A szőrtelenítés által kiváltott bőr pigmentáció és az étrend által kiváltott fluoreszcencia hatása az in vivo fluoreszcencia képalkotásra

1 Molekuláris Képalkotó Központ, A Brown Alapítvány Molekuláris Orvostudományi Intézete, a Texasi Egyetem Egészségtudományi Központja, Houston, TX 77030, USA

kiváltott

Absztrakt

A közeli infravörös fluoreszcencia képalkotást (NIRFI) és a távoli vörös fluoreszcencia képalkotást (FRFI) alkalmazták a depiláció okozta bőr pigmentáció és az étrend által indukált háttér fluoreszcencia hatásainak vizsgálatára a C57BL6 egerek fluoreszcens jel amplitúdójára és nyirok összehúzódási gyakoriságára. A vörös-vörös fluoreszcens jel amplitúdóját, de nem a frekvenciáját, befolyásolta az étrend által kiváltott fluoreszcencia, amelyet eltávolítottak az egerek lucernamentes táplálékkal történő etetésével, és a bőr pigmentációja tovább befolyásolta az amplitúdómérést. A NIRFI minimális háttérfluoreszcenciát mutatott; a bőr pigmentációja azonban csökkentette a fluoreszcens jelváltozások amplitúdóját. Ezért ezeket a hatásokat figyelembe kell venni a különböző bőrpigmentációs állapotú és étrend által kiváltott háttérfluoreszcenciájú egerek képalkotásakor in vivo.

1. Bemutatkozás

A bőr pigmentációján kívül ismert, hogy a háttér fluoreszcencia korlátozza az in vivo fluoreszcencia képalkotást. Bebizonyosodott, hogy a normál állati étrenddel táplált egerek kb. 660 nm-es gerjesztő fény hatására erős étrend által kiváltott fluoreszcenciát mutatnak a gyomor-bél traktusban (GI) a hasi régióban, mivel a lucernából származó klorofill a gyakran használt laboratóriumi rágcsálókban. a diéták 665 és 750 nm között fluoreszkálnak [4]. Ezért az egereket lucernamentes táplálékkal etették a vörösvörös fluoreszcencia képalkotáshoz (FRFI) vörössugárzó fluoroforok, például Cy5.5 és Alexa-680, vagy fluoreszcens fehérjék alkalmazásával a nem kívánt háttérfluoreszcens jelek csökkentése érdekében [4, 5].

Nemrégiben mi és mások kifejlesztettük a fluoreszcens nyirokképalkotást vörös gerjesztő színezékekkel (pl. IRDye680) vagy közeli infravörös fluoroforokkal (pl. Indocianinzöld (ICG)) [6–12]. Az in vivo képalkotás alapján számszerűsítették a nyirokfunkció mérését, mint például a nyirokösszehúzódás gyakorisága és a fluoreszcens jel amplitúdója. Arról azonban még nem számoltak be, hogy ezeket a méréseket hogyan befolyásolják a lucernatartalmú állati étrend miatt bekövetkező változások a bőr színében és a háttér fluoreszcenciájában. Jelen munkánkban hosszanti irányban képalkotottuk és jellemeztük a dermális nyirokcsomókat többhullámú fluoreszcencia képalkotással Alexa-680-szarvasmarha szérumalbumin (BSA) és ICG keverékének injekciójával C57BL6 egerekben, amelyeket rendszeres vagy lucerna-mentes táplálékkal tápláltunk. reakció a bőr pigmentációjának kémiai szőrtelenítésből eredő változásaira.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Állatok

Hat-nyolc hetes C57BL6 nőstény nőstényeket (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) kórokozóktól mentes egeretelepen tartottunk a Houston-i Texasi Egyetem Egészségtudományi Központ Brown Institute of Molecular Medicine-ben ( UTHSC-H), amelyet a Szövetség a laboratóriumi állatgondozás értékeléséért és akkreditálásáért akkreditált. Az egereket rendszeres vagy lucernamentes táplálékkal etették (AIN-93G; OpenSource Diets, New Brunswick, NJ, USA). Minden állatkísérletet az intézményi állatgondozási és felhasználási bizottság jóváhagyása után hajtottak végre.

