A szérum NTCT SIRT1 aránya a korai osteoarthritist és a chondrosenescenciát tükrözi

Korábban kimutattuk, hogy a SIRT1 az oszteoartritisz (OA) alatt és gyulladásos körülmények között hasítható a porcban. Ismert, hogy a szérumokban különféle betegségekben is kimutatható, amint azt a kézirat szövegének Vita szakaszában részletezzük.

Mit ad hozzá ez a tanulmány?

Ez a tanulmány új módszert ad a Sirt1 hasított variánsainak kimutatására a szérumokban. Megmutatjuk, hogy ezek a variánsok közvetlenül kapcsolódnak a porc degenerációjához, genetikai egérmodelljeinkkel, amelyek a porcból ablált Sirt1-t hordoznak. Ezek az egérmodellek (azaz porcból eltávolított Sirt1-vel), amelyek öregedésnek vagy poszttraumás OA-nak vannak kitéve, az OA fejlődése ellenére ezeknek a variánsoknak a szintjét csökkentik a szérumokban. Egy másik újdonság ezen hasított Sirt1 variánsok asszociációja a chondrosenesenciával, amiről korábban nem számoltak be. Valójában a kondroszenzáló sejtek eltávolítása csökkentette a Sirt1 variánsokat in vitro és in vivo.

Hogyan befolyásolhatja ez a klinikai gyakorlatot vagy a jövőbeli fejleményeket?

Az itt szereplő adatok klinikai tanulmányokat érdemelnek, hogy érvényesítsék ezt a szérumértéket az OA súlyosságának kategorizálására és rétegzésére, amely felgyorsíthatja a gyógyszerfejlesztést és a személyre szabott gyógyszert az OA-betegek számára. Fontos, hogy a kondroszenzenciával és a szenolitikus gyógyszeradagolással kapcsolatos rész azt jelzi, hogy ez a szérumméret megjósolhatja a szenolitikus gyógyszer hatékonyságát az OA-ban, ami minimalizálhatja a képalkotási módok szükségességét a gyógyszeradagolást követő közös szerkezeti változások értékeléséhez, hogy végül kifejlesszenek betegségre módosító OA gyógyszereket klinikai felhasználás.

Háttér

Az ízületi porc egy vékony hialinszövet, amely a szinoviális ízületek ellentétes csontvégeit takarja. Megakadályozza a csontvég erózióját a napi tevékenységek által okozott mechanikai terhelések elnyelésével, és biztosítja a súrlódásmentes és fájdalommentes ízületi artikulációt és mozgást. 1–3 Az embereknél a legelterjedtebb degeneratív ízületi betegség, az Osteoarthritis (OA) fokozatos romlása és az ízületi porc elvesztése. A klinikai tünetek általában csak akkor jelentkeznek, ha a porc már visszafordíthatatlanul megsemmisült. Ide tartoznak a fájdalom, a radiográfiai jellemzők és a kitett subchondralis csont ízületi effúziója

Az OA-hoz vezető porcpusztulás az ízület túlzott mechanikai stresszének és gyulladásos sérüléseknek köszönhető, amelyek elnyomják a kondrociták anabolikus aktivitását és katabolikus aktivitást idéznek elő. A chondrosenescenciát nemrégiben az OA patogenezisének fémjeleként rögzítették, megmutatva, hogy az öregedő sejtek az ízületi porc előnyös volt az OA megelőzésében.4 5 A chondrosenescence növekszik az életkor előrehaladtával, valamint a poszttraumás ízületi sértések során. Hozzájárul a fokozatos szövetvesztéshez, mivel az öregedéshez kapcsolódó szekréciós fenotípust (SASP) mutató chrocrocyták olyan proinflammatorikus citokineket bocsátanak ki, amelyek befolyásolhatják a nem öregedő szomszédos sejteket.

