A spermatogenezis és a spermiumok mozgékonyságának károsodása a magas zsírtartalmú étrend okozta bél dysbiosis által

Célkitűzés A magas zsírtartalmú étrend (HFD) által kiváltott anyagcserezavarok a spermium termelésének károsodásához vezethetnek. Célunk annak megvizsgálása, hogy a HFD által kiváltott bél mikrobiota dysbiosis képes-e funkcionálisan befolyásolni a spermatogenezist és a spermium motilitását.

Tervezés A HFD-vel táplált vagy normál étrenddel (ND) táplált hím egereket székletmikrobákat ültettük át az ND-n tartott egerekhez. A bélmikrobákat, a spermiumszámot és a mozgékonyságot elemeztük. Emberi székletből/spermából/vérből vett mintákat gyűjtöttünk a mikrobiota, a spermiumok minőségének és az endotoxin értékeléséhez.

Eredmények A HFD bélmikrobák transzplantációja az ND által fenntartott (HFD-FMT) egerekbe a spermatogenezis és a spermiumok mozgékonyságának jelentős csökkenését eredményezte, míg az ND-vel táplált egerek mikrobáival végzett hasonló transzplantáció ezt nem tette meg. A mikrobiota elemzése a Bacteroides és Prevotella nemzetség mély növekedését mutatta, amelyek valószínűleg hozzájárulnak a metabolikus endotoxaemiához a HFD-FMT egerekben. Érdekes módon a klinikai alanyok bélmikrobái erős negatív összefüggést mutattak ki a Bacteroides-Prevotella bősége és a spermiumok mozgása között, valamint pozitív korrelációt mutattak a vér endotoxin és a Bacteroides bőség között. A HFD mikrobákkal történő transzplantáció a T-sejtek és a makrofágok bélbeépüléséhez, valamint az epididymisben a gyulladásgátló citokinek jelentős növekedéséhez vezetett, ami arra utal, hogy az epididymális gyulladás valószínűleg hozzájárult a spermiumok mozgékonyságának károsodásához. Az RNS-szekvenálás szignifikáns csökkenést mutatott ki azoknak a géneknek az expressziójában, amelyek szerepet játszanak a gamete meiosisban és a herék mitokondriális funkcióiban a HFD-FMT egerekben.

Következtetés Kimutattuk a HFD által kiváltott mikrobiota dysbiosis és a spermatogenezis defektusának emelkedett endotoxinnal, a here gén expressziójának diszregulációjával és a lokalizált epididymalis gyulladással való lehetséges kapcsolatát.

Próba regisztrációs száma NCT03634644.

endotoxin
gyulladás
a bél mikrobiológiája
diéta

Ez egy nyílt hozzáférésű cikk, amelyet a Creative Commons Attribution Non Commercial (CC BY-NC 4.0) licencnek megfelelően terjesztenek, amely lehetővé teszi másoknak, hogy ezt a művet terjesszék, remixeljék, adaptálják, nem kereskedelmi célokra építsék, és származékos műveiket különböző feltételekkel, feltéve, hogy az eredeti művet megfelelően idézik, megfelelő hitelt adnak, az esetleges változtatásokat jelzik, és a felhasználás nem kereskedelmi jellegű. Lásd: http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/.

Statisztikák az Altmetric.com-tól

A tanulmány jelentősége

Ami már ismert ebben a témában?

A magas zsírtartalmú étrend (HFD) elhízáshoz és metabolikus szindrómákhoz vezet, és befolyásolja a reproduktív rendszer működését.

HFD által kiváltott bél mikrobiota dysbiosisról és endotoxaemiáról számoltak be.

Új bizonyítékok igazolták, hogy a bél mikrobiota dysbiosis szorosan összefügg egy sor olyan krónikus betegséggel, mint az elhízás, a cukorbetegség, a rák, az IBD-k és a neurodegeneratív betegségek.

A tanulmány jelentősége

Mik az új eredmények?