2.2. Fluoreszcencia képalkotás

Az egereket levágtuk, és szőrtelenítő szert (Nair, Church & Dwight Co., Inc.) használtunk a szőrmaradék eltávolítására 24 órával a fényképészeti képalkotás előtt, minden héten, 6 héten keresztül. A képalkotás során az állatokat izoflurán érzéstelenítés alá helyeztük és 37 ° C-os melegítőpárnán tartottuk. A fluoreszcencia képalkotást az 1. és a 3. héten végeztük. 10 ul térfogatú Alexa-680-BSA (25 µg) és ICG (2,5 µg) egy 31-es tűvel fecskendeztük a farok tövébe. Az injekció helyét fekete szalag borította, hogy megakadályozza a kamera túltelítettségét. A keverék injektálása után 5 percig, 5 percig NIR és távoli vörös fluoreszcens képeket készítettünk. Lézerdióda (500 mW, 785 nm az ICG gerjesztéshez; 500 mW, 660 nm az Alexa-680 gerjesztéshez) gerjesztési fényt adott, amely egyenletesen megvilágította az egér teljes testét. A visszaszórt és visszavert gerjesztési fény elutasításához egy holografikus bevágás-plusz sávos elutasító szűrő (785 nm és 660 nm középhullámhossz NIRFI és FRFI esetén, ill.) És sávszűrő (830 nm és 710 nm középhullámhossz NIRFI és FRFI, ill. .) az 50 mm-es lencse előtt helyezzük el. Ezért az újbóli kibocsátott fluoreszcens fényt egy elektron-sokszorozó töltéscsatolt eszköz (EMCCD) kamera detektálta (Photometrics).

2.3. Adatelemzés

Az adatokat ImageJ-vel (National Institute of Health, Bethesda, MD) elemeztük. A bőr pigmentációs szintjét átlag szürke értékként [3] mértük úgy, hogy sztereomikroszkóppal készített fényképeken az egerek bal oldalsó oldalán lévő internodális gyűjtő nyirokerek felett érdekes területeket (ROI) választottunk ki. A kontraktilis aktivitás feltárására azonos nagyságú fix ROI-kat választottunk ki az inguinalis nyirokcsomótól (ILN) az axilláris LN-hez (1,5 cm-re az ILN-től) csatlakozó fluoreszcens internodális nyirokerekben. A ROI-kat minden egérben ugyanazon a helyen választottuk ki. Az átlagos fluoreszcencia intenzitást minden egyes ROI-ban minden fluoreszcencia képen megkapjuk. A profilokat maximális intenzitásra normalizáltuk, és a képalkotási idő függvényében ábrázoltuk. Az „impulzusok” száma jelzi a nyirok összehúzódási aktivitását és az úgynevezett „összehúzódások”. Ezenkívül a gyomor régió feletti ROI-t választottuk ki az étrend okozta háttér-fluoreszcencia mérésére.

Az adatokat átlagértékek ± az átlag standard hibája (SEM) formájában adtuk meg. A statisztikai elemzést a GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.) alkalmazásával végeztük. Az adatok normalitását D’Agostino és Pearson Omnibus normalitás teszt segítségével teszteltük. A nem Gauss-féle elosztott adatokhoz az egyirányú ANOVA Friedman tesztjét Dunn többszörös összehasonlító tesztjével alkalmazták többszörös összehasonlításhoz, vagy Mann – Whitney vagy Wilcoxon teszteket alkalmaztak két párosítatlan vagy párosított csoport összehasonlításához. Ezen túlmenően két csoportot összehasonlítottak Student-szel t-párosított vagy párosítatlan paraméteres adatok tesztelése. A statisztikai jelentőség a

jelentős különbségnek tekinthető.

3. Eredmények

Az egereket hetente szőrtelenítették, és egy nappal később lefényképezték. Amint az 1. ábrán látható, a C57BL6 egerek az első szőrtelenítés után (1. hét) rózsaszínű bőrt mutattak az állat testének nagy részében, bár egyes területek pigmentáltak voltak (nyíl az 1. ábrán). A fényképészeti képek alapján végzett vizuális megfigyelés az egér bőrének fokozott pigmentációját mutatta a szőrtelenítés után 3 héttel, amikor a bőr pigmentációja a legnagyobb volt, és a kiindulási szintre való visszatérést a 4. héten végezték. Az ilyen ciklusos változások körülbelül 4 hétig tartanak, mielőtt a bőr pigmentációja újra elkezdődne. Nem figyeltük meg a bőr pigmentációjának időbeli változását az egész testen (1. ábra). A bőr pigmentációs szintjének mérésére használt átlagos szürke értékek, amint az az 1. b) ábrán látható, a 3. héten szignifikánsan csökkentek az 1. héthez képest (

), a vizuális megfigyeléssel egyetértésben.