Manapság az OA kezelésében a fő kihívás olyan betegségmódosító gyógyszerek kifejlesztése, amelyek képesek megállítani a betegség előrehaladását, visszafordítani a szövetkárosodást, helyreállítani a struktúrát és enyhíteni a tüneteket. Egy másik nagy kihívás az olyan hatékony biomarkerek azonosítása, amelyek megfelelnek a National Institute of Health Osteoarthritis Biomarkers Network által megállapított „BIPED” biomarkerek osztályozási kritériumainak; beleértve a betegség terhe (B), a kivizsgáló (I), a prognosztikai (P), a beavatkozás hatékonysága (E) és a diagnosztika (D) biomarkereit. 8 9 Különösen, míg a diagnosztikai markerek segítenek meghatározni a betegség stádiumát, a prognosztikai markerek segítenek megjósolni a betegség progressziójának sebessége és súlyossága. 10 11 Az ilyen markerek fontosak lennének a jelölt gyógyszeres kezelések optimális időzítésének felmérésében és a képalkotó módszerek (azaz MRI vagy röntgen) igényének csökkentésében.

Az összesítő jelentések alátámasztják azt az elképzelést, hogy a SIRT1, a-nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) -függő enzim csendes információszabályozó 2-es típusú 1-es dezacetiláz, kritikus fontosságú a felnőttek porcának egészségének fenntartásában a kondrocita túlélés és az extracelluláris mátrix (ECM) homeosztázisának elősegítésével. aktivitást írtak le számos, az életkorral összefüggő betegségben, köztük az Alzheimer-kór13, valamint a cukorbetegség 2,14-es típusú metabolikus szindróma és elhízás, a 15 16 és a SIRT1 keringő szintje nemrégiben vonzó biomarkerekké vált ilyen állapotokban. 17–19. A SIRT1 proteolitikusan inaktiválódik az OA során.20 21 Ebben a vizsgálatban tehát olyan ELISA vizsgálatot dolgoztunk ki, amely megkülönbözteti a SIRT1 N-terminális polipeptidet (NT) az emberi és egér szérum SIRT1 C-terminális polipeptidjétől (CT). Ezt a vizsgálatot használtuk annak értékelésére, hogy a szérum NT/CT SIRT1 aránya megemelkedett-e mérsékelt OA-val rendelkező egerekben és emberekben, és ezért potenciális betegség-biomarkerként alkalmazható-e az ízületek romlásának korai, de tünetmentes szakaszában.

Anyagok és metódusok

Az online S1 kiegészítő az összes szakasz anyagát és módszerét tartalmazza.

Kiegészítő anyag

Eredmények

ELISA kifejlesztése a szérum NT/CT SIRT1 arányának mérésére

Csoportunk eleinte a katepszin B által végrehajtott CT-csonkolást írta le az emberi és egér SIRT1-ben, amely a SIRT1 strukturálatlan huroktartományához kötődik. Ezen adatok alapján elképzelhető, hogy az NT SIRT1 antitestek mind a 75SIRT1, mind az flSIRT1 detektálják, tekintettel arra, hogy mindkettő ép NT doménnel rendelkezik. 2012-ben Chalkiadaki és Guarente jelentése kimutatta, hogy a HFD a Sirt1 NT-doménjének hasítását eredményezte kaszpáz 1 révén, ami hasonló, 75 kDa intakt CT-vel rendelkező polipeptidet eredményezett a gyulladt zsírszövetben.25 Ennek érdekében itt célul tűztük ki a SIRT1 NT és CT doménjének felmérése az OA súlyosságának és a zsíranyagcseréhez kapcsolódó egyéb, NT-csonkolást okozó egyéb állapotok megkülönböztetéséhez.

Ennek megfelelően feltételeztük, hogy OA-ban a degenerált porc hozzájárul az NT SIRT1 szintjének növekedéséhez a szérumban. Ez a vizsgálat vagy az intakt SIRT1 és/vagy SIRT1 polipeptideket képes mérni, amelyek CT-t (aa 700-747) vagy NT-t (aa 1-131) hordoznak, amint azt az 1A, B ábra táblázata és az előre jelzett vizsgálati eredmények szemléltetik. az 1C. ábrán. Nevezetesen, az 1 arány az NT és a CT SIRT1 polipeptidek azonos koncentrációját jelzi, amelyek nem feltétlenül felelnek meg a SIRT1 teljes molekulatömegének. Az ELISA assay-t validálták a reprodukálhatóságra a CV CV assay-vel, a specificitással a spike in assay-vel és a linearitással hígítás-visszanyerés révén (1. táblázat), és a Western blot megerősítette az antitestek képességét a teljes hosszúság felismerésére vagy a 75SIRT1 (online kiegészítő S2).

ELISA-vizsgálat N-terminális (NT)/C-terminális (CT) SIRT1 arányhoz. A hígított szérumot vagy kondicionált táptalajt NT-reaktív vagy CT-reaktív antitestekkel inkubáljuk, és a koncentrációkat a megfelelő standard görbe alapján számoljuk. A lemez konfiguráció hozzáadódik a standard görbe ábra (A) mellé. Minden szérummintát NT-reaktív vagy CT-reaktív antitesttel (B) inkubálunk, ahol az NT és a CT koncentráció közötti arány NT/CT SIRT1 arányt jelöl. (C) Az ehhez az ELISA-módszerhez kapcsolódó lehetséges forgatókönyvek: (1) egyenlő 1-es NT és CT-arány azt jelzi, hogy a vizsgált mintákban a SIRT1 egyik fehérje-doménje sem növekszik; (2) mind az NT, mind a CT domének hasítása észrevétlenné válik; (3) megnövekedett NT-koncentráció a CT-koncentrációhoz képest, amelynek értéke meghaladja az 1 értéket; (4) megnövekedett CT-koncentráció az NT-koncentrációhoz képest, amelynek értéke kisebb, mint 1. Megjegyzendő, hogy ezzel a módszerrel nem lehet megkülönböztetni a SIRT1 teljes hosszúságú és hasított variánsait, inkább a SIRT1 NT-reaktív vagy CT-reaktív polipeptidjeit.

ELISA validációs paraméterek

A szérum NT/CT SIRT1 aránya megemelkedik a PTOA-indukált és idős egerekben

Annak értékelésére, hogy a SIRT1 fragmenseket befolyásolja-e az OA, vad típusú (wt) egereken (CD1/129/J) DMM műtétet végeztünk poszt-traumás osteoarthritis kiváltására (PTOA, 2A, B ábra), és összehasonlítottuk a fiatalokat is (3 hónap) és öreg (15 hónapos) egerek (2D, E ábra). PTOA-val rendelkező egerekben mind a tibialis plató (TP), mind a femor condylusok (FC) szignifikáns növekedést mutattak az OA súlyosságában, mint a színlelt műtéten átesett egerek (2A, B ábra), súlyossága enyhe tartományban volt. Míg a szérum NT/CT SIRT1 arányában nem észleltünk különbséget a műtét után 2, 4 és 6 héttel, a DMM-mel kezelt egereknél a 8. héten szignifikáns, körülbelül kétszeres növekedést mértünk a kontrollokhoz képest (2C. Ábra, a kísérleti kísérlet illusztrációja alatt beállít). Az OA súlyossága és az egyes egerek NT/CT SIRT1 aránya közötti korreláció értékelése (2G ábra) magasabb korrelációs értékeket mutat a DMM-ben (felső panel) szemben a színlelt egerekkel (középső panel), jelezve, hogy a PTOA összefügg a megnövekedett NT/CT SIRT1 aránnyal.