A HFD-vel táplált egerekből származó székletmikrobák transzplantációja a normál étrenden tartott hím egerekbe a spermiumok számának és a motilitásának jelentős csökkenését eredményezte, ami a bélmikrobák dysbiosisának termékenységre gyakorolt hatásának első jelentését jelentette.

Átfogó bioinformatikai elemzés után megmutattuk, hogy nemzetségi szinten két Gram-negatív baktérium, a Bacteroides és a Prevotella populációja élesen megnőtt a HFD-mikrobával átültetett bélben.

Ezzel egyidejűleg a vér endotoxin ugyanazon átültetett egerekben érte el az endotoxaemia szintjét.

Klinikailag a Bacteroides-Prevotella mennyisége negatívan korrelált az alanyok spermiummotilitásával, a vér endotoxinszintje pozitívan korrelált a bélben lévő Bacteroides-mennyiséggel.

Erős negatív összefüggést találtak a spermiumok mozgékonysága és a Prevotella copri magas mennyisége között (> 15% az összes fajban).

A HFD-vel táplált egerekből származó mikrobák transzplantációja és kolonizációja jelentősen megnövelte a CD3 + T-sejtek és makrofágok bélinfiltrációját, valamint az epididymális gyulladáscsökkentő citokinekben, ami arra utal, hogy az endotoxin és az epididymális gyulladás fontos szerepet játszik a bél mikroba dysbiosis által indukált a spermatogenezis megzavarása.

Hogyan befolyásolhatja belátható időn belül a klinikai gyakorlatot?

Ez a tanulmány jelenti az első jelentést a bélmikrobák területén, amely funkcionálisan megalapozza a bél kiegyensúlyozatlan mikrobiotája és a férfi termékenység károsodása közötti kapcsolatot, és hogy e bélmikrobák dysbiosisának némelyike aszthenozoospermiás betegeknél is kiderült.

Az itt bemutatott eredmények új megvilágításba helyezik a férfiak meddőségének okát és ezen betegek legalább némelyikének a bél mikrobiális ökoszisztémájának helyreállításával történő kezelésének lehetőségét.

Bevezetés

A meddőség olyan globális kérdés, amely a magas jövedelmű országokban és a jobb étkezési feltételekkel rendelkező országokban a párok 10–15% -át érinti.1 A meddőség megközelítőleg fele a férfiaknak tulajdonítható. Megjegyzendő, hogy a sperma koncentrációja a nyugati országokban 50% -kal csökkent 1973-tól 2011-ig, és még mindig nincs hatékony kezelés az ilyen trend lelassítására.2 A sperma minőségének gyors csökkenése valószínűleg a környezeti tényezők, nem pedig a genetikai okok miatt következik be, 3 4, például környezeti toxin, hő, stressz, 5 dohányzás, 6 alkoholfogyasztás7 és megváltozott étrendi struktúra. Ezenkívül az elhízás elterjedésével a zsír túlzott felhalmozódásának a férfi reprodukcióra gyakorolt negatív hatását fokozatosan felismerik a klinikai vizsgálatok. és a mozgékonyság negatívan korrelál a megnövekedett testtömegindexszel.12 Állatmodellekben mind a genetikailag öröklődő, mind a magas zsírtartalmú étrend (HFD) által kiváltott elhízás károsította a spermatogenezist.13 14 Ezenkívül a HFD epigenetikai zavarhoz vezethet a spermiumok tsRNS-je metabolikus rendellenességeket indukálhat az F1 utódokban

Emberekben és állatokban egyaránt a magas zsírtartalmú/magas cukortartalmú „nyugati” étrend elhízáshoz és anyagcsere-rendellenességekhez vezethet, és átalakítja a bél mikrobiális ökoszisztémáját17 18, amely billió mikroorganizmust tartalmaz. mint energia kitermelése, 20 a bél integritásának megőrzése, 21 a gazda immunitásának szabályozása22 23 és a kórokozók védelme.24 25 Az „egészséges” bélmikrobiota megzavarása számos krónikus betegség kialakulását ösztönözheti, mint például elhízás, 20 26 rák, 22 IBD27 és a cukorbetegség.28 Azonban még mindig nem ismert, hogy a HFD károsíthatja-e a bél mikrobiotáján keresztüli szaporodást. Ebben egy tanulmányt terveztünk a HFD által kiváltott bélmikrobiális dysbiosis hatásának spermiumok termelésére és mozgékonyságára vonatkozóan.

