Az elhízás helyett a magas zsírtartalmú takarmányozás okozza az egerek bél mikrobiotájának taxonómiai és funkcionális változásait

Absztrakt

Háttér

Köztudott, hogy a magas zsírtartalmú (HF) étrend okozta elhízott egerek mikrobiája különbözik a sovány egerekétől, de ez a különbség mennyire tükrözi az elhízott állapotot, vagy az étrend nem egyértelmű. A magas HF táplálkozással járó bél mikrobiota változásainak és az elhízással összefüggő változások elkülönítéséhez kihasználtuk a C57BL/6JBomTac (BL6) és a 129S6/SvEvTac (Sv129) egerek étrend által kiváltott elhízásra gyakorolt különböző érzékenységét és eltérő válaszaikat. a ciklooxigenáz (COX) aktivitásának gátlására, ahol a COX aktivitás gátlása a BL6 egerekben megakadályozza a HF diéta által kiváltott elhízást, Sv129 egereknél azonban hangsúlyozza az elhízást.

Eredmények

HiSeq-alapú teljes genom-szekvenálás segítségével taxonómiai és funkcionális különbségeket azonosítottunk a két egér törzs bélmikrobiotájában a rendszeres, alacsony zsírtartalmú vagy HF-étrendet táplálták COX-gátlóval, indometacinnal kiegészítve vagy anélkül. Az elhízás kialakulása helyett a HF-táplálás vezetett a bél mikrobiotájának egyértelmű változásaihoz. Megfigyeltük az alfa sokféleség, a génszám, a butiráttermelőként ismert nemzetségek és a butiráttermelésben részt vevő gének rengeteg növekedését Sv129 egerekben az LF vagy HF étrendet tápláló BL6 egerekhez képest. Ezzel szemben a megnövekedett energiatermeléssel járó propionát metabolizmusban részt vevő gének száma nagyobb volt a BL6 egerekben, mint az Sv129 egerekben.

Következtetések

A bél mikrobiota összetételének változásait elsősorban a magas zsírtartalmú etetés hajtotta, nem pedig az egerek elhízott állapotát tükrözte. A butirátot és propionátot termelő baktériumok bélben való különbségei legalább részben hozzájárulhatnak az elhízás hajlandóságában megfigyelt különbségekhez Sv129 és BL6 egerekben.

Háttér

Az elhízásra hajlamos C57BL/6JBomTac (BL6) egér törzs és az elhízásnak ellenálló 129S6/SvEvTac (Sv129) egér törzs a leggyakrabban használt törzsek egyike a genetikai és étrend okozta elhízás vizsgálatában. Kimutattuk, hogy a ciklooxigenáz aktivitás gátlása fokozta a HF táplálkozás által kiváltott elhízást az elhízás-rezisztens Sv129 egerekben azáltal, hogy csökkentette az étrend által kiváltott termogenezist és az UCP1 expresszió indukcióját inguinalis fehér zsírszövetben [22], míg a ciklooxigenáz aktivitás gátlása normális elhízásban hajlamos BL6 egerek megakadályozták a HF táplálkozás által kiváltott elhízást [23].

További betekintést nyerhet a bél mikrobiotájában az étrendhez és az elhízáshoz kapcsolódó változásokhoz, és megkülönböztethetjük, hogy a megfigyelt változások az elhízott állapotból vagy a HF táplálkozásból származnak-e., Kihasználtuk e két egér törzs eltérő fogékonyságát az étrend által kiváltott elhízásra és a ciklooxigenáz aktivitás gátlására adott különböző válaszaikat. Eredményeink azt mutatják, hogy a bél mikrobiotájának változásai nagyrészt a HF táplálkozást tükrözik, nem pedig az elhízást.

Eredmények

A bél metagenóm referencia készletének kísérleti beállítása és felépítése

Az obesogén étrendre adott válaszként a bél mikrobiotájában bekövetkező változások és az elhízás kialakulása miatti változások megkülönböztetésére a BL6 és Sv129 egerek eltérő hajlandóságát használtuk fel az étrend által kiváltott elhízás kialakulására, valamint az általános ciklooxigenáz inhibitor indometacinnal történő kezelésre adott eltérő válaszaikat. . Az egereket alacsony zsírtartalmú (LF) étrenden tartották, vagy HF diétát (HFI) vagy nem (HF) indometacinnal tápláltak. A korábbi megállapításokkal [22] összhangban az indometacin felvétele hangsúlyozta a magas zsírtartalmú étrend okozta súlynövekedést, a fehér zsírszövet (WAT) tömegét és a hipertrófiát az Sv129 egerekben (1. ábra). Ezzel szemben az indometacin-kiegészítés megakadályozta a magas zsírtartalmú étrend okozta súly, WAT-tömeg és hipertrófia növekedését a BL6 egerekben (1. ábra) [23].