A megnövekedett N-terminális (NT)/C-terminális (CT) SIRT1 arány mérsékelt osteoarthritis (OA) súlyosságban figyelhető meg vad típusú (WT) egerekben. A WT (hím és nőstény) Sirt1 3M egereket a medialis meniscus (DMM) destabilizálásának vagy ál-eljárásoknak vetették alá (lásd az Anyagok és módszerek szakasz, 1. kiegészítő szöveg), és a DMM után 4 és 8 héttel eutanizálták. Az ízületeket összegyűjtöttük és szövettanilag feldolgoztuk (Safranin O/Fast green festés), és Oon súlyossági sorrendbe soroltuk Glasson és mtsai 30 alapján, a sípcsont-fennsíkon (TP) vagy a combcsontban (FC). Az egyes idõpontok reprezentatív szakaszai az egyes OA rangsor diagramok alatt láthatók. (A) 4 hét: színlelt, n = 7; DMM, n = 6. (B) 8 hét: színlelt, n = 8; DMM, n = 10. (C) WT ál-és DMM-egerekből származó szérum közvetett ELISA-vizsgálata (az eljárás után 2, 4, 6 és 8 hetes időpontok, n = 7). A grafikon alatt a kísérleti felépítés sémája látható: (D) 3M és 15M WT (nőstény) Sirt1 egereket eutanizáltunk, az ízületeket összegyűjtöttük és szövettani feldolgozás céljából feldolgoztuk (Safranin O/Fast green festés), és Glasson alapján rangsoroltuk az OA súlyosságát. et al. 30 (E) Reprezentatív szakaszok minden egyes időpontra (n = 8). (F) 3M és 15M egerekből származó szérum közvetett ELISA-vizsgálata (n = 6). A grafikon alatt látható a kísérleti beállítás sémája. A statisztikai szignifikanciát csillag (*, p 2) és p érték jelzi.

Ezután megvizsgáltuk, hogy az életkor okozta OA okoz-e változásokat a szérum NT/CT SIRT1 arányában, összehasonlítva a 3M és a 15M egereket (2D, E ábra). Az eredmények az OA súlyosságának hozzávetőlegesen háromszoros növekedését mutatják a TP-ben és az FC-ben az öregedéskor (2D ábra), a szérum NT/CT SIRT1 arányának hozzávetőleg négyszeres növekedésével együtt (2F ábra, a kísérleti elrendezés panel illusztrációja alatt). Összefoglalva, a szérum NT/CT SIRT1 arányának növekedése tehát mind a korai stádiumú PTOA-val, mind az öregedéssel kapcsolatos OA-val összefüggésben van. A 2G ábra alsó panelje az OA súlyosságának szignifikáns korrelációját mutatja az NT/CT SIRT1 arányokkal az öregedő egerek kohorszában.

A szérum NT/CT SIRT1 aránya megemelkedik OA-ban szenvedő humán betegeknél

A 28 betegből álló kohorsz elemzése (3A. Ábra) korai OA-val rendelkező betegeknél a szérum NT/CT SIRT1 arányának növekedését mutatta az egészséges donorokhoz képest, főként a magasabb NT értékek miatt (NT SIRT1: p = 0,0003 non-OA vs. korai OA; NT/CT SIRT1: p = 0,019 nem OA vs korai OA). Érdekes módon az NT értékek nőnek az egészséges donorok és a késői OA közötti szinoviális folyadékban (SF; p = 0,018; 3B. Ábra). Az egyes szérum- és SF-változatok korrelációs adatai az NT-variánsok szorosabb összefüggését mutatják a szérumban és az SF-ben, szemben a CT-változatokkal (3C. Ábra, bal és középső panel). Ezenkívül a legerősebb korrelációt (p = 0,059) az NT/CT SIRT1 arány esetében figyelték meg a szérum és az SF értékelésénél, közvetett ELISA módszer alkalmazásával (3C. Ábra, jobb oldali panel). Ezek az adatok valószínűleg azt jelzik, hogy az NT-variánsok hatékonyan tudják elérni a keringést az OA korai szakaszában, míg a betegség késői szakaszában állandó termelésük hajlamos lehet felhalmozódni az SF-ben. Az eredmények együttesen alátámasztják azt a véleményt, hogy a szérum NT/CT SIRT1 aránya előre jelzi a korai OA-t, és a szinoviális folyadékból származhat.

