Megnövekedett szívizomérzékenység az ismétlődő ischaemiára magas zsírtartalmú étrend okozta elhízás esetén

Geeta D. Thakker

1 Atherosclerosis és érgyógyászat szekció, Baylor College of Medicine, Houston, TX

Nikolaos G. Frangogiannis

2 Szív- és érrendszeri tudományok szekciója, Baylor College of Medicine, Houston, TX

Pawel T. Zymek

2 Szív- és érrendszeri tudományok szekciója, Baylor College of Medicine, Houston, TX

Saumya Sharma

4 Kardiológiai osztály, Belgyógyászati Klinika, a Texasi Egyetem Orvostudományi Kar, Houston, TX, TX

Joe L. Raya

1 Atherosclerosis és érgyógyászat szekció, Baylor College of Medicine, Houston, TX

Philip M. Barger

3 Kardiológiai szekció, Orvosi Osztály, Baylor College of Medicine, Houston, TX

Heinrich Taegtmeyer

4 Kardiológiai osztály, Belgyógyászati Klinika, a Texasi Egyetem Orvostudományi Kar, Houston, TX, TX

Mark L. Entman

2 Szív- és érrendszeri tudományok szekciója, Baylor College of Medicine, Houston, TX

Christie M. Ballantyne

1 Atherosclerosis és érgyógyászat szekció, Baylor College of Medicine, Houston, TX

5 Szív- és érrendszeri betegségek megelőzésének központja, Methodist DeBakey Szívközpont, Houston, TX

Absztrakt

Bevezetés

Az elhízás gyakran inzulinrezisztenciával jár, és metabolikus rendellenességekkel, nevezetesen hiperglikémiával, a plazma szabad zsírsav (FFA) megnövekedett koncentrációjával és a lipid metabolitok méhen kívüli felhalmozódásával társul nem adipózis szövetekben, például vázizomban, májban és szívben. Egyre több bizonyíték áll rendelkezésre arról, hogy a túlzott lipidfelhalmozódás a kardiomiocitákban mérgező és jelentősen hozzájárul az elhízáshoz és/vagy a cukorbetegséghez általában társuló szívbetegségekhez (1).

Kutatási módszerek és eljárások

Állatgondozás

Valamennyi állat humánus ellátásban részesült az „Útmutató a laboratóriumi állatok gondozásához és felhasználásához” (NIH 85–23. Kiadvány, felülvizsgált 1985) szerint, és a protokollt a Baylor College of Medicine intézményi állatgondozási és felhasználási bizottsága hagyta jóvá. C57BL/6J egereket (The Jackson Laboratory, ME) házon belül tenyésztettek. Az egereknek (3–5 ketrecenként) ad libitum hozzáférést biztosítottak a vízhez és a szokásos chow-étrendet

13,5% kcal zsírból (Picolab Rodent Diet 5010, Purina Mills, Inc., St. Louis, MO) 6-8 hetes korig történő elválasztás után. Az elhízást azzal indukálták, hogy ad libitum hozzáférést biztosított a magas zsírtartalmú étrendhez

42% kcal zsírból (Dyet # 112734, Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ) 6–8 hetes kortól 24 héten keresztül. A sovány kontrollok a kísérlet idejéig továbbra is a chow-étrendet táplálták.

A szívzsírsav meghatározása gázkromatográfiával - tömegspektrometriával

Zsírsav-oxidációs vizsgálatok in vitro

A FAO vizsgálatokat sovány és elhízott egerek szívhomogenátumain hajtották végre Sekiguchi és munkatársai (15) által leírt protokoll szerint [1–14 C] palmitinsavat használva. Az FA β-oxidációs képességét cpm/mg szívszövetben fejeztük ki.

A lipidek extrakciója és a triglicerid meghatározása

A szíveket kivágtuk és feldolgoztuk lipidek extrahálásához Thakker és munkatársai által részletesen leírtak szerint (16). A lipideket kloroformmal, metanollal és 0,9% -os nátrium-kloriddal extraháltuk Folch (17) módszerével. A triglicerideket egy kereskedelemben kapható készlettel (Sigma Diagnostics Inc.) mértük, standardként trioleint használva.

Rövid ismétlődő ischaemia – reperfúzió

Szövettan és immunhisztokémia

A parafinba ágyazott szíveket 200 μm-es szakaszonként metszettük a bázistól a csúcsig. A metszeteket hematoxilinnal és eozinnal festették a kezdeti értékeléshez és a varrat alatti terület azonosításához. Az első kiértékelés után a soros szakaszokat picrosirius vörös színnel festették a kollagén rostok azonosítására (18). A pikrosirius által festett tárgylemezeket Zeiss Axioskop mikroszkóppal szkenneltük, és a kvantitatív kiértékelést ImagePro szoftverrel hajtottuk végre, amint azt korábban leírtuk (19). A kollagén százalékos festését százalékosan értékeltük az elülső falon 5 napos ismételt I/R után.