Anyagok és metódusok

Emberi sperma, plazma és székletminták gyűjtése

Állati eljárások

A 6 hetes C57BL/6 hím egereket a Nanjing Egyetem Állatkísérleti Központjától vásároltuk, és specifikus kórokozóktól mentes (SPF) környezetben tartottuk 12 órás világos és sötét ciklusban, ad libitum hozzáféréssel a chowhoz és a vízhez. Az egereket véletlenszerűen felosztottuk normál étrend (ND), HFD, normál étrendű széklet mikrobiota transzplantáció (ND-FMT) és magas zsírtartalmú étrend széklet mikrobiota transzplantáció (HFD-FMT) csoportokra (csoportonként hat egér, ketrecben három egér). Az ND-csoportot és a HFD-csoportot ND-vel vagy HFD-vel (Research Diet D12451, 45% zsírtartalom) tápláltuk. Négy hetes táplálkozási beavatkozás után az ND vagy HFD egerekből gyűjtött székletmintákat később átültették az ND-FMT vagy HFD-FMT csoportba, amelyeket ND-n tartottak (lásd: „A széklet mikrobiota transzplantációs kísérlete”). Az összes egeret 15 hétig tartó diétás vagy FMT-beavatkozás után feláldoztuk a szérum és a szövetek betakarításához.

Széklet mikrobiota transzplantációs kísérlet

Kétszáz mg friss székletmintát gyűjtöttünk az ND és a HFD csoportból székletürítés után, majd 4 ml sóoldatban szuszpendáltuk, 5 percig vortexeltük és steril gézzel szűrtük. A befogadó egerekbe történő átültetést 200 µL székletmintából származó székletmintával végeztük szondázással, 2 naponta egyszer, 15 héten keresztül.

Spermiumszám és a mozgékonyság mérése

A cauda epididymist 500 µl foszfáttal pufferolt sóoldatban (pH 7,2) feldaraboltuk, és 5 percig inkubáltuk 37 ° C-on, hogy felszabaduljon a sperma. A spermiumok mozgékonyságát (Hamilton) berendezéssel mértük. A spermiumszámot haemocitométerben (Marienfeld AP-0650030) kvantifikáltuk fénymikroszkóp alatt (Leica DM500).

Szövettani vizsgálat

A heréket vagy a beleket eltávolítottuk, és 4% -os formalinban rögzítettük 24 órán át, fokozatos etanolban dehidratáltuk, paraffinba ágyazottuk és 4 mm vastagságban metszettük. A metszeteket H&E festékkel festettük és fénymikroszkóppal (Leica DM500) figyeltük meg. A herék minden szakaszának hat mikroszkopikus mezőjét véletlenszerűen választottuk ki (400-szoros nagyítás) 30, és különböző csírasejteket (spermatogonia, spermatocyták és kerek spermatidák) számláltunk (n = 6/csoport). Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be.

Konfokális mikroszkópia és immunfluoreszcencia

Az immunfluoreszcens festéshez a paraffin metszeteket (4 um vastagságú) ellenfestékként 4 ', 6-diamidino-2-fenilindollal (DAPI) vizsgáltuk. Az elsődleges alkalmazott antitest a nyúl antimouse CD3e volt (1: 400; Abcam). Az alkalmazott másodlagos antitest (1: 500; Invitrogen) az Alexa Fluor488 szamár antinyúl volt. A metszeteket Zeiss LSM800 konfokális mikroszkóp alatt vizsgáltuk.