Az étrend okozta és törzsfüggő változások a bél mikrobiotájában

A gén-, nemzetség- és KO-profil-alapú főkoordináták elemzése (PCoA) (2. ábra és 3. kiegészítő fájl: S2. Ábra) az étkezési zsírtartalomra mint fő elválasztó tényezőre (PC1) és a Sv129 és BL6 egerek törzsspecifikus különbségére mutatott rá. mint másodlagos elválasztó tényező (PC2). A PCoA továbbá bebizonyította, hogy a mikrobiom génprofilok (2. ábra) és a Wilcoxon rang-összeg teszt alapján (4. kiegészítő fájl: S3. Ábra és 5. kiegészítő fájl: nincs szignifikáns különbség a HF- és a HFI-vel táplált egerek között. S4. Ábra), annak ellenére, hogy az indometacin egyértelműen befolyásolja az elhízás kialakulását.

Az összes minta PCoA elemzése génprofilok alapján. A különböző színek és formák jelölje meg a különböző alcsoportokból származó mintákat, míg a üres, félig tele, és teli pontok megfelelnek a „soványnak” vagy „a zsírszövet tömegének (NSI) jelentős növekedése nélkül” és „a zsírszövet tömegének jelentős növekedésének (SI)” jellemzett egereknek. A PCoA bemutatja, hogy az egér törzse és az étrend miként befolyásolja az elválasztást gén szinten

Egy PERMANOVA-teszt hasonlóan bebizonyította, hogy az étrendnek nagyobb hatása volt a bél mikrobiotájára, mint a törzsre, és ami fontos, hogy az indometacin-kiegészítés nem befolyásolta szignifikánsan a bél mikrobiota összetételét gén szinten, a nemzetség szintjén és a KEGG szintjén (6. kiegészítő fájl: S2. Táblázat ).

Az elhízásról beszámoltak arról, hogy a mikrobiális génszám csökkenésével jár [11, 12]. LF-vel táplált egerekben a Sv129 egerekben a génszám szignifikánsan magasabb volt, mint a BL6 egerekben (3b. Ábra). Az indometacin-kiegészítéssel vagy anélkül végzett HF-táplálás mindkét törzsben növelte a génszámot. Így a génszám növekedését figyelték meg a HF-etetésre adott válaszként, függetlenül attól, hogy az egerek soványak maradtak-e vagy elhízottak-e. Megjegyzendő, hogy HF-etetés után a két törzs között nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget a génszámban (3b. Ábra).

A HF-diéták fogyasztása taxonómiai változásokat váltott ki, a törzs és az elhízás fejlődésétől függetlenül. A Wilcoxon rang-összeg teszt (P 4. ábra

Az Sv129 és BL6 egereket jellemző nemzetségek hálózata. A zöld körök nemzetségek nagyobb mennyiségben vannak jelen az Sv129 egerekben, mint a BL6 és piros körök nemzetségek nagyobb mennyiségben vannak jelen a BL6 egerekben, mint a Sv129-ben. A a kör területe a nemzetség relatív bőségét képviseli. A folytonos vonal két nemzetség között pozitív korrelációt képvisel, míg az a szaggatott vonal negatív korrelációt jelent

A KEGG 1. szintű útvonal-elemzései további HF-diéta által kiváltott változásokat tártak fel, a törzstől és az elhízástól függetlenül. A sejtszintű folyamatokhoz és a környezeti információs folyamatokhoz kapcsolódó KO-k relatív bősége nőtt a HF-diéta táplálása után, míg az általános anyagcseréhez kapcsolódó KO-k száma csökkent (4. kiegészítő fájl: S3. Ábra). Az érintett anyagcsere-utak további elemzéséhez használtuk z pontszám módszer [32] a funkcionális elemzéshez az útvonalak és modulok szintjén, majd az egyes kiválasztott utak és modulok KO változásainak részletes elemzése. Az egér törzsétől függetlenül a HF-etetés növelte a zsírsav anyagcserével, a sejtek mobilitásával, transzportjával, metán anyagcseréjével és a xenobiotikus lebomlással kapcsolatos utakban és modulokban részt vevő gének számát, valamint csökkentette a transzlációban és a vitamin bioszintézisben részt vevő gének mennyiségét (16. kiegészítő fájl: S4 táblázat és 17. kiegészítő fájl: S5 táblázat).

A trigliceridek glicerin részének felhasználása szükséges az energia kinyeréséhez a trigliceridekből HF étrendben anaerob környezetben. Annak megvizsgálására, hogy a bél mikrobiota alkalmazkodik-e a megnövekedett glicerin-kihasználathoz a HF-diéta hatására, a KEGG-t és az NCBI-t használtuk a glicerin-felhasználás kulcsfontosságú enzimének, a glicerin-kináznak a leggyakoribb nemzetségekben való keresésére. Megjegyzendő, hogy a 25 leggyakoribb nemzetség közül 18-ban találtak glicerin-kinázt (18. kiegészítő fájl: S6. Táblázat). Ezenkívül a glicerin-kinázt kódoló géneket tartalmazó nemzetségek többsége gazdag volt HF-étrenddel etetett egerekben, míg a glicerin felhasználására képtelen nemzetségek alacsony zsírtartalmú étrendes táplálású egerekben gazdagodtak (18. kiegészítő fájl: S6. Táblázat). Ez együtt azt sugallja, hogy a glicerin hasznosításának megnövekedett képessége jellemzi a HF diéta által kiváltott változásokat a bél mikrobiotájában mindkét egér törzsben.

Az epesavak fontos szerepet játszanak a bélben a zsíranyagcserében, és a HF-táplálás megnövelheti az epesav 7a-dehidroxilezés szükségességét. Ennek megfelelően a következőket sorolja be: Clostridium scindens, Clostridium hiranonis, Clostridium hylemonae, és Clostridium leptum, mindazokról, amelyek felgyorsítják az epesav 7a-dehidroxilezését [33, 34], nagyobb mennyiségben találtak a HF-etetés után (19. kiegészítő fájl: S13. ábra). Továbbá a Clostridium a nemzetség mindkét egér törzsben megnövekedett a HF diéta hatására (5. kiegészítő fájl: S4. ábra).

Vita

LF diétával táplált egereknél jellemző különbségeket figyeltünk meg a Sv129 és a BL6 egerek között. Mivel Firmicutes nagyobb mennyiségben voltak jelen a Sv129-ben, mint a BL6 egerekben, Verrucomicrobia BL6 egerekben voltak nagyobb arányban, mint Sv129 egerekben. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a A. muciniphila, arról számoltak be, hogy fenntartja a bélgát funkciót, és az étrend okozta elhízással szembeni rezisztenciához kapcsolódik [28], alacsonyabb volt az elhízás-rezisztens Sv129-ben, mint a BL6 egerekben mind LF, mind HF étrenden. Ez a megállapítás aláhúzza, hogy annak ellenére, hogy a baktériumok általi kolonizáció ellensúlyozza a diéta okozta elhízást [28, 44, 45], ennek a baktériumnak a funkciója függhet egy adott közösségi környezettől, amit a relatív rengeteg A. muciniphila különböző tartási létesítményekben tartott egerek székletmintáiban [15].

Az energia kivonása a trigliceridekből anaerob környezetben a glicerin metabolizmusától függ. A KEGG és az NCBI segítségével a legfontosabb enzimek felkutatására a glicerin felhasználásában a leggyakoribb nemzetségekben azt tapasztaltuk, hogy a glicerin kinázokat, acilglicerin kinázt vagy diacilglicerin kinázt kódoló géneket a 25 leggyakoribb nemzetség közül 10-ben találtuk meg, és ezek közül 8 nemzetség dúsítottak egerekkel, akiket HF-diétával tápláltak, míg a glicerin hasznosítására nem képes nemzetségek alacsony zsírtartalmú étrenddel táplált egerekben gazdagodtak. Ez arra utal, hogy az ilyen adaptáció hozzájárul a bél mikrobiotájában a törzsfüggetlen HF étrend által kiváltott változásokhoz. Hasonlóképpen a HF-etetés a bőség növekedéséhez vezetett Clostridium az epesav 7α-dehidroxilációjának felgyorsítását jelentő fajok [33, 34] összefüggésbe hozhatók az epesav-anyagcsere szükségességével a trigliceridtartalmú étrend bevitelére reagálva, de egyértelműen további munkára van szükség annak megállapításához, hogy a HF-táplálás megváltoztatja-e az epét savas anyagcsere.