A szérum SIRT1 variánsok porc eredetűek

Ezután 3,5 hónapos és 16,5 hónapos kontroll és mutáns egereket hasonlítottunk össze az életkorral összefüggő OA kialakulásához (5A. Ábra; a kísérleti összeállítás illusztrációja). Mindkét típusú egérnél öregedéskor térd OA alakult ki (5B, C ábra). OA súlyosságuk mértéke hasonló volt, kivéve az oldalsó rekeszt, amelyet a régi mutáns jobban érintett, mint a kontroll egereket (5D. Ábra). A szérum elemzése az NT/CT SIRT1 értékek várható növekedését mutatta régi kontroll egerekben, amelyet öreg mutáns egereknél nem figyeltek meg (5F. Ábra). Ez a növekedés a mutánsokban az NT variáns szignifikánsan alacsonyabb szintjének volt köszönhető, a CT variáns meglehetősen változatlan szintjének (5G ábra). Az 5H ábra magasabb korrelációs értékeket mutat be a 3,5 hónapos és 16,5 hónapos Sirt1 fl/fl egerekben (bal oldali panel), összehasonlítva az életkornak megfelelő ATC Cre Sirt1 fl/fl egerekkel (jobb oldali panel), amikor összehasonlítjuk az egyes NT/CT SIRT1 arányokat az OA súlyosságával. Így, hasonlóan a PTOA egérmodellhez, az öregedő egér modell azt mutatta, hogy az OA-val rendelkező egerek szérumában kimutatott emelkedett NT/CT SIRT1 fragmensek kondrocitákból származnak.

A szérum NT/CT SIRT1 aránya az öregedő sejtek helyi clearance-ét tükrözi

A poszttraumás ACLT által kiváltott osteoarthritis (OA) növeli a szérum SIRT1 N-terminális (NT)/C-terminális (CT) Sirt1 szérumot, amely intraartikuláris (IA) szenolitikus beadást követően csökkent. (A) a kísérleti felépítés vázlata; A 16 hónapos C57B6 egereket ACLT eljárásnak vetették alá, és az ACLT után 7 nappal az ABT263 5 egymást követő intraperitoneális injekciójával, majd minden második napon 6 IA injekcióval kezelték a műtét utáni 28 napos áldozatig. (B) A-ból Safranin O/Fast green-rel festett ízületek reprezentatív képei (n = 4 minden csoportnál, × 10-es nagyítás). (C) Az NT/CT SIRT1 arányt az indirekt ELISA módszer alapján állapítottuk meg az A. egerek szérumára. (D) Az A (n = 4) egerek NT vagy CT egyedi szintjei a színlelt egerekre normalizálódtak. (E) Immunhisztokémia az NT-SIRT1-hez ACLT-szenolitikusan kezelt egereknél (n = 3), ACLT-vivőanyaggal kezelt egereknél (n = 3) és ál-egereknél (n = 4). (F) A SIRT1-pozitív sejtmagok mennyiségi meghatározása a teljes sejtszámból mezőnként, immunhisztokémiai szakaszokban.

A porcszöveti metszetek immunhisztokémiája az NT-SIRT1 festés kétszeres csökkenését mutatta hordozóval kezelt ACTL-ben az ál-egerekhez képest (6E, F ábra). A senolitikus clearance a sejt NT-SIRT1 szintjének növekedését eredményezte a hordozóval összehasonlítva, hasonló tendenciához, mint a fiatalabb egereknél (3,5 hónap; online kiegészítő S7A). Az öregedés és a Sirt1 közötti kapcsolat további értékeléséhez megvizsgáltuk az ATC Cre Sirt1 fl/fl és Sirt1 fl/fl utáni DMM-et (online kiegészítő S7B, C). Az eredmények azt mutatják, hogy a DMM hozzájárult a p16 INK4a (online kiegészítő S7B) megjelenéséhez az ízületi kondrocitákban, szemben a színlelt kontrollokkal. Ha összehasonlítottuk a DMM utáni ízületi porcokat a Sirt1 fl/fl és az ATC Cre Sirt1 fl/fl között, kiderült, hogy a p16 INK4a pozitív kondrociták nagyobb mennyiségben voltak jelen az ATC Cre Sirt1 fl/fl egerekben (online kiegészítő S7B), támogatva azt a koncepciót, A SIRT1 más jelentésekkel összhangban elősegíti az öregedést.