Immunhisztokémiai festés

A paraffinszöveti szakaszokat (4 um vastagságú) F4/80 elleni antitesttel inkubáltuk (1: 400; Cell Signaling Technology). A specifikus jeleket EnVision polimer technológiával detektáltuk, és a megjelenítést 3,3N-diaminobenzidin-tetrahidrokloriddal hajtottuk végre. A metszeteket LEICA DM2500 mikroszkóppal fényképeztük LEICA DMC6200 kamerával.

A szérumparaméterek mérése

Az egér szérum endotoxint ELISA készletekkel (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Kína) mértük a gyártó protokolljainak megfelelően. A humán plazma endotoxint végpont kromogén TAL endotoxin teszttel mértük (Bioendo, Kína).

Orális glükóz tolerancia teszt

12 órás éhgyomorra minden egérnek orális glükóz-tolerancia tesztet vetettek alá. A D-glükóz (2 g/testtömeg-kg) szájon át történő szoptatását követően a farokvénákból vérmintákat vettünk 0, 15, 30, 45, 60, 90 és 120 perc múlva. A glükózszinteket glükométerrel határoztuk meg (Accu-Chek Performa).

A here RNS kivonása és szekvenálása

A fekális genomi DNS kivonása és szekvenálása

A fekális DNS-t a vakbél székletmintáiból QIAamp DNS Stool Mini Kit (Qiagen 51504) segítségével nyertük ki a gyártó utasításainak megfelelően. A 16S-rDNS gén hipervariábilis V3-V4 régióját PCR-rel amplifikáltuk a 341F primerek alkalmazásával: CCTACGGGNGGCWGCAG; 806R: GGACTACHVGGGTTCTAAT, ahol a vonalkód egy nyolc bázisú szekvencia volt, egyedi az egyes mintákhoz. Az amplikonokat 2% -os agarózgélekből nyertük ki, és az AxyPrep DNS gélkivonó készlettel (Axygen Biosciences, USA) tisztítottuk a gyártó utasításai szerint, és QuantiFluor-ST (Promega, USA) segítségével számszerűsítettük. A megtisztított amplikonokat ekvimoláris és páros végű (2x250) szekvenáljuk Illumina platformon a standard protokollok szerint. A nyers leolvasásokat az NCBI SRA adatbázisba rakták le, hozzáférési számmal: SRP168312 az egér székletmintáihoz; SRP221703 emberi mintákhoz.

16S-rDNS szekvenálási adatok bioinformatikája és statisztikai elemzése

A kiváló minőségű, tiszta olvasás érdekében az elemzésre kiválasztott érvényes olvasmányok standardjai a következők voltak: (a) az> 10% ismeretlen nukleotidot (N) tartalmazó olvasások eltávolítása, (b) 20-at tartalmazó tiszta olvasások eltávolítása. nyers címkékként FLSAH-t (V.1.2.11) használva, minimum 10 bp átfedéssel és 2% -os eltérési hibaaránnyal. A nyers címkék zajos szekvenciáit QIIME (V.1.9.1) csővezetékkel szűrtük meghatározott szűrési körülmények között, hogy kiváló minőségű tiszta címkéket kapjunk. A hatékony címkéket a MOTHUR-vezeték segítségével ≥ 97% -os hasonlóságú operatív taxonómiai egységekbe (OTU-k) csoportosítottuk. A legmagasabb mennyiségű tag-szekvenciát mindegyik klaszterben reprehens szekvenciának választottuk. A reprezentatív szekvenciákat egy naiv Bayes-i modell szerint csoportosítottuk organizmusokba, Greengenes (V.gg_13_5) alapján RDP osztályozóval (V.2.2) (http://greengenes.secondgenome.com). Az egyes taxonómiák és filogenetikai fák bőséges statisztikáit Perl-szkriptben szerkesztettük, és Scalable Vector Graphics segítségével vizualizáltuk. A súlyozott unifrac távolságok fő koordinátanalízisét (PCoA) kiszámítottuk és R-ben ábrázoltuk.

