A Treg sejtek/T effektor funkció GITR jelzéssel történő modulálása kontextustól függ

Immunológiai Laboratórium, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, Nemzeti Egészségügyi Intézet, Bethesda, MD, USA

Keck Orvostudományi Klinika, Dél-Kaliforniai Egyetem, Los Angeles, Kalifornia, USA

Immunológiai Laboratórium, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, Nemzeti Egészségügyi Intézet, Bethesda, MD, USA

Teljes levelezés: Dr. Ethan M. Shevach, Immunológiai Laboratórium, NIAID/NIH Blg. 10 RM11N315, Bethesda, MD 20892, USA

Kiegészítő levelezés: Dr. Geoffrey L. Stephens, Medimmune, Gaithersburg, MD, USA

Immunológiai Laboratórium, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, Nemzeti Egészségügyi Intézet, Bethesda, MD, USA

Immunológiai Laboratórium, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, Nemzeti Egészségügyi Intézet, Bethesda, MD, USA

Immunológiai Laboratórium, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, Nemzeti Egészségügyi Intézet, Bethesda, MD, USA

Teljes levelezés: Dr. Ethan M. Shevach, Immunológiai Laboratórium, NIAID/NIH Blg. 10 RM11N315, Bethesda, MD 20892, USA

Kiegészítő levelezés: Dr. Geoffrey L. Stephens, Medimmune, Gaithersburg, MD, USA

Immunológiai Laboratórium, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, Nemzeti Egészségügyi Intézet, Bethesda, MD, USA

Keck Orvostudományi Klinika, Dél-Kaliforniai Egyetem, Los Angeles, Kalifornia, USA

Immunológiai Laboratórium, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, Nemzeti Egészségügyi Intézet, Bethesda, MD, USA

Teljes levelezés: Dr. Ethan M. Shevach, Immunológiai Laboratórium, NIAID/NIH Blg. 10 RM11N315, Bethesda, MD 20892, USA

Kiegészítő levelezés: Dr. Geoffrey L. Stephens, Medimmune, Gaithersburg, MD, USA

Immunológiai Laboratórium, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, Nemzeti Egészségügyi Intézet, Bethesda, MD, USA

Immunológiai Laboratórium, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, Országos Egészségügyi Intézet, Bethesda, MD, USA

Immunológiai Laboratórium, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, Nemzeti Egészségügyi Intézet, Bethesda, MD, USA

Teljes levelezés: Dr. Ethan M. Shevach, Immunológiai Laboratórium, NIAID/NIH Blg. 10 RM11N315, Bethesda, MD 20892, USA

Kiegészítő levelezés: Dr. Geoffrey L. Stephens, Medimmune, Gaithersburg, MD, USA

Absztrakt

Bevezetés

Jelen vizsgálatunkban nem szétválasztó, rekombináns Fc-GITR-L-t, valamint a GITR WT és GITR KO Treg sejtek és Teff sejtek kombinációit alkalmaztuk a GITR stimuláció egyes szubpopulációkra gyakorolt ​​hatásainak újbóli vizsgálatára mind manipulálatlan egerekben, mind jól jellemzett egerekben. gyulladásos bélbetegség (IBD) modellje. Bemutatjuk, hogy az Fc-GITR-L-indukálta GITR-jelzés hatásai összetettek, és függenek a gazdaszervezet fiziológiás környezetétől, valamint a Treg és Teff sejtek aktivációs állapotától. Megvitatjuk ezen eredmények következményeit az immunválasz terápiás manipulációjára a TNFRSF tagjai által.

Eredmények

A GITR bekapcsolása mind a Foxp3 +, mind a Foxp3 - T sejtek terjeszkedését serkenti naiv egerekben

sejtek

Az Fc-GITR-L súlyosbítja az IBD-t azáltal, hogy fokozza a patogén T-sejtek expanzióját

A GITR az APC-k és az NK-sejtek szintjén is alacsony szinten van expresszálva, és 22, 23 azt javasolták, hogy a GITR in vivo elköteleződésének egyes hatásai másodlagosak lehetnek a veleszületett immunfunkciók modulációjától. A probléma megoldására CD4 + CD45RB hi T sejteket juttattunk át a GITR -/- egerekből a RAG -/- egerekbe (Támogató információk 2A. Ábra). A GITR -/- egerekből származó CD4 + CD45RB hi T sejtek ugyanolyan hatékonyan indukálták a veszteséget, mint a WT egerek CD4 + CD45RB hi T sejtjei (2A. Ábra a támogató információkkal összehasonlítva a 2A. Ábra). Az Fc-GITR-L kezelés azonban nem súlyosbította a súlycsökkenést, és nem növelte az IFN-γ-t szekretáló CD4 + T-sejtek abszolút számát a mesenterialis LN-ben (Támogató információk 2B. Ábra). Ez a tanulmány bebizonyítja, hogy a GITR-L alkalmazásának hatásai közvetlenül a Teff sejtekre, és nem közvetett módon a veleszületett immunrendszer sejtjeire terjednek.

A GITR bekapcsolása Treg-sejt veszteséget okoz az IBD modellben

Mivel az Fc-GITR-L kezelés elsősorban normál, manipulálatlan egerekben képes volt a Treg sejtek kiterjesztésére, és a Treff sejtek hiányában a Teff sejtek számát is növelni tudta, érdekes volt meghatározni, hogy melyik vagy ezek a hatások dominálnak az IBD modellben. CD4 + GFP + Treg sejtekkel (2x105) együtt CD4 + GFP + Treg sejtekkel (2 × 105) CD4 + CD45RB hi GFP - T-sejteket (4 × 105) vittünk át a Foxp3-GFP egerekből koppintott egerekbe. Az Fc-GITR-L-lel kezelt egerek fogyást mutattak, míg a kezeletlen egereket, ahogy az várható volt, megvédték az IBD-től (3A. Ábra). Meglepő módon mind a Foxp3 + T-sejtek százaléka, mind az abszolút száma az Fc-GITR-L-kezelt egerekben csökkent a mesenterialis LN-ben, de ez a különbség statisztikailag nem volt szignifikáns (3B. Ábra). Nem támaszkodtunk a GFP expresszióra a Foxp3 + T sejtek kimutatásához, és minden vizsgálatban intracelluláris festést végeztünk a Foxp3 expresszióhoz.

Az Fc-GITR-L stimuláció lecsökkenti a Foxp3 expressziót limfopénikus körülmények között

Az egyik lehetőség az, hogy azokat a Foxp3 + T-sejteket, amelyek elvesztették a Foxp3 expresszióját és nevezhetők ex-Treg sejteknek 24, patogén Teff sejtekké alakították át. A Treg sejtek RAG -/- befogadóinak egyike sem fogyott el az Fc-GITR-L kezelés 8 hete alatt (5D. Ábra). Az IFN-y-t termