Journal of Nuclear Medicine

Cristina Müller1,
Matthias Brühlmeier2,
P. August Schubiger1, 3 és
Roger Schibli1, 3

1 Radiofarmáciai Tudományos Központ, ETH-PSI-USZ, Paul Scherrer Intézet, Villigen, Svájc; 2 Nukleáris Orvostudományi Intézet, Aarau kantoni kórház, Aarau, Svájc; és 3 Vegyészeti és Alkalmazott Biotudományi Tanszék, ETH Zürich, Zürich, Svájc

Levelezésért vagy újranyomtatásért forduljon: Roger Schibli, PhD, Kémiai és Alkalmazott Biotudományok Tanszék, ETH Zürich, 8093 Zürich, Svájc. E-mail: roger.schiblipharma.ethz.ch

Absztrakt

Kulcsszavak

A folsav (FA) vagy az elterjedt redukált folsav hordozón keresztül, vagy a folát receptor (α-FR), egy nagy affinitású membránra lehorgonyzott fehérje (1) által elősegített endocitózis révén jut be az emlős sejtekbe. Az α-FR túlexpresszálódik sokféle emberi daganatban, beleértve a petefészek-, endometrium-, emlő-, tüdő-, vese- és vastagbéldaganatokat. Az α-FR overexpresszió legmagasabb gyakoriságát (> 90%) a petefészek karcinómákban találták (2,3). Az α-FR tumorral kapcsolatos expressziója az FA molekuláris „trójai falovaként” történő kiaknázásához vezetett diagnosztikai vagy citotoxikus szondák rákos sejtekbe történő specifikus szállításához (4–8). Ezért a megfelelő radionukliddal (például 99 m Tc-vel; 6 óra felezési idő, 140 keV γ-sugárzás) jelzett folát-származékok alkalmasak nagy érzékenységű specifikus és nem invazív tumor detektálására. A közelmúltban az I. és II. Fázisú klinikai vizsgálatokat egy radioaktívan jelzett folát-származékkal fejezték be az α-FR – pozitív vesesejt és petefészek karcinómák noninvazív detektálására (9,10). Ebben az összefüggésben csoportunk a közelmúltban publikálta az új fémorganikus, 99 m-es Tc-jelölt radiotracerek sorozatának preklinikai értékelését az α-FR – pozitív tumor célzáshoz (11,12).

A normál szövetben az α-FR csak néhány szervben expresszálódik, amelyek részt vesznek a vitamin visszatartásában és koncentrációjában, például a vesékben, a choroid plexusban, a tüdőben és a placentában. A folátok szűrése a vese glomerulusaiban és az elsődleges vizeletből történő újrafelszívódás a proximális tubulusokban az a-FR-n keresztül a radiofolátok nemkívánatos magas visszatartásához vezet a veseszövetben (9,12,13). A vesékben a radioaktivitás ezen magas felhalmozódása miatt a potenciális nephrotoxicitás miatt a részecskekibocsátó izotópokkal jelzett radiofolátokkal történő célzott tumoros terápia eddig nem volt elképzelhető.

Az alacsony molekulatömegű radiofarmakonok, például a radiofolátok sajátossága, hogy gyorsan eljutnak a véráramtól. Elvileg ez a tulajdonság azért kívánatos, mert rövid időn belül a nyomjelző beadása után magas daganat/háttér arány érhető el (9,13,14). Másrészt a vér medencéből való gyors eltávolítás szintén befolyásolja a nyomjelzők rendelkezésre állását, és ennek következtében alacsony tumor felhalmozódást eredményezhet. Valójában kiderült, hogy a tumor felvétele alacsony a különböző radioaktívan jelzett folát-származékok esetében (12, 14).

E tanulmányok elején azt javasoltuk, hogy az α-FR újraszabályozása vagy aktiválása neoplasztikus szövetekben fokozza a radioaktivitás felhalmozódását az α-FR – pozitív daganatokban, és ezáltal gyorsabbá tegye a tumor és a háttér arányát. A szakirodalomban közölt in vitro kísérletek alapján úgy döntöttünk, hogy a metotrexát (MTX), a raltitrexed (RTX) és a pemetrexed (PMX) antifolátokat alkalmazzuk e cél elérése érdekében (15,16). Az antifolátok gátolják a sejt purin és pirimidin szempontjából fontos folátfüggő enzimeket, valamint az aminosav anyagcserét. Feltételeztük, hogy a rákos sejtek reagálnak az antifolát kezelésre, és fokozzák az α-FR expresszióját vagy aktivációját, hogy megbirkózzanak az nélkülözhetetlen FA „virtuális” hiányával. Ennek közvetlen következménye, hogy ennek a válasznak a radioaktívan megjelölt folátjelző fokozott felhalmozódásához kell vezetnie a tumorszövetben.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Tábornok

(A) A 99m Tc-PAMA-folát radiotracer kémiai szerkezete (11). (B) Antifolátok, MTX, RTX és PMX kémiai szerkezete. (C) A redukált folát LV kémiai szerkezete.

Sejtkultúra

A KB-sejteket (humán nasopharyngealis carcinoma sejtvonal) folyamatosan monorétegekként tenyésztettük 37 ° C-on, 7,5% CO2-ot tartalmazó párásított atmoszférában. A sejteket 10% hő-inaktivált borjúmagzati szérummal (mint egyetlen folátforrás), 1-glutamin és antibiotikumok (penicillin 100 NE/ml, sztreptomicin 100 μg/ml és amfotericin B) kiegészítve FFRPMI táptalajon tenyésztettük. [Fungizone] 0,25 μg/ml-nél).

In vitro kísérletek

Az egyes kísérletek előtt 24 órával a sejteket 12 lyukú lemezek (8x105 sejt 2 ml/üreg) elültetésére használtuk, amelyek MTX, RTX és PMX antifolátumokat vagy redukált folát LV-t tartalmaztak különböző koncentrációkban (0, 0,1, 1,0 és 10,0 μmol/l). A sejteket ezután egy éjszakán át 37 ° C-on inkubáltuk, így összefolyó egyrétegek képződtek. Az antifolátumokat tartalmazó felülúszókat eltávolítottuk a mélyedésekből, és a sejt egyrétegeket kétszer öblítettük jéghideg PBS-sel (pH 7,4). Tiszta FFRPMI táptalajt (magzati borjúszérum, l-glutamin és antibiotikumok nélkül; 975 μL) adtunk minden egyes lyukhoz. A lemezeket 37 ° C-on 10 percig előinkubáltuk. 99m Tc-PAMA-folát (25 μl, 1 MBq/ml) oldatát adtuk hozzá, és a lemezeket 37 ° C-on inkubáltuk 1 órán át. Ezután a felülúszókat eltávolítottuk, és az egyrétegeket jéghideg PBS-sel mostuk. Az internalizált frakció meghatározása érdekében a sejtmintákat savas lesztató pufferrel (ecetsav vizes oldata 0,1 mol/l és NaCl 0,15 mol/l; pH 3) mossuk (17). Az a-FR blokád vizsgálatokat a korábban beszámoltak szerint, FA (100 μmol/l) hozzáadásával (12). Az egyrétegeket 1 N NaOH-ban (1 ml) lizáltuk és 4 ml-es csövekbe helyeztük, és y-számlálóval radioaktivitás-számlálást kaptunk (1. táblázat).

A Radiotracer 99m Tc-PAMA-folát in vitro sejtmegkötése és internalizálása (az összes hozzáadott radioaktivitás százaléka) MTX, RTX, PMX és LV előkezelt tenyésztett KB sejtekben *

In vivo kísérletek

SPECT képalkotó vizsgálatok

A képalkotó kísérleteket X-SPECT rendszer (Gamma Medica Inc.) alkalmazásával egyfejű SPECT és CT eszközzel végeztük 24 órával a 99m Tc-PAMA-folát (200 μL, 450–600 MBq) injektálása után. Az egereket ezután izoflurán: oxigén keverékkel altattuk. Az anesztézia mélységét a légzési gyakoriság mérésével figyeltük meg. A testhőmérsékletet rektális szondával szabályoztuk, és 37 ° C-on tartottuk fűtött légárammal. A beolvasási idő 30 és 60 perc között változott. A SPECT adatokat a LumaGEM szoftverrel szereltük fel és rekonstruáltuk (5.407 verzió; Gamma Medica). A CT-adatokat röntgensugaras CT-rendszerrel (Gamma Medica) gyűjtöttük, és rekonstruáltuk Cobra szoftverrel (4.5.1 verzió; Exxim-Computing Corporation). A SPECT adatok és a CT adatok egyesítését az IDL Virtual Machine (6.0 verzió; ITT Visual Information Solutions) szoftverrel végeztük.

EREDMÉNYEK

Az antifolátok és az LV in vitro hatása a 99m Tc-PAMA-folát sejtfelvételére

Az in vitro kísérletekhez a KB sejteket 24 órán keresztül az MTX, RTX és PMX antifolátok és a csökkent redukált folát LV koncentrációinak tettük ki, mielőtt hozzáadtuk a 99m Tc-PAMA-folátot. A 99m Tc-PAMA-folát sejtfelvétele nőtt az antifolátok növekvő dózisával (1. táblázat). A legmagasabb antifolát-koncentrációval (10 μmol/l) előinkubált sejtmintákban az összes hozzáadott radioaktivitás 65–80% -a volt specifikusan sejtekhez kötött; 25-35% -ot találtak sejthez kötve kezeletlen kontrollmintákban. A radiotracer internalizált frakciója szintén megnőtt az antifoláttal előkezelt sejtekben (19% –27% vs. 5% –10% a kontroll mintákban). Az LV-vel 0,1 és 1 μmol/L koncentrációban inkubált sejtmintákban a 99m Tc-PAMA-folát felvétele összehasonlítható volt a kontrollmintákéval; 10 μmol/L koncentrációnál a teljes sejthez kötött radioaktivitás és az internalizáció körülbelül 50% -os csökkenését tapasztalták (1. táblázat).

Az antifolátok és az LV in vivo hatása a 99m Tc-PAMA-folát biodisztribúciójára

Az ivóvízzel beadott antifolátum MTX hatása.

Biodisztribúciós adatok a Radiotracer 99m Tc-PAMA-foláthoz Athymic meztelen egerekben, amelyek KB sejt-xenograftokat hordoztak, és MTX-rel, RTX-mel és PMX-rel előinjekciózták 1 órával a radiotracer beadása előtt *

Radioaktivitás (% ID/g) a daganatban (A) és a vesékben (B), valamint a tumor és a vese aránya (C) az MTX, RTX és PMX előtti beadás időpontjának függvényében. (A részletes adatokat a kiegészítő anyag tartalmazza.)

A 99m Tc-PAMA-folát biológiai eloszlásának időfüggése az antifolátumok hatására.

Az intravénásan beadott LV hatása.

Az intravénásán beadott LV egy órával a radiotracer előtt a tumor szinte teljes blokádját és a vese 99m Tc-PAMA-folát felhalmozódását eredményezte (0,20 ± 0,04% ID/g tumor esetén [P 99m Tc-PAMA-folát érzéstelenített, daganatot hordozó) egerek dedikált kisállat SPECT/CT szkenner segítségével (3. ábra). Ekkor a radiotracer kitisztult a legtöbb szervből és szövetből, kivéve az α-FR-t expresszálókat. Az egerek intravénásan kapták a PMX antifolátumot 1 órával a radiotracer (3B. Ábra) vagy csak a radiotracer (3A. Ábra) előtt Az α-FR – pozitív daganatot és veséket könnyen láthatóvá tették A egér 99m Tc-PAMA-folate SPECT képein (3A ábra)., míg az egér B a 99m Tc-PAMA-folát vesefelhalmozódásának várható csökkenését mutatta, amikor az antifolátot előinjektálták (3B. ábra). További nagyfelbontású SPECT/CT képek egerekből PMX 99m Tc-PAMA injekcióval és anélkül -folátot a 2. és 3. kiegészítő ábrán mutatjuk be.

(A) Az in vivo képalkotási eljárás vázlata 99m Tc-PAMA-foláttal és koronális SPECT/CT metszetekkel (24 órával a 99m Tc-PAMA-folát injekciója után) szubkután α-FR – pozitív egerek daganata és veséje esetén KB daganatok, de PMX előinjekció nélkül. (B) Eljárás PMX előinjekcióval és a megfelelő koronális SPECT/CT szakaszokkal. i.v. = intravénás.

Az 1. kiegészítő videó egy egér SPECT/CT vetületeit mutatja PMX és 99m Tc-PAMA-foláttal. A felvételeket 24 órával a radiotracer injektálása után vettük fel. Nagy érzékenységű, párhuzamos lyukú kollimátort használtunk. A vizsgálat időtartama 30 és 60 perc között volt.

A 2. kiegészítő videó egy PMX, de csak 99 m Tc-PAMA-folát nélküli egér SPECT/CT vetületeit mutatja. A felvételeket 24 órával a radiotracer injektálása után vettük fel. Nagy érzékenységű, párhuzamos lyukú kollimátort használtunk. A vizsgálat időtartama 30 és 60 perc között volt.

VITA

A daganat/vese arány általában alacsony az összes jelentett radiofolát esetében, mivel az α-FR-pozitív veseszövetben kedvezőtlenül magas a felhalmozódás (23,24), és ezzel párhuzamosan alacsony a tumor felvétele. Ezért fontos a javulás a daganatfelvétel szabályozásában vagy a vese retenciójának szabályozásában, különös tekintettel a potenciális tumor-terápiára FA-val, részecskekibocsátó radionuklidokkal összekapcsolva.

Jelen tanulmány elején valószínűtlennek tűnt, hogy a radiofolát felvétel szelektív blokádja az α-FR – pozitív vesékben elérhető legyen a tumor felvételének egyidejű gátlása nélkül. Ezért arra törekedtünk, hogy növeljük a 99m Tc-PAMA-folát tumor felvételét a rosszindulatú sejtekben az α-FR expresszió upregulációján keresztül. Az α-FR expressziót vagy az FR által közvetített transzport aktivitását az extracelluláris és intracelluláris folátkoncentrációk szabályozzák (25,26). Korábban kimutatták, hogy az antifolátkezelés az a-FR expressziójának szabályozását eredményezte a HT-29 rákos sejtkultúrákban, mivel az antifolátok interferenciát okoztak a folát anyagcserében (15). Így feltételeztük, hogy a daganatos egerek antifolátos előkezelése szintén stimulálhatja az α-FR expressziót in vivo, és fokozhatja a 99m Tc-PAMA-folát tumor felhalmozódását.

MTX-nek, RTX-nek és PMX-nek kitett α-FR – pozitív KB sejtekkel nyert in vitro adataink összhangban voltak a HT-29 sejtekre vonatkozó megfigyelésekkel. A KB-sejtek antifolátokkal történő előinkubálása 2-szeresére növelte a radiotracer sejtfelvételét. Figyelemre méltó, hogy a hatás szinte minden antifolát esetében azonos volt, annak ellenére, hogy különböző enzimeket céloznak meg, és eltérő affinitásaik vannak az α-FR iránt (27, (28). Vizsgálatainkba belefoglaltuk az LV-t is, amely megfordítja az MTX kezelés citotoxicitását a dihidrofolát-reduktáz szintjén (29). Az antifolátumokkal ellentétben az LV csökkentette a tumorsejtekben a radiotracer felvételét, amely megállapítás összhangban van az irodalomban publikált megfigyelésekkel (30).

Mivel az MTX, RTX és PMX előinjekciója csak 1 órával a 99m Tc-PAMA-folát beadása előtt nem valószínű, hogy stimulálná az α-FR uregegulációt daganatokban (ezt az in vitro kísérleteink alátámasztják; 3. kiegészítő táblázat), ezért felmerült a kérdés. hogy a nem-toxikus LV-vel javítható-e a tumor/vese arány javulása is. Az MTX-hez hasonlóan az LV is nagy affinitást mutat a redukált folát hordozóval szemben, de lényegesen alacsonyabb affinitással kötődik az α-FR-hez, mint az FA (28,30). Azt tapasztaltuk azonban, hogy az előinjekciózott LV szinte teljesen blokkolta a tumor felvételét és a 99m Tc-PAMA-folát vesefelvételét (2. kiegészítő táblázat) ugyanolyan hatékonyan, mint az FA (12). Figyelemre méltó, hogy az antifolátok vagy az LV beadása kizárólag a radiofolátok vese- és tumorfelvételét érintette, és nem volt hatással azokra a radiotracerekre, amelyek nem célozzák meg az α-FR-t (a 99m Tc-PAMA-B12-vitamin in vivo biodisztribúciós adatai szerepelnek a a kiegészítő anyag; a 99m Tc-PAMA-B12-vitamin szerkezetét lásd az 1. ábrán).

Daganatot hordozó egerekben 99m Tc-PAMA-foláttal végzett SPECT vizsgálatok eredményei, PMX előzetes injektálással és anélkül, párhuzamosak voltak a postmortem adatokkal. Kontroll egerekben a vesék radioaktivitása uralta a tumor felhalmozódását; ezzel ellentétben a SPECT-vizsgálatok a radioaktivitás gyakorlatilag teljes hiányát tárták fel a PMX-vel előinjekciózott egerek veséjében. A radioaktivitás más szervekben, például a májban és a tüdőben nem volt kimutatható, és a gyomor-bél traktusban csak az injekció után 24 órával maradtak meg radioaktivitás nyomai.

KÖVETKEZTETÉS

Az antifolátok MTX, RTX és PMX adagolása szelektíven elnyomja a 99m Tc-PAMA-folát felvételét az α-FR-pozitív vesékben, míg az α-FR-pozitív neoplasztikus szövetekben való felvétel szinte változatlan marad. Adataink szilárd bizonyítékot szolgáltatnak arra vonatkozóan, hogy ezek a fejlesztések bármely radioaktívan jelzett folát-származékkal elérhetőek antifoláttal kombinálva. Ezek az eredmények új távlatokat nyitnak a daganatok radiofoláttal történő diagnosztizálásában, különös tekintettel a rákos betegek potenciális kezelésére antifolát kemoterápiás szerek és részecskéket kibocsátó izotóppal megjelölt radiofolátok kombinációjával.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Robert Waibel, Alexander Hohn, Judith Stahel és Christine De Pasquale technikai segítségét. Ezt a munkát anyagilag támogatta a Mallinckrodt-Tyco Inc. és a Merck Eprova AG.