A stroke hosszan tartó változásokat vált ki az egerek lipidanyagcseréjében, a máj és a test összetételében

Absztrakt

Bevezetés

A stroke a hosszú távú fogyatékosság vezető oka az Egyesült Királyságban, elsősorban az iszkémiás agykárosodás szenzomotoros rendszerre gyakorolt pusztító hatása miatt. A betegek azonban más szövődményeket is kialakítanak, amelyek negatívan befolyásolják a gyógyulást és csökkentik életminőségüket. A stroke utáni napokban, hetekben és hónapokban a betegek fokozottan fertőződnek és komplikációk alakulnak ki, mint például a testtömeg és az étvágy megváltozása, depresszió, fáradtság, szorongás és/vagy kognitív károsodás [1,2,3,4]. A stroke-os betegeknél a jövőbeni vaszkuláris események kockázata is fokozott [5, 6]. A stroke utáni szövődmények mögöttes mechanizmusokról nagyon keveset tudunk, de az anyagcsere és az energiaegyensúly hosszan tartó változásai valószínűleg kulcsfontosságúak [7].

Az anyagcserét befolyásoló állapotok, például az elhízás és a cukorbetegség, növelik a stroke kockázatát, és így gyakori társbetegségek a stroke-ban szenvedő betegeknél [21,22,23,24]. Ezek az állapotok befolyásolhatják a stroke utáni gyógyulást is, például az elhízás rontja az akut kísérleti stroke eredményét [25,26,27,28]. A klinikai vizsgálatokkal ellentétben, amelyek több hónapon keresztül figyelik a betegek gyógyulását, ezeknek a kísérő állatokban végzett tanulmányainak többsége akut időpontokra összpontosított (pl. 24–72 óra). Valójában egyes klinikai vizsgálatok szerint az elhízás valóban előnyös lehet a stroke helyreállításában, az úgynevezett elhízási paradoxonban, amely csökkent elhulláshoz vezet az elhízott betegeknél [14, 29]. Az epidemiológiai megfigyelések egyik javasolt biológiai magyarázata az, hogy az elhízásban a felesleges energiakészletek megvédik a stroke utáni súlyvesztést [30], megakadályozva ezzel az alultápláltság káros hatásait a stroke utáni helyreállításra. Azt azonban, hogy az elhízás befolyásolja-e a súlycsökkenést, a lipidek és az adipokin felszabadulását, valamint a neurológiai gyógyulást és a viselkedést a kísérleti stroke után hosszú távon, rosszul értjük.

A tanulmány célja az volt, hogy (i) megállapítsa a kísérleti stroke depressziós és szorongásszerű viselkedésre gyakorolt hatását; hosszú távú másodlagos szövődmények, amelyekről a stroke-ban szenvedő betegek gyakran beszámoltak, és (ii) értékelik, hogy a stroke okozta elhúzódó változások vannak-e a súlycsökkenésben, valamint az adipokin és a lipid állapotban. Ezenkívül meghatároztuk az elhízás hatását ezekre az eredményekre.

Mód

Állatok

Minden vizsgálatban hím C57BL/6J egereket (Envigo, Egyesült Királyság) használtunk. Valamennyi állatot egyedileg szellőztetett ketrecekben helyeztük el normál tartási körülmények között (hőmérséklet 21 ± 2 ° C; páratartalom 55% ± 5%; 12 órás fény/12 órás sötét ciklus), az élelemhez és a vízhez szabad hozzáféréssel. 8 hetes korban az egerek ketreceit véletlenszerűen (a Microsoft Excel 'rand ()' funkciójának felhasználásával) rendelték hozzá magas zsírtartalmú étrendhez (elhízottnak nevezték; 60% zsírtartalmú energia, 58G9, Test Diets®, az IPS szállította). Product Supplies Ltd., Egyesült Királyság) vagy alacsony zsírtartalmú étrend (nevezett kontroll: 12% zsírtartalmú energia, 58G7, Test Diets®, IPS Product Supplies Ltd., Egyesült Királyság) 26 hétig a műtét előtt [25]. Valamennyi kísérletet az Egyesült Királyság Állatainak (Tudományos Eljárások) 1986. évi törvényével összhangban hajtották végre, amelyet az Egyesült Királyságbeli Manchesteri Egyetem, az Állatvédelmi és Etikai Felülvizsgálati Testület hagyott jóvá. Az állatkísérletekről szóló összes jelentés megfelelt az ARRIVE irányelveinek (Animal Research: Reporting in In Vivo Experiments) [31].