Következtetések

Mód

Vizsgálati vegyületek és étrendek

Alacsony zsírtartalmú (Ssniff EF R/M kontroll) és magas zsírtartalmú (Ssniff EF R/M acc D12492) étrendeket a Ssniff Spezialdiäten GmbH-tól (Németország) szereztünk be. Az alacsony zsírtartalmú étrend 70 energia (e)% szénhidrátot, 20 e% fehérjét és 10 e% zsírt tartalmazott, a magas zsírtartalmú étrend pedig 21 e% szénhidrátot, 19 e% fehérjét és 60 e% zsír. Az indometacinnal (HFI) kiegészített HF-étrendhez 0,0016 g/100 g került az étrendbe.

Állatok és szállás

Huszonnégy hím C57BL/6JBomTac és 30 hím 10 hetes 129S6/SvEvTac egeret kaptunk a Taconic-tól (Ry, Dánia). Valamennyi egeret külön-külön fűrészporos ágyneművel tettük ketrecbe, ellenőrzött környezeti körülmények között tartottuk (hőmérséklet 26 ± 0,5 ° C, 12/12-órás fény/sötét ciklus), és szabadon hozzáférhettek a takarmányhoz és a vízhez.

1 hetes akklimatizáció után az egyes törzsek egereit három csoportba helyeztük (10 LF-, 10 HF- és 10 HFI-táplált Sv129 egér; 7 LF-, 8 HF- és 9 HFI-táplált BL6 egér) és ezeket etettük különböző diéták 6 egymást követő héten keresztül. A testsúlyt hetente kétszer, a takarmányfelvételt pedig hetente regisztrálták. Valamennyi egeret naponta legalább kétszer megfigyelték a klinikai megjelenés bármilyen rendellenessége miatt. A kísérlet végén az egereket izofluránnal (Isoba-vet, Schering-Plough, Dánia) altattuk, és szívpunkcióval eutanizáltuk. A vonatkozó zsírszöveteket azonnal feldaraboltuk, lemértük, folyékony nitrogénben gyorsfagyasztottuk és -80 ° C-on tároltuk. Az állatkísérletet az Országos Élő Állatok Biológiai Kísérleteinek Nemzeti Testülete (Norvégia és Dánia) hagyta jóvá, és a jóváhagyott irányelveknek megfelelően hajtották végre.

DNS-kivonás

A befejezés előtt friss ürülékből vettünk mintát, és azonnal -80 ° C-on lefagyasztottuk. DNS-extrahálást végeztünk mintánként 200 mg székleten, a Macherey-Nagel Nucleospin Soil kit segítségével. Az extrakciókat a kit protokoll szerint hajtottuk végre, azzal az eltéréssel, hogy a sejtek lízisét úgy végeztük, hogy a mintákat két alkalommal 30 másodpercig vertük, a gyöngyverés között 2 percig jégen inkubáltuk. A kapott genomi DNS koncentrációkat nanodroppal mértük, a DNS integritását agaróz gélelektroforézissel vizsgáltuk. A metagenomikus szekvenálást HiSeq 2000 és 90 bp PE stratégia alkalmazásával végeztük [24].

De novo összeállítás és génjóslás

Az adapterek eltávolítása után a gazdagéphez tartozó rossz minőségű olvasmányokat és olvasmányokat eltávolítottuk, 46,100,196 ± 977,672 (átlag ± perc) jó minőségű olvasmányokat kaptunk. Ezeket a magas színvonalú leolvasásokat az 54 mintából azután a SOAPdenovo (v1.06) alkalmazásával összegyűjtötték a MetaHIT génkatalógusban használt paraméterekkel [24]. Mindegyik minta esetében 53 226 ± 2 097 (átlag ± sz.a.) folytonosságot kaptunk 102 946 516 ± 2 678 730 bp hosszúsággal (átlag ± sz.h.). A GeneMarkot (v2.7) alkalmaztuk a nyílt olvasási keretek (ORF) előrejelzésére.

Bélmetagenóm referencia felépítése

Az egér bél mikrobiota metagenomikus információinak feltárásához először a jelen tanulmányban kapott minták alapján készítettünk egy metagenomikus katalógust. Az 54 mintából jósolt összes ORF-et egyesítettük és egymáshoz igazítottuk a BLAT alkalmazásával. A 95% -nál nagyobb azonosságú (hézagot nem engedélyező) és a rövidebb leolvasások több mint 90% -át lefedő leolvasott génpárokat csoportosítottuk. Minden csoport leghosszabb ORF-jét használtuk a csoport képviseletére, és a csoport többi ORF-jét redundáns szekvenciának tekintettük. A 100 bp-nél rövidebb ORF-eket ezt követően kiszűrtük. Végül összeállítottak egy 793 847 nem redundáns gént tartalmazó génkatalógust, amely lefedte az egyes minták kiváló minőségű olvasmányainak 77,4 ± 0,3% -át (átlag ± s.e.m.).