Statisztikai analízis

Kiegészítő anyag

A HFD által kiváltott bél mikrobiota egyensúlyhiánya kiválthatja a gazdaszervezet immunválaszát22 45, amely krónikus gyulladást is magában foglal. 46 A HFD által kiváltott székletmikrobákkal átültetett egerekben a T-sejtek és makrofágok erős beszivárgását/aggregációját figyeltük meg a vékonybél lamina propriájában., amely következtetés alapján erős helyi gyulladásos állapotot jelzett. Azt, hogy egy ilyen lokalizált bélgyulladásos állapot hozzájárult-e a megfigyelt spermatogén defektushoz, még meg kell határozni. Másrészt a caput epididymális gyulladás, amelyet az IL-1β, CXCL-10, MCP-1 és NF-κBp65 fokozott expressziója tükröz, valószínűleg „bűnös” lehet, amely felelős a spermiumok számának és a motilitás csökkenéséért. HFD-FMT egerek. Több tanulmány kimutatta, hogy az epididymális gyulladás állapota negatívan befolyásolja a sperma minőségét.38 39 47–52 Az NF-κB p65 expresszió globális emelkedése kimutatták, hogy gyulladáscsökkentő és elhízásgátló hatást fejt ki az energiafelhasználás növelésével.53 Ugyanakkor nem láttunk semmit az energiafogyasztás különbsége a két FMT-vel kezelt egér között. Ennek oka lehet az a tény, hogy az NF-κB p65 expressziójának emelkedése csak bizonyos szervekre/szövetekre korlátozódott, mint például az epididymis.

Korábbi vizsgálatok jól megalapozták az endotoxaemia/epididymal gyulladás és az alacsony spermiummotilitás/spermatogén diszfunkció közötti okozati összefüggést mind állatmodellekben, mind emberekben. 38 39 47–52 A lipopoliszacharidok (LPS) intraperitoneális adagolása emelheti a gyulladásgátló citokinek expresszióját, mint például az IL-1β, az IL-6 és a CXCLi2 a kakasok epididymájában és heréjében48, és növeli az IL-18 szintjét az egér heréiben. -6 szint és alacsony spermiummozgást eredményez patkányokban.50 Fontos, hogy az emberi spermiumok LPS-sel történő inkubálása csökkentheti a spermiumok mozgékonyságát.51 Az emberi elhízás metabolikus endotoxémiája szorosan összefügg a spermium DNS-integritásának károsodásával.52 Ezek a jelentések összhangban vannak hipotézis szerint a széklet mikrobiális transzplantációja által kiváltott endotoxaemia és epididymitis a spermatogenezis nyilvánvaló fenotípusaihoz vezetett. Tehát a bél mikrobiota strukturálisan kiegyensúlyozatlan architektúrája, amelyet a HFD egerek adtak át, káros hatást gyakorolhat a gazdasejt spermiumának mozgékonyságára az epididymisz lokális gyulladásán és az endotoxin szisztémás emelkedésén keresztül.

Régóta úgy gondolják, hogy a környezeti és a „nyugatiasított” étrendi változások fontos tényezők az emberek spermium-koncentrációjának elhúzódó globális csökkenésében. Bár a „nyugati stílusú” étrend részben a gyulladás és a glükóz/lipid anyagcsere szabályozásán keresztül megzavarhatja a férfiak termékenységét, ez a tanulmány további mechanisztikus dimenziót kínál a megszakadt bélmikrobiális ökoszisztéma összekapcsolásában a károsodott spermatogenezissel és a spermiumok mozgékonyságával. A gazda és a bél mikrobiota összetett kölcsönhatásai miatt további munkára van szükség a bél mikrobiota hím reprodukcióra gyakorolt hatásának mechanizmusainak tisztázására. Az itt bemutatott tanulmány kiemeli a férfi meddőség kezelésének lehetőségét, különösen a metabolikus szindrómákkal összefüggőeket, a bél mikrobiális ökoszisztémájának helyreállításával.