A tcrB által közvetített rézrezisztenciát mutató széklet enterococcusok kiválasztása rézzel kiegészített sertések táplált étrendjében

ABSZTRAKT

BEVEZETÉS

A réz elengedhetetlen nyomelem, amely mind a prokarióta, mind az eukarióta sejtekben létfontosságú biológiai funkciókhoz szükséges (29). A malacokban a rézre adott növekedési reakció független a takarmányban általánosan használt antibiotikumokra adott válaszon és ezen kívül (16). A túlzott koncentrációjú réz mérgező a sejtekre, mert intracelluláris reaktív oxigéngyökök termelését indukálja, amelyek inaktiválják a sejtkomponenseket, például a nukleinsavakat, a lipideket és a fehérjéket (32). Ezért a sejtek szorosan szabályozzák az intracelluláris rézkoncentrációkat a toxicitás elkerülése érdekében (43). A réz homeosztázis mechanizmusát jól vizsgálták bizonyos Gram-pozitív baktériumoknál, mint például az Enterococcus hirae, a Lactococcus lactis és a Bacillus subtilis (45). A normál intracelluláris rézkoncentrációt a copYZAB operon tartja fenn, ahol a copA és a copB a réz beáramlásáért és a réz kiáramlásáért felelős réztranszport ATP-okat kódolja. A copY gén rézre reagáló represszorként működik, a copZ pedig réz chaperont kódol (46).

közvetített

(Ennek a munkának egy részét bemutatták a zoonotikus baktériumok és az étkezési kórokozók antimikrobiális rezisztenciájával foglalkozó második amerikai társadalomkonferencián, Torontóban, Kanadában, 2010. június 8–11., Valamint a harmadik amerikai mikrobiológiai társaság konferenciáján Enterococcusokról, Portland, Oregon (2010. július 30. és augusztus 2.)

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Állatok, kísérleti tervezés és mintavétel. Az állatok felhasználását és a követett kísérleti eljárást a Kansas Állami Egyetem Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá. Hatvan frissen elválasztott (21 napos) malacot, amelyek átlagos testtömege 7,0 kg (± 1 kg), véletlenszerűen két étrendi kezelésre osztottuk. A két diétás kezelés a következő volt: alap étrend 16,5 ppm rézzel (kontrollcsoport) vagy bazális étrend 125 ppm rézzel kiegészítve réz-szulfátként (rézcsoport). Az alap étrend kukoricából, szójabablisztből, vitaminokból, aminosavakból és nyomelemekből álló étrend-kiegészítőkből állt, és a malacokat egy környezetvédelmi szempontból ellenőrzött óvodai létesítményben helyezték el. Mindegyik kezelési csoportban összesen 30 malac volt, amelyek 5 tollhoz voltak rendelve, és 6 malac per toll. Mindegyik tollat ​​négy furatot tartalmazó önetetővel és egy vízbimbóval látták el, így az állatok ad libitum hozzáférést kaptak a takarmányhoz és a vízhez. Mindegyik tollnak volt dróthálós padlója, amely malaconként 0,3 m2-t tett lehetővé. A malacokat 42 napig kezelték a táplálékkal. A székletmintákat véletlenszerűen összegyűjtöttük minden sertésből 3 sertésből a 0., 14., 28. és 42. napon, egyedi zacskókba helyeztük és jégen laboratóriumba szállítottuk.

Az enterococcusok izolálása. Hacsak másképp nem említettük, az összes alkalmazott táptalaj a Difco-tól származott (Becton Dickinson, Sparks, MD). A székletmintákat úgy dolgoztuk fel, hogy 1 g székletet 10 ml foszfáttal pufferolt sóoldattal hígítottunk, és 50 μl szuszpenziót M-Enterococcus agarra terítettünk. A lemezeket 24 órán át 37 ° C-on inkubáltuk. Öt kolóniát (pontos piros, rózsaszín vagy fémes rózsaszín) szedtünk, véragar lemezekre csíkoztunk és egy éjszakán át inkubáltuk 37 ° C-on. Valamennyi izolátumot teszteltük az esculin hidrolízisére úgy, hogy beoltottuk 100 μl Enterococcosel táptalajba egy 96 üregű mikrotiterlemezen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), és 4 órán át 37 ° C-on inkubáltuk. Székletmintánként három esculin-hidrolízis-pozitív izolátumot (9 toll/toll és 45/kezelés minden mintavételi időpontban) Protect gyöngyökkel (Cryocare; Key Scientific Products, Stamford, TX) -80 ° C-on tároltunk további felhasználásig.

PCR a tcrB gén kimutatására. A tcrB gént Hasman és munkatársai által leírt eljárással detektáltuk. (20) Az egyes izolátumokat egyetlen Protect gyöngyből véragar lemezre csíkoltuk, és egy éjszakán át inkubáltuk 37 ° C-on. A bakteriális DNS-t úgy nyertük ki, hogy egyetlen telepet nukleázmentes vízbe szuszpendáltunk Chelex 100 gyantával (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornia), és 10 percig forraltuk (4). Pozitív kontrollként egy tcrB-pozitív E. faecium törzs (7430275-4 vagy 7430272-6; Henrik Hasman, a Dán Nemzeti Egyetem Nemzeti Élelmiszerintézete szolgáltatta).