A korábbi megfigyelésekkel összhangban az adatok alátámasztják, hogy a szérumban detektált NT SIRT1 variánsok sérült porcokból származnak, mivel azok szintje a szérumban emelkedett és egyidejűleg csökkent a porcban az ACLT alatt. Azonban a szenolitikus kezeléssel végzett ACLT csökkentette a szérum NT/CT SIRT1 arányát, és növelte a celluláris SIRT1 szintet az ízületi porcban. Az adatok alátámasztják, hogy a poszttraumás sértések kondroszenesenciát és csökkent kondenziták SIRT1 szintjét indokolják, valószínűleg a SASP vezikulákat felszabadító szeneszcens sejtekből származó helyi proinflammatorikus jelek miatt, amelyekről kimutatták, hogy gazdasejt proinflammatorikus mediátort, kemokint (interleukin (IL) 1α, IL6) tartalmaznak, CXCL-8), 33 34 amelyek szövetkárosodást váltanak ki.35 36 Bár jelentésünkben nem teszteltük az SASP vezikulák jelenlétét, úgy gondoljuk, hogy az SASP tartós kitettsége kiválthatja a nem öregedő sejtek apoptózisát, ami kevesebb SIRT1- pozitív sejtek az ízületi porcban. Ez megnövekedett NT/CT SIRT1 arányt eredményez a keringésben.

A kondrociták hosszú távú expozíciója proinflammatorikus citokinek hatására sejt apoptózis és oldható SIRT1 fragmensek szabadul fel.

Az OA-ban szenvedő betegek szérumában az NT/CT SIRT1 arány növekedéséhez vezető sejtdinamika további megértése érdekében emberi kondrocitákat tenyésztettünk, 2 vagy 8 napig stimuláltuk őket alfa tumor nekrózis faktor (TNFα) és interleukin 1β (IL1β) alkalmazásával. ), és kondicionált közegben értékelte a sejtek apoptózisát és az NT/CT SIRT1 arányát. A sejtek apoptózisának aránya négyszer nagyobb volt a 8. napon, mint a 2. napon, és ez az eredmény egybeesett az NT/CT SIRT1 arány háromszorosával (online kiegészítő S8A, B). A sejtlizátumok szignifikánsan magasabb 75SIRT1 szintet mutattak ki a citokinekkel 2 napig stimulált sejtekben, de a 8 napig kezelt sejtekben nem (online kiegészítő S8C). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a sejt apoptózisának megnövekedett aránya, amelyet a citokin inzultáció 8 napján észleltek, a 75SIRT1 felszabadulását eredményezte kondicionált táptalajra (online kiegészítő S8B).

Köszönetnyilvánítás

A szerzők elismerik Ron Shahart és Maitena Dumontot (Koreti Állatorvostudományi Iskola, Jeruzsálemi Héber Egyetem), akik segítséget nyújtottak a µCT szkennelt minták értékelésében, rekonstrukciójában és elemzésében. A szerzők köszönetet mondanak Christelle Sancheznek (University of Liege, Belgium), Anne-Christine Bay-Jensennek és Christian S. Thudiumnak (Nordic Bioscience, Dánia) az ELISA validálásban nyújtott segítségért és útmutatásért. A szerzők elismerik Prof. Meir Liebergall, az ortopéd sebészeti komplexum elnökének támogatását, Jeruzsálem, Hadassah Medical Center.