrözik, és nem feltétlenül jelentik az SA MRC hivatalos nézeteit. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

A szerzők hozzájárulása

A TM és a BBN megalkotta a tanulmány ötletét és felépítését, valamint az eredmények elemzését. A ZM és a PVD segített a cikk elkészítésében. Minden szerző megírta és jóváhagyta a végleges kéziratot.

Versenyző érdekek

A szerzőknek nincsenek egymással versengő érdekei.

Etikai jóváhagyás

A tanulmányt a KwaZulu Natali Egyetem Állatkutatási Etikai Bizottsága (AREC) hagyta jóvá az etikai számmal: AREC/086/016.

Köszönetnyilvánítás

A KwaZulu-Natali Egyetem (UKZN) orvosbiológiai erőforrás egységét (BRU) elismerték az egerek laboratóriumi eljárásaiban és az állatok elhelyezésében nyújtott segítségért. Továbbá elismerték az UKZN Egészségtudományi Főiskola Humán Élettani Tanszékének (CHS) a hozzáférését az áramlási citometriás elemző létesítményhez.