A tcrB-pozitív enterococcusok specifikációja. A kontroll és kezelési csoportból véletlenszerűen kiválasztott enterococcus izolátumok és azonos számú tcrB negatív izolátum fajok azonosítását egy multiplex PCR-rel végeztük, amely azonosítja az E. faeciumot, az E. faecalis-t, az E. gallinarumot és E. casseliflavus (24). Ezenkívül a faj megerősítéséhez szuperoxid-diszmutáz (sodA) génszekvencia-analízist (42) alkalmaztunk. A DNS-templátot a fentiek szerint állítottuk elő. Az E. faecium (ATCC 19434), az E. faecalis (ATCC 19433), az E. gallinarum (ATCC 49579) és az E. casseliflavus (ATCC 25788) ATCC (Manassas, VA) törzsei pozitív kontrollként szolgáltak. A multiplex PCR és a sodA gén PCR mesterkeverékeit, primereit és futási körülményeit Jackson et al. (24) és Poyart és mtsai. (42). A sodA géntermékeket a Wizard SV gél- és PCR-tisztító rendszerrel (Promega, Madison, WI) tisztítottuk. A tisztított PCR-termékeket a Riverside-i Kaliforniai Egyetem Genomics Core-jában, az Integratív Genombiológiai Intézetben szekvenáltuk. A szekvenciákat BLAST kereséssel elemeztük az NCBI GenBank adatbázisában.

Az erm (B) és a vanA gének kimutatása. Az erm (B) és a vanA gének kimutatására szolgáló primerek és PCR-körülmények megegyeztek Jacob és munkatársai munkájával. (26) és Kariyama et al. (27). Az Enterococcus faecalis MMH 594 (Lynn Hancock, a Kansas Állami Egyetem Biológiai Osztálya) és az E. faecium (ATCC 51559) szolgált pozitív kontrollként az erm (B), illetve a vanA génekre,.

A réz érzékenységének meghatározása. A tcrB-pozitív és azonos számú tcrB-negatív enterococcus izolátum rézérzékenységének meghatározását agar-hígítási módszerrel végeztük (19, 20). A két dániai törzset (7430162-6 és 7430275-4) pozitív kontrollként vettük fel. Mueller-Hinton (MH) agarlemezek réz-koncentrációkkal előállítva, réz-szulfátként hozzáadva (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ) 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36 vagy 40 mM, és pH-ját 7,0-re állítottuk be. A lemezeket 20 μl baktériumtenyészettel oltottuk be, amelyet a McFarland-féle zavarossági standardhoz igazítottunk. 0,5 (Remel, Lenexa, KS) és inkubáljuk 37 ° C-on 48 órán keresztül a növekedés vagy a növekedés hiányának meghatározása céljából. Az érzékenységi meghatározásokat egy másik napon megismételtük különböző inokulumkészítményekkel.

Antibiotikum érzékenység meghatározása. A mikrobroth hígítási módszert alkalmaztuk az eritromicin és a vankomicin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) MIC-értékeinek meghatározására a CLSI irányelvek szerint (11). Steril desztillált vízben készítettünk antibiotikum törzsoldatokat, amelyek mindegyike a hatékonyság alapján 1000 μg/ml végkoncentrációt tartalmaz. A baktériumtenyészeteket úgy állítottuk elő, hogy egyetlen telepet oltottunk be 10 ml MH táptalajba, 6 órán át inkubáltuk, majd steril MH tápoldattal hígítottuk 100-szor. Az antibiotikumokat 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56, 0,78, 0,39, 0,195 és 0,098 μg/ml koncentrációban teszteltük. Az antimikrobiális érzékenységi tesztet 96 lyukú mikrotiterlemezeken (Becton Dickinson) végeztük, és az oltott lemezeket 37 ° C-on inkubáltuk 24 órán át, és az eredményeket növekedésként vagy növekedés nélkül rögzítettük. A MIC-meghatározásokat egy másik napon megismételtük különböző inokulumkészítményekkel.