; egyirányú ANOVA Friedman tesztje Dunn többszörös összehasonlító tesztjével). Az adatokat átlag ± SEM-ként mutatjuk be. Nyíl, pigmentált régiók az 1. héten.

Ezután intradermálisan két különböző képalkotó anyagot injektáltunk, külön gerjesztési/emissziós hullámhosszúsággal, először külön, majd ezek keverékével az egerek hátsó részének bőrébe, hogy megvizsgáljuk, vannak-e átfedő fluoreszcens emissziós jelek. Amint a 2. ábrán látható, mindegyik külön-külön injektált festék, valamint a keverék injekció helyén külön ICG és Alexa-680 fluoreszcenciát észleltünk egerekben a szőrtelenítés után az 1. héten.


Ezután képalkotó szerek keverékét fecskendeztük be a farok tövébe, és dinamikus fluoreszcens nyirokképalkotást végeztünk a bőr pigmentáció miatti fluoreszcens emissziós jelek csillapításának figyelemmel kísérésére. Valamennyi egér nyirokelvezetést mutatott a farok tövétől az ILN-ekig és végül az ALN-ekig az internodális gyűjtő nyirokereken keresztül. Csökkent fluoreszcens emissziót figyeltünk meg pigmentált egerekben (3. ábra; jel kalibrációs sáv). A lucerna nélküli étrenddel etetett egerek csoportjában az Alexa-680 fluoreszcencia képalkotással rendelkező egerek gyomor-bél traktusában (GIT) (hasi régió) nem vagy csak minimális hátteret figyeltünk meg, míg a rendszeres táplálékkal etetett egerek magas háttérfluoreszcenciát mutattak a GIT-ben (3. ábra és 1. táblázat). A NIRFI nem mutatott étrendhez kapcsolódó háttérfluoreszcenciát (1. táblázat).

egerek csoportonként. lucerna nélküli étrenddel etetett egerekhez képest. Pár nélküli hallgató t-tesztet végeztek.


) diéta a NIRFI (fehér) és az FRFI (fekete) után. Az adatokat átlag ± SEM-ként mutatjuk be. Páros és páros hallgató T-vizsgálatokat a (c) pontban végeztük. Mann – Whitney és Wilcoxon teszteket alkalmaztunk két párosítatlan, illetve párosított csoport összehasonlítására a (d) pontban. . . . NS, nem jelentős ().

4. Megbeszélés

Összegzésképpen elmondható, hogy az FRFI alkalmazásával elért diéta által kiváltott háttérfluoreszcencia szignifikánsan befolyásolja a fluoreszcens jel amplitúdójának nyirokmérését, a nyirokösszehúzódás gyakoriságát azonban nem, a rendszeres táplálékkal etetett egerekben az internodális gyűjtő nyirokerekben, és a bőr pigmentációja tovább befolyásolja az amplitúdót. Az egerek lucernamentes diétával történő etetése azonban eltávolítja a diéta okozta autofluoreszcenciát, és ezáltal javítja az amplitúdót. Bár a NIRFI nem mutat vagy minimális háttérfluoreszcenciát mutat egerekben, akár rendszeres, akár lucerna nélküli étrenden, a bőr pigmentációja befolyásolja a NIR fluoreszcens jelváltozásainak amplitúdóját. Ezért gondot kell fordítani a C57BL6 egerek longitudinális képalkotásának vizsgálatára, valamint a bőr pigmentációjának különböző státusú egerek csoportjainak képalkotására in vivo.

Összeférhetetlenség

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek összeférhetetlenségük.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát részben az Országos Egészségügyi Intézetek, R21 CA159193 (Sunkuk Kwon) és R01 CA128919 (Eva M. Sevick-Muraca) támogatták.