Átmeneti középagyi artéria elzáródás

Mivel az állatok humánus végpontokat értek el az állatok szenvedése miatt [34], a műtétet követő 14 napon belül számos állatot eutanizáltak, amelyek egy részét mágneses rezonancia képalkotás (MRI) elvégzése előtt eutanizálták: 8 kontroll (ebből 3 nem volt MRI vizsgálat 2. nap), 5 elhízott egér (20 perc MCAO) és 4 elhízott egér (30 perc MCAO). A kontroll 30 perces és az elhízott 20 perces csoportokból egy-egy állatot kizártak a stroke hiánya miatt. Az áloperált állatoknál nem fordult elő halál vagy komplikáció. A végső számok a kontroll színlelései voltak n = 10, kontroll MCAO/stroke n = 10, elhízott ál n = 10 és elhízott MCAO/stroke (20 perc) n = 4, és részletesen leírják az ábrákban.

Az infarktus mennyiségének/ödémájának/agyi atrófiájának számszerűsítése

Az infarktus térfogatát és ödémáját az MCAO után 48 órával, az agy atrófiáját a műtét utáni 50. napon MRI-vel számszerűsítettük. Izoflurán érzéstelenítés alatt MRI felvételeket készítettünk egy 7T vízszintes furatú mágnessel (Agilent Technologies, Egyesült Királyság), amely egy felületi továbbító-vevő tekercs segítségével kapcsolódott egy BrukerAvance III konzolhoz (Bruker Biospin, Egyesült Királyság). Koronális kísérleti képeket készítettünk a helyes geometria meghatározásához és az agy lokalizálásához (több léptékű gradiens echo szekvencia segítségével). A T2-súlyozású TurboRARE nagy felbontású képeket a következő paraméterek alapján készítettük: mátrix = 256 × 256, szeletvastagság = 1 mm, szelvények közötti távolság = 1 mm, felbontás = 0,0156 cm/pixel, felvételi idő = 5 perc 51 s. Az infarktus térfogatát 48 órakor úgy számítottuk ki, hogy ImageJ-ben (NIH, USA) 8 szelet infarktusterületét mértük. Az ödémát az ipsilaterális és kontralaterális félteke térfogatának százalékos különbségeként számoltuk ki. Az 50. napon az atrófiát az ipsilaterális félteke térfogatának százalékos csökkenéseként számolták az kontralaterálishoz képest. Az atrófia, az infarktus térfogatának és az ödéma elemzését mind vakon végeztük a kísérleti csoportok számára, fájlnevek véletlenszerű kiválasztásával.

Viselkedési fenotipizálás

A depressziószerű viselkedést minden egérben értékeltük a fúrás és a fészeképítés tesztjeivel. Valamennyi teszt esetében a műtét előtt elvégeztek egy alapértéket (0. nap). A mozgásszervi aktivitást és a szorongás mértékét nyílt terepi teszt alkalmazásával értékeltük. A teszt során fehér zajt játszottak a hallási jelek minimalizálása érdekében, és minden tesztet (kivéve a fészeképítést) a fényfázis alatt hajtottak végre.

Beásó

A barázdaképességet minden egérben a 0., a 3., a 14. és a 30. napon értékeltük Deacon és mtsai. [35]. Röviden: 20 cm-es, 68 mm átmérőjű műanyag lefolyóból készült furatokat készítettünk, az egyik végük lezárt volt, a másik végén 2,5 cm-es gépcsavarokat illesztettek, hogy a barázdát 3 cm-rel emeljék le a ketrec padlójáról. Az egereket 30 percen át szokták megszokni az üreges arénában (egy üres ketrecben), majd 700 g kavicsot tartalmazó furatokat vezettek be és hagytak 1 órán át. 1 óra múlva az üregeket eltávolítottuk, és a megmaradt kavicsot lemértük a beásott százalékos arány kiszámításához.

Fészeképítés

A fészeképítési képességet minden egérben a 0., a 3., a 7., a 14. és a 30. napon értékeltük. Az egereket külön-külön 140 g faaprítékkal és 20 g selyemfészek-építőanyaggal helyeztük el egyenletesen a ketrecben, és az ételeket lemértük. Az egereket éjszakán át hagytuk, és a mélység meghatározásához felülről és oldalról készítettük a fészkeket, és az összes egeret visszatértük a házi ketrecekbe. A fészkeket Deacon standardizált skálája [36] alapján 0-tól 5-ig értékeltük. Az összes képet elvakítottuk és két független marker pontoztuk, kiszámoltuk az átlagos pontszámot, és tovább elemeztük. Kiszámították a sötét fázis során elfogyasztott élelmiszer mennyiségét (kCal) is.

Nyílt terep

A 37. napon az egereket egyenként helyezzük egy négyzet alakú, átlátszatlan perspex doboz közepére (45 cm × 30 cm × 45 cm), és viselkedésüket 5 percig rögzítjük. A készüléket 70% -os etanollal tisztítottuk az egerek között. A videofelvételeket a Stoelting ANY-maze v4.9 szoftverrel elemeztük, és a mozgás/aktivitás értékeléséhez mértük a mozgott teljes távolságot (m), átlagos sebességet (m/s), időtartamot (sec). A szorongás értékeléséhez megmértük az aréna oldalán töltött időt (sec), és kiszámítottuk az oldalaknál töltött idő% -át.

A testösszetétel elemzése

A testösszetételt (zsírszövet és sovány tömeg) magmágneses rezonancia képalkotással (EchoMRI, Echo Medical Systems, USA) értékeltük a 0., 1., 3., 5., 7., 10., 14., 21., 42. és 49. napon. állatok szkennelése előtt vették. A teljes testtömeg, valamint a zsír- és sovány tömeg nettó veszteségét (g) a 0. naptól (a stroke előtt) és a görbe alatti területtől (g × nap) számítottuk ki minden időponthoz.

Szövetkészítés és szövettan

Adipokin elemzés

A zsírszövetet (fagyott epididimális zsírból) pufferben (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2 és 0,02% NaN3) homogenizáltuk, amely 1% Triton-X-t és 1. proteázgátló koktélt tartalmaz (Calbiochem, Egyesült Királyság). Öt mikrolitert adunk milligramm szövetmintához (körülbelül 100 mg szövetet használunk). Ezután a mintákat T-10 Basic ULTRA-TURRAX homogenizátorral (IKA, USA) homogenizáltuk, jégen rövid ideig szonikáltuk egy kézi szondás szonikátorral (IKA), és 30 percig jégen hagytuk. A mintákat 14 000-nél centrifugáltukg 30 percig (4 ° C). A felülúszót dekantáltuk és -20 ° C-on tároltuk. A zsírszövet felülúszójában és a plazmában lévő rezisztint, adiponektint és leptint enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA; R&D Systems, Egyesült Királyság) elemeztük a gyártó utasításainak megfelelően. Az adipokin koncentrációkat a vonatkozó standard görbék alapján határoztuk meg. A zsírszövet esetében a fehérje koncentrációt bicinchoninic protein assay-vel (BCA; Pierce Biotechnology, USA) értékelték, és az eredményeket pg vagy ng/mg fehérjében fejezték ki. A plazma esetében az adatokat μg vagy ng/ml/g zsírtömegben fejezzük ki.