A tcrB gén fajok közötti átvihetősége. Konjugációs vizsgálatot hajtottunk végre a szűrő párosítási eljárással (47). A tcrB-pozitív donortörzsek (5 E. faecium és 5 E. faecalis törzs) rezisztensek voltak a tetraciklinnel szemben [MIC> 100 μg/ml; tet (M) pozitív] és fogékony a spektinomicinre [MIC = 12,5 μg/ml]. E. faecium TX 5034 törzs (Barbara Murray, a Texas Egyetemi Orvostudományi Egyetem szolgáltatja), rezisztens a spektinomicinnel (MIC> 100 μg/ml) és tet (M) negatív és tetraciklinre fogékony (MIC = 0,78 μg/ml), és E. faecalis OG1SSp törzset (Ludek Zurek, Kansas Állami Egyetem), rezisztens spektrinomicinnel szemben (MIC> 100 μg/ml) és tet (M) negatív, valamint érzékeny a tetraciklinre (MIC = 0,39 μg/ml). törzsek. A donorokat és a recipienseket tetraciklint (40 μg/ml) és spektinomicint (500 μg/ml) tartalmazó BHI agarlemezeken növesztettük. A kapott transzkonjugánsokat BHI agarlemezeken szelektáltuk, amelyek mind tetraciklint, mind spektinomicint tartalmaztak. A transzkonjugánsokat PCR-rel teszteltük a tcrB és erm (B) génekre, és rézre való érzékenységüket a fent leírtak szerint határoztuk meg. Az egyes törzsek transzferfrekvenciáját a transzkonjugánsok CFU-jaként számoltuk befogadó CFU-ként.

A tcrB-pozitív széklet enterococcusok előfordulása rézzel vagy anélkül kiegészített étrendet fogyasztó malacokban

a) A rézzel vagy anélkül kiegészített étrendből táplálkozott malacokból származó tcrB-pozitív Enterococcus faecium izolátumok SmaI-emésztett genomiális DNS-jének pulzáló mezős gélelektroforézis sávozásának mintázata. b) Rézzel vagy anélkül kiegészített étrenddel táplált malacokból származó tcrB-pozitív Enterococcus faecalis izolátumok SmaI által emésztett genomi DNS-jének pulzálómezős gélelektroforézis sávos mintázata.

Déli hibridizáció. Az E. faecium vagy az E. faecalis genomiális DNS restrikciós emésztése S1 nukleázzal külön-külön ~ 194 kbp méretű sávot eredményezett (2. ábra). A tcrB-negatív E. faecium vagy E. faecalis restrikciós emésztése S1 nukleázzal nem eredményezett 194 kbp sávokat, de 150 és 170 kbp közötti sávokat mutatott (az adatokat nem mutatjuk be). Mindhárom vizsgált tcrB-pozitív E. faecium és E. faecalis izolátumban mind a tcrB, mind az erm (B) génszondák hibridizálódtak a ~ 194 kbp sávval (2. ábra). TcrB-negatív E. faecium vagy E. faecalis törzseknél a várakozásoknak megfelelően nem tapasztaltunk hibridizációt tcrB génszondával; az erm (B) génszonda azonban 150–170 kbp sávokkal hibridizált (az adatokat nem közöljük).

A tcrB és az erm (B) próbák hibridizálása három enterococcus törzs S1 nukleázzal emésztett genomi DNS-ével. Sávok: 1, középtartományú PFG marker II; 2. és 3. ábra: S1 nukleáz enzimmel emésztett E. faecium izolátumok genomi DNS-e; 4. ábra: az S1 nukleáz enzimmel emésztett E. faecalis izolátum genomi DNS-e; 5., 6. és 7. ábra: Southern blot hibridizáció tcrB próbával; A 8. és 9. ábra: S1 nukleáz enzimmel emésztett E. faecium izolátumok genomi DNS-e; 10. ábra: S1 nukleáz enzimmel emésztett E. faecalis izolátum genomi DNS-e; 11., 12. és 13., Southern blot hibridizáció erm (B) próbával.

A tcrB gén fajok közötti átvihetősége. Öt tcrB-pozitív E. faecium és E. faecalis izolátumot használtunk a tcrB gén fajok közötti konjugációval történő transzferálhatóságának kimutatására. A 10 eredő transzkonjugáns pozitív volt a tcrB, az erm (B) és a tet (M) génekre. Ahogy az várható volt, a transzkonjugánsok magas rézkoncentrációt (16 vagy 20 mM) tartalmazó MH agaron nőttek. A 10 transzkonjugáns átlagos réz-MIC értéke 18,4 mM volt. A tcrB-pozitív E. faecium és E. faecalis izolátumok átlagos átviteli frekvenciája 9,3 × 10–6, illetve 8,2 × 10–6 volt (2. táblázat).

A tcrB gén transzferfrekvenciája Enterococcus faeciumban és Enterococcus faecalis-ban

VITA

A malacokban a réz az étrendhez olyan koncentrációban kerül hozzáadásra, amely meghaladja az állat fiziológiás szükségességét növekedésserkentő hatása miatt (38). A réz, mint növekedésserkentő hatásának pontos mechanizmusa még nem tisztázott, de a réz antimikrobiális hatásainak tulajdonítható javasolt mechanizmusok közé tartoznak a megváltozott bél mikrobiális populációk, a tápanyagok és az energia fokozott hozzáférhetősége a bélben csökkent mikrobiális aktivitás miatt, és esetleg az enterális baktériumok kórokozóinak elnyomása (18, 23). Az európai országokban a rézt a sertés étrendje emelt szinten pótolja, gyakran a takarmányban lévő antibiotikumok pótlásaként, amelyeket az 1990-es évek közepe óta tilos növekedésserkentőként használni (3, 21).

LÁBJEGYZETEK