Hivatkozások

  1. K. S. Stenn és R. Paus: „A szőrtüszők kerékpározásának irányításai” Élettani vélemények, köt. 81. sz. 1, 449–494, 2001. Megtekintés: Google Scholar
  2. L. Alonso és E. Fuchs: „A hajciklus” Journal of Cell Science, köt. 119. sz. 3. rész, 3. rész, 391–393., 2006. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  3. A. Curtis, K. Calabro, J.-R. Galarneau, I. J. Bigio és T. Krucker: "A bőr pigmentációjának időbeli változásai a C57Bl/6 egerekben befolyásolják az optikai biolumineszcencia kvantitációt" Molekuláris képalkotás és biológia, köt. 13. sz. 6, 1114–1123, 2011. Megtekintés: Publisher Site | Google ösztöndíjas
  4. T. Troy, D. Jekic-McMullen, L. Sambucetti és B. Rice: „A fluoreszcens és biolumineszcens riporterek detektálási érzékenységének kvantitatív összehasonlítása állatmodellekben” Molekuláris képalkotás, köt. 3. szám 1, 2004. 9–23. Oldal. Megtekintés: Publisher Site | Google ösztöndíjas
  5. Y. Inoue, K. Izawa, S. Kiryu, A. Tojo és K. Ohtomo: „Élő egerek in vivo fluoreszcencia képalkotásával detektált étrend és hasi autofluoreszcencia” Molekuláris képalkotás, köt. 7. szám 1, 2008. 21–27. Oldal. Megtekintés: Publisher Site | Google ösztöndíjas
  6. S. Liao, G. Cheng, D. A. Conner és mtsai: „Az immunszuppresszióval járó károsodott nyirokösszehúzódás” Az Amerikai Egyesült Államok Nemzeti Tudományos Akadémiájának közleményei, köt. 108. sz. 46, 18784–18789, 2011. Megtekintés: Google Scholar
  7. S. Kwon és E. M. Sevick-Muraca: „A nyirok működésének nem invazív kvantitatív képalkotása egerekben” Nyirokkutatás és biológia, köt. 5. szám 4, 2007. 219–231. Oldal. Megtekintés: Publisher Site | Google ösztöndíjas
  8. S. Kwon és E. M. Sevick-Muraca: „Funkcionális nyiroképi képalkotás daganatos egerekben” Journal of Immunological Methods, köt. 360, nem. 1-2., 167–172., 2010. Megtekintés: Publisher Site | Google ösztöndíjas
  9. S. Kwon és E. M. Sevick-Muraca: „Egérfenotipizálás közeli infravörös fluoreszcencia nyirokképalkotással” Biomedical Optics Express, köt. 2. szám 6, 1403–1411, 2011. Megtekintés: Publisher Site | Google ösztöndíjas
  10. S. T. Proulx, P. Luciani, S. Derzsi et al., „A nyirokfunkció kvantitatív képalkotása liposzómás indocianinzölddel”, Rákkutatás, köt. 70. sz. 18., 7053–7062., 2010. Megtekintés: Publisher Site | Google ösztöndíjas
  11. S. T. Proulx, P. Luciani, A. Christiansen et al., „PEG-konjugált fényes, közel infravörös festék használata a daganat nyirokelvezetésének átirányításának funkcionális képalkotásához őrszem nyirokcsomó áttét után”. Bioanyagok, köt. 34. sz. 21, 5128–5137, 2013. Megtekintés: Publisher Site | Google ösztöndíjas
  12. M. Weiler, T. Kassis és J. B. Dixon: „A közeli infravörös funkcionális nyirokképalkotó kép érzékenységének elemzése” Biomedical Optics folyóirat, köt. 17. sz. 6. cikk, ID 066019, 2012. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  13. A. Slominski, J. Wortsman, P. M. Plonka, K. U. Schallreuter, R. Paus és D. J. Tobin: „A hajhagymák pigmentációja” Journal of Investigative Dermatology, köt. 124. sz. 1, 2005. 13–21. Megtekintés: Kiadói webhely | Google ösztöndíjas
  14. S. L. Jacques, „A biológiai szövetek optikai tulajdonságai: áttekintés” Fizika az orvostudományban és a biológiában, köt. 58. sz. 11, p. R37 – R61, 2013. Megtekintés: Publisher Site | Google ösztöndíjas
  15. D. K. Sardar, M. L. Mayo és R. D. Glickman: „A melanin optikai jellemzése” Biomedical Optics folyóirat, köt. 6. szám 4, 404–411., 2001. Megtekintés: Publisher Site | Google ösztöndíjas
  16. N. Kollias és A. Baqer: „Az emberi melanin spektroszkópiás jellemzői in vivo” Journal of Investigative Dermatology, köt. 85. sz. 1, 1985. 38–42. Oldal. Megtekintés: Publisher Site | Google ösztöndíjas
  17. SH. Tseng, P. Bargo, A. Durkin és N. Kollias: „Az emberi bőr kromofórkoncentrációi, abszorpciós és szóródási tulajdonságai in vivo” Optics Express, köt. 17. sz. 17, pp. 14599–14617, 2009. Megtekintés: Publisher Site | Google ösztöndíjas