Immunhisztokémiát végeztek specifikus anti-egér antitesttel a következő sejttípusok azonosítására: neutrofilek (patkány anti-egér neutrofil antitest, Serotec, Oxford, Egyesült Királyság) és myofibroblastok (monoklonális α – simaizom aktin antitest, Sigma, St. Louis, MO ). A festést peroxidáz-alapú technikával, a Vectastain Elite készlettel (Vector laboratories, Burlingame, CA) végeztük. A metszeteket eozinnal ellenfestettük, és kvantitatív elemzést végeztünk az elülső falban lévő jelölt sejtek sűrűségének megszámlálásával 5 napos ismétlődő I/R után. A miofibroblasztokat orsó alakú α – simaizom aktin-pozitív sejtként azonosítottuk, amelyek az érközegen kívül helyezkedtek el, és sűrűségüket sejt/mm 2 -ben fejeztük ki. .

Gén-expresszió valós idejű PCR-rel

Az RNS izolálásának, a cDNS szintézisének és a kvantitatív RT-PCR módszereit korábban leírták (20). Korábban publikálták a PPAR-α, izom-típusú karnitin-palmitoiltranszferáz – 1 (mCPT-1) és közepes láncú acil-koenzim A dehidrogenáz (MCAD) láncindítók és próbák nukleotidszekvenciáját is (20, 21). Taqman primereket és próbákat a PPAR-β/δ és 18S-hez az Applied Biosystems-től szereztük be. A ciklofilin transzkriptum szintjét SYBR Green kémia alkalmazásával határoztuk meg publikált primer szekvenciák alkalmazásával (22). Az expressziót 18S vagy ciklofilin transzkriptum szintre normalizáltuk. A belső standardokat T7 RNS polimeráz módszerrel állítottuk elő.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. A csoportok közötti statisztikai különbségeket a nem párosított Student t-teszttel elemeztük. Azokat az adatokat, amelyek nem követték a normális Gauss-eloszlást, egy nemparametrikus Mann – Whitney teszttel elemeztük. A P≤0,05 értéket szignifikánsnak tekintették.

Eredmények

A „nyugati” magas zsírtartalmú étrenddel 24 héten át táplált C57BL/6J egerek elhízottak és inzulinrezisztenciát alakítottak ki. Az elhízott hím egerek kb. 1,5-szer nehezebbek voltak, mint a sovány hím egerek (47,5 g és 32,2 gm, P Az 1. táblázat összefoglalja a chow és a „nyugati” magas zsírtartalmú étrend FA összetételét. A „Western” magas zsírtartalmú étrend lényegesen magasabb telített, Kétszer több telítetlen FA és nagyobb n-3/n-6 arány, mint a chow étrend.

Asztal 1

A diéták zsírsavösszetétele

Zsírsav

C4: 0	-	0,71
C6: 0	0,01	0,42
C8: 0	0,01	0,25
C10: 0	0,01	0,57
C12: 0	0,01	0,63
C14: 0	0,09	2.25
C14: 1 (n-9)	0,01	0,34
C16: 0	0,90	5.88
C16: 1 (n-9)	0,13	0,53
C18: 0	0,26	2.73
C18: 1 (n-9)	1.10	5.63
C18: 2 (n-6)	1.88	0,53
C18: 3 (n-3)	0,17	0,32
C20: 0	0,01	0,23
C20: 4 (n-6)	0,01	-
20: 1 (n-9)	0,02	-
20: 2 (n-6)	0,01	-
20: 5 (n-3)	0.10	-
22: 6 (n-3)	0.11	-
22: 5 (n-3)	0,02	-
telített	1.28	13.67
telítetlen	3.55	7.33
n-6	1.90	0,53
n-3	0,39	0,32
n-3/n-6 arány	0,20	0,60

Az értékek az összes zsírsav tömegszázalékát jelentik az étrendi lipidekben.

Szív lipidek és zsírsav oxidáció

30% -kal magasabb, mint a sovány egereké (74,67 ± 4,31 vs 57,84 ± 3,48 cpm/mg szívtömeg, P 2. ábra). Az elhízott álműtött egerekben a PPAR-α és -β/δ transzkriptumszintjét felülszabályozták

1,6-szorosa a sovány ál-operált egerekhez képest. Az ismétlődő I/R protokoll szignifikánsan csökkentette mind a PPAR-α, mind a -β/δ-t elhízott egerekben, összehasonlítva az elhízott ál állatokkal. Az ismétlődő I/R-nek kitett sovány állatoknál a PPAR-α expressziója nem változott, de a PPAR-β/δ expressziójának szerény és szignifikáns növekedését figyeltük meg. Annak eldöntésére, hogy a PPAR-α és -β/δ megemelkedett korrelációja korrelál-e a FAO-ban részt vevő célgének fokozott expressziójával, megvizsgáltuk két célgén, az mCPT-1 és az MCAD mRNS expresszióját sovány és elhízott állatokban I/R után . Az elhízás az mCPT-1 fokozott expressziójával járt, és az MCAD magasabb expressziója felé irányult a tendencia (P = 0,08). Amint azt a PPAR-α és -β/δ esetében fentebb megjegyeztük, az ismétlődő I/R jelentősen csökkentette az mCPT-1 és az MCAD expresszióját elhízott, de nem sovány állatokban (2. ábra).