Ezen referencia génkészlet alapján taxonómiai hozzárendelést és funkcionális annotációt hajtottunk végre az NR adatbázis (v3) és a KEGG adatbázis (59.0 kiadás) felhasználásával. Ebben a tanulmányban a katalógusban szereplő gének 80% -át robusztusan be lehet sorolni az NR adatbázisba, a fennmaradó gének valószínűleg jelenleg még nem meghatározott mikrobiális fajokból származnak. Funkcionális szinten 4846 KEGG ortológust (KO) azonosítottunk, amelyek a katalógusban található gének 46,43% -át lefedik.

Rendszertani hozzárendelés és funkcionális osztályozás

Az előre jelzett gének nukleotidszekvenciáit az NCBI Genetic Codes 11. kód segítségével fehérjeszekvenciákká alakították át. A BLASTp-t alkalmazták a jósolt gének taxonómiai hozzárendelésének és funkcionális osztályozásának elvégzésére az NR adatbázis (v3) és a KEGG adatbázis (59.0 kiadás) alapján. E érték ≤1 × 10 −3. Az összes gént az IMG (v3.4) alapján kerestük a BALSTN segítségével alapértelmezett paraméterek alkalmazásával, kivéve, hogy a E értékét 1 × 10 −5 értékre állítottuk. Egy gén taxonómiai társítását az összes taxonómiai annotációs eredmény közül a legalacsonyabb közös ős döntött. A KEGG által annotált géneket a KEGG útvonalakhoz rendeltük. Összesen 4846 KO-t azonosítottunk a referencia génkészletben, 80,0, illetve 46,4% gént tartalmazó referencia génkészlettel, amelyek taxonómiai és funkcionális információkkal rendelkeznek.

A gének és a KO-k relatív bősége

Az egyes minták kiváló minőségű, tiszta, párosított leolvasásait összehangoltuk a referencia génekkel SOAP2 90% -nál nagyobb azonosságot igénylő kritérium alkalmazása. Csak a következő kritériumoknak megfelelő olvasások számát számoltuk össze: (i) A páros végű olvasmányok mérsékelt inszertumméretű génszekvenciára voltak feltérképezhetők; (ii) Az egyik páros végű leolvasást fel lehet térképezni a génszekvencia végére, míg a másikat a gén régión kívülre. Mindkét helyzetben a leképezett párosított végű olvasmányokat egy példánynak számítottuk. Egy bizonyos génre leképezett leolvasások számát a gén hossza normalizálta. Ezt követően a relatív bőség táblázatot úgy állítottuk össze, hogy a minta összes génjének összegét 1-re normalizáltuk. (1), \ (_i \) kijelöli egy bizonyos génre leképezett olvasások számát, és L én a gén hossza, akkor a gén relatív bősége \ (_i \) megegyezik

ahol \ (j \) végigfut a teljes referencia génkészleten.

Az összes mintát ugyanúgy kezeltük, így egy táblázatot kaptunk, amely tartalmazza az összes minta összes génjének relatív bőségét. A KO-profilt az ugyanazon KO-hoz igazodó gének relatív rengetegének összegzésével származtatták. Mivel ugyanaz a gén egynél több KO csoportba tartozhat, e gének relatív bőségét belefoglaltuk a KO összes.

A biodiverzitás elemzése

A Shannon-indexet és a Sørensen-Dice hasonlósági indexet az 54 minta relatív bőségtáblázata alapján számoltuk.

Statisztikai analízis

Minden statisztikai elemzést az R szoftver hajtott végre. A fő koordináták elemzését (PCoA) az „ade4” csomag segítségével hajtották végre [46]. A közös és ritka gének/fajok/KO-k relatív jelentőségének kiegyenlítése érdekében a PCA előtt négyzetgyök transzformációt hajtottak végre. Az összehasonlító elemzéshez Wilcoxon rang-összeg tesztet alkalmaztunk. A kísérleti csoportok közötti különbség-összehasonlítás elvégzéséhez páronkénti Wilcoxon rang-összeg tesztet alkalmaztunk, amelyben a Hommel-módszert alkalmazták a többszörös összehasonlítás problémájának ellensúlyozására [47].

A funkcionális elemzésben alkalmazott hatásméret meghatározását az Eq. (2), ahol \ (> _i \) a \ (i \) kísérleti csoport átlagos függvénydússága. Két jellemző közötti korreláció mérésére Pearson-korrelációs együtthatót használtunk. A szignifikancia szintet 0,05-re állítottuk.