Lipid-analízis és ALT-vizsgálat

A szabad zsírsavak (FFA-k; Zen-Bio Inc., USA) és a trigliceridek (BioVision Inc., USA) plazmaszintjét (mmol/l-ben) mértük a relatív vizsgálatokkal, a gyártó utasításainak megfelelően. Az alanin-aminotranszferáz (ALT) szintjét a plazmában kolorimetriás aktivitás vizsgálati készlet segítségével mértük (Cayman Chemical, USA).

Adatok és statisztikai elemzések

Eredmények

Az ugyanolyan infarktusos mennyiségű elhízott egerek nem mutattak különbséget az akut kimenetelben

Bár az elhízás az iszkémiás stroke megalapozott kockázati tényezője, vitatottabb, hogy az elhízás rontja-e a betegek kimenetelét. Korábban kimutattuk, hogy 30 perces elzáródási idő esetén az elhízás (amelyet a magas zsírtartalmú táplálás indukál) növeli az iszkémiás károsodást egereken végzett kísérleti stroke után [25], és itt az MCA 30 perces elzáródása szintén súlyos iszkémiás károsodást okozott, és minden egerek (n = 4) a 2. napon kellett megsemmisíteni. A klinikai helyzet jobb modellezéséhez és a csoportok közötti infarktus térfogatbeli különbségeinek zavaró hatásának elkerülése érdekében az MCA-t 20 percig elzárták elhízott egerekben, szemben a kontroll egerek 30 percével. Az ál műtét nem volt hatással a túlélésre egyik étrendcsoportban sem. Nem volt szignifikáns különbség a túlélésben a 30 perces elzáródást szenvedő kontroll egerek és a 20 perces elzáródást szenvedő elhízott egerek között (1a. Ábra). Nem volt szignifikáns különbség az infarktus térfogatában vagy a stroke által kiváltott ödémában a csoportok között, az MRI-vel mérve a 2. napon, sem az összes egérben, beleértve az elhullottakat sem, vagy csak a túlélőkben (1b. Ábra, c).

Az MRI képalkotás a 2. napon (1d. Ábra) mind a striatumban, mind a kéregben nagy infarktusokat mutatott, és egyes esetekben a hippocampusba és a thalamusba is kiterjedt. Az 50. napon az MRI hiperintenzitású területei főleg a külső kérgi régiókban voltak jelen. A szövettani vizsgálat során ezek a régiók agyi gerincvelőfolyadékkal (CSF) töltött üregek voltak, amelyek nem tartalmaztak agyszövetet. A kamrai megnagyobbodást és az ipsilaterális agyfélteke atrófiáját szintén megfigyelték mind a kontroll, mind az elhízott simogatott állatokban, szignifikáns különbség nincs a csoportok közötti atrófiában (1e. Ábra).

A szenzormotoros funkciót hosszirányban értékeltük neuroscore segítségével. A hiányokat mindkét csoportban a stroke után 51 napig figyelték meg az ál állatokhoz képest (1f. Ábra). A nap jelentős hatása (o \ (_1 ^ 2 \) = 7,076, o \ (_1 ^ 2 \) = 5,094, o \ (_1 ^ 2 \) = 4,563, o \ (_1 ^ 2 \) = 5,011, o \ (_3 ^ 2 \) = 13,284, o 2. ábra

Annak megállapítására, hogy a mozgás vagy a szorongás-szerű viselkedés megváltozott-e, a 37. napon nyílt terepen végzett elemzést végeztek. A diéta vagy a stroke hatása a teljes megtett távolságra, az átlagos sebességre vagy az időbeli mozgásra nem volt kimutatható (3a – c. Ábra) . A diéta és a stroke jelentős fő hatását figyelték meg a szorongás mértékén (az aréna oldalain töltött idő), a stroke fokozta a szorongást (3d. Ábra). A diéta és a stroke között semmilyen interakciós hatást nem figyeltek meg az értékelt paraméterek tekintetében. A munkamemória értékeléséhez az Y-labirintus tesztet a 14. és a 45. napon hajtották végre. A kontroll vagy elhízott egereknél a stroke után nem észleltek memóriazavart a színlelt adatokhoz képest (S1. Ábra).

Nagyobb és elhúzódó zsírszövet veszteség elhízott egerekben stroke után

A műtét előtt (MCAO vagy színlelt) a magas zsírtartalmú étrenddel táplált egereknél a testtömeg és a testzsír százalékos aránya nagyobb volt, de a sovány tömeg csökkent (1. táblázat), összehasonlítva a kontroll étrendet fogyasztó egerekkel. Kísérleti stroke után mind a kontroll, mind az elhízott egerek elhúzódó testtömeg-csökkenést mutattak az álműtött egerekhez képest (4a., D. Ábra, 1. táblázat). A testsúlycsökkenés azonban lényegesen nagyobb volt elhízott egereknél. Mindkét csoportban a stroke utáni súlycsökkenés elsősorban a zsírszövet tömegének csökkenésének volt köszönhető, az elhízott egereknél lényegesen több zsírszövet vesztett (4b, e ábra). Összehasonlításképpen, a sovány tömeg csak átmenetileg csökkent mindkét stroke-csoportban, és a veszteség mértéke hasonló volt a kontroll és az elhízott egerek között (4c. Ábra, f). Az infarktus térfogata egyik csoportban sem korrelált a fogyással (4g. Ábra). A 14. napon, amikor a súlycsökkenés a szélütés után legalacsonyabbra ért, az egyik napról a másikra táplálékfelvétel szignifikánsan nagyobb volt a kiindulási értékhez képest (0. nap) mind a kontrolltáplált ál-, mind agyvérzéses egerekben, de elhízott egereknél nem tapasztaltunk különbséget a 0. és 14. nap között ( Ábra: 4h).

A stroke hosszan tartó változást vált ki az adipokintermelésben

Kontroll étrendet fogyasztó egereknél a stroke a stroke utáni 60. napon jelentős változásokat váltott ki az adipokintermelésben (5. ábra). A rezisztin koncentrációja szignifikánsan megemelkedett a stroke után a zsírszövetben (5a. Ábra) és a plazmában (5b. Ábra), és az adiponektin koncentrációja megnőtt a plazmában (5c. Ábra). A leptin koncentrációit a stroke nem befolyásolta (5c. Ábra, f). Az adipokin válasza a stroke-ra hasonló volt elhízott egereknél, bár némi differenciális hatást figyeltek meg. Például a stroke nem váltott ki elhízott egereknél a rezisztin jelentős növekedését a zsírszövetben. Nem volt szignifikáns összefüggés a súlycsökkenés mértéke és a plazma adipokin szint között a stroke után kontroll vagy elhízott egerekben (adiponectin; kontroll r 2 = 0,09, elhízott r 2 = 0,32: rezisztin; ellenőrzés r 2 = 0,19, elhízott r 2 = 0,29: leptin; ellenőrzés r 2 = 0,0002, elhízott r 2 = 0,35). Az elhízás önmagában (stroke hiányában) szintén befolyásolta az adipokintermelést. Az ál-operált elhízott egereknél csökkent a rezisztin és az adiponektin koncentrációja a zsírszövetben és a plazmában, és a leptin koncentrációja megnőtt a zsírszövetben.

A stroke a plazma lipidek és a máj működésének hosszan tartó változását váltja ki

A kontroll étrendet fogyasztó egereknél a stroke után 60 nappal jelentősen megnőtt a plazma szabad zsírsavak és trigliceridek száma (6a. Ábra, b). Ezt a hatást elhízott egereknél nem tapasztalták, bár a színlelt műtétű elhízott egerek plazma triglicerid koncentrációja magasabb volt. A kontroll vagy elhízott egerekben a stroke-ra adott válaszként nem volt szignifikáns összefüggés a fogyás és a plazma szabad zsírsavak között (kontroll r 2 = 0,00002, elhízott r 2 = 0,26) vagy trigliceridek (kontroll r 2 = 0,05, elhízott r 2 = 0,19).

Korábban 24 órával a stroke után egereknél beszámoltak a máj trigliceridjeinek emelkedéséről [18]. A májat ezért a 60. napon vettük fel, és szövettanilag értékeltük. Máj steatózist figyeltek meg ál-operált elhízott egereknél, bár ez a hatás elhízott, kísérleti stroke-on átesett egereknél (6c, e ábra). A stroke-nak nem volt hatása a máj steatosisra a kontrolltáplált egerekben. A májsejtek sérülését pontozási rendszerrel is mértük, a sérült hepatocitákat a citoplazma részleges vagy teljes elvesztésével, valamint a kondenzált vagy duzzadt magokkal azonosították (6d., E. Ábra). A stroke jelentős hepatocita károsodást váltott ki a kontroll étrenddel etetett egerekben, bár a májműtött elhízott egereknél már jelentős hepatocita károsodást figyeltek meg, és így a stroke a kövér egerek hepatocyta károsodását nem növelte tovább. Az ALT-t a májfunkció indikátoraként mértük, és a stroke után mind a kontroll, mind az elhízott egereknél alacsonyabb volt, mint a színlelt csoportoké (6f. Ábra).

Vita

Itt figyeltük meg a stroke hosszú távú metabolikus és viselkedési hatásait, valamint az együttes morbiditású elhízás hatásait, és kontroll hím egerekben olyan tartós változásokat mutattunk ki, amelyek a jövő érrendszeri egészségének kockázatát jelezhetik.

Összefoglalva, a stroke-os betegeknél a stroke utáni hetekben és hónapokban általában másodlagos szövődmények jelentkeznek, amelyek negatívan befolyásolják gyógyulásukat és életminőségüket. Ezeket a szövődményeket azonban klinikailag nem vizsgálták megfelelően, és mechanizmusaikat nemigen értik. Itt új viselkedési eszközöket azonosítottunk a stroke másodlagos szövődményeinek, például a depresszió értékeléséhez. Mi is elsőként figyeltük meg a stroke hosszú távú hatásait az anyagcsere markerekre. Adataink kimutatták, hogy mind az elhízott, mind a kontroll egerekben a sovány tömeg csak átmenetileg csökken a stroke után, míg a zsírtömegre hosszú távú hatást figyeltünk meg. A kontroll egerek zsírtömegének csökkenését az adipokinek és a lipidek változása, valamint a máj működésében bekövetkező lehetséges változások kísérte. A jövőbeni munkának meg kell határoznia, hogy a hím egerekben ezeket a megállapításokat a nőknél is látják-e, és hogy ezek hogyan fordulnak át agyvérzésben szenvedő betegekre. Ezek az adatok azonban arra utalnak, hogy a stroke tartós hatást gyakorol az anyagcserére, ami hozzájárulhat a stroke-ban szenvedő betegeknél a visszatérő vaszkuláris események fokozott kockázatához.

Hivatkozások

Nakling AE, Aarsland D, Næss H, Wollschlaeger D, Fladby T, Hofstad H és mtsai. Kognitív deficit krónikus stroke-ban szenvedő betegeknél: neuropszichológiai értékelés, depresszió és önjelentések. Dement Geriatr Cogn Dis Extra. 2017; 7: 283–96.

Shi K, Wood K, Shi F-D, Wang X, Liu Q. Stroke okozta immunszuppresszió és posztstroke fertőzés. Stroke Vasc Neurol. 2018; 3: 34–41.