Az étrend okozta elhízás megváltoztatja a szívzsírsav-anyagcsere gén expresszióját. A PPAR-α, PPAR-β/δ és célgén mCPT-1 transzkript szintjei elhízottaknál szignifikánsan felülszabályozódtak (n = 3) a sovány ál-állatokhoz (n = 4) képest. Az MCAD transzkriptumszintje (P = 0,08) magasabb volt elhízottaknál, mint a sovány ál-operált állatoké. A 3 napos ismétlődő I/R a PPAR-α, mCPT-1 és MCAD transzkriptumok szignifikáns csökkentésével társult elhízott egerekben (n = 8), de sovány egerekben (n = 9) nem, összehasonlítva a megfelelő csalásokkal. A sovány, ismétlődő I/R állatokban a PPAR-β/δ szignifikánsan felül volt szabályozva, de elhízott, ismétlődő I/R állatokban alacsonyabb volt a szabályozás, összehasonlítva a megfelelő csalásokkal.

Szív lipidek és plazma FFA-k ismétlődő I/R után

Annak érdekében, hogy elhízott egerekben az FA metabolizmus génjeinek szabályozása az ismétlődő I/R után a szív lipidprofiljának változását eredményezhesse, 3 napos ismétlődő I/R után mértük a lipideket. Az összes FFA-érték szignifikánsan magas maradt az elhízott egerekben az ismétlődő I/R után (P 3a. Ábra). Ezenkívül a szív triglicerid koncentrációja jelentősen megnőtt az elhízott egerekben az I/R után (3b. Ábra). Mivel a szívinfarktus vagy a szívműtét utáni reperfúzió után általában magas FA-szinteket észlelnek embereknél, az összes plazma-FFA-t 3 napos ismétlődő I/R után mértük. Amint a 3c. Ábra mutatja, a plazma FFA-k az ismétlődő I/R 3 napján szignifikánsan magasabbak voltak elhízott, mint sovány állatoknál.

Szív-FFA-k, trigliceridek és keringő FFA-k 3 napos ismétlődő I/R után. Az FFA C16: 1, C18: 0, C18: 1 és C20: 4 (A) és trigliceridek (B) szívszintje szignifikánsan magasabb volt elhízott, mint sovány egereknél, míg a C18: 2 és C22: 6 (A) nagyobb az elhízott egereknél. A keringő FFA-k (C) 3 napos ismétlődő I/R után szignifikánsan magasabbak voltak elhízottaknál, mint sovány egereknél.

Szövettani kórkép ismétlődő I/R után

Korábban beszámoltunk arról, hogy az iszkémia rövid epizódjai reverzibilis ischaemiás kardiomiopátiához vezetnek (11). A 4. és az 5. ábra összefoglalja a szövettani értékelést sovány és elhízott egerekben 5 napos ismételt I/R után. Karcsú egereknél intersticiális kiszélesedést és markáns fibrózist figyeltünk meg az elülső falban infarktus nélkül. Az elhízott egerek azonban kedvezőtlenül reagáltak az I/R ezen rövid epizódjaira, és mikroinfarktusokat fejlesztettek ki. A mikroinfarktus, amint az várható volt, megnövekedett gyulladásos infiltrátummal járt. A myofibroblast sűrűsége és a fibrózis jelentősen megnőtt a DIO egerekben a sovány egerekhez képest. A neutrofil sűrűség szintén szignifikánsan megnőtt a DIO egerekben (17,43 ± 6,98 sejt/mm 2) a sovány egerekhez képest (3,67 ± 0,75 sejt/mm 2; P = 0,04).

Megnövekedett myofibroblast sűrűség elhízott egerekben 5 napos ismétlődő I/R után. A szív myofibroblasztjait orsó alakú α – simaizom aktin-pozitív sejtekként azonosítottuk, amelyek az erek (nyilak) közegén kívül helyezkednek el. Az α – simaizom aktin immunhisztokémia az ér simaizomsejtjeit (nyílhegyek) is festette. A miofibroblaszt sűrűsége (A) szignifikánsan magasabb volt elhízott (n = 7), mint sovány (n = 9) egereknél. A csoportok összehasonlításához nem paraméteres Mann – Whitney tesztet alkalmaztunk (P = 0,04). A sovány és elhízott egerek elülső falának reprezentatív képe a miofibroblasztokat ábrázolja (B).

Az elhízott egerekben megnövekedett fibrózis társult mikroinfarktussal 5 napos ismételt I/R után. A kollagént picrosirius festéssel detektáltuk, és mennyiségét meghatároztuk a sovány (n = 9) és az elhízott (n = 7) egerek elülső falában. A sovány egerek jelentős interstitialis fibrózist (nyilakat) mutattak ki jelentős kardiomiocita veszteség hiányában. Ezzel szemben az elhízott egereknél mikroinfarktus volt, helyettesítő fibrózis (nyilak) és jelentősen fokozott kollagénlerakódás kíséretében (p McGavock JM, Victor RG, Unger RH, Szczepaniak LS. A szív adipozitása, felülvizsgálva. Ann Intern Med. 2006; 144: 517– 24. [PubMed] [Google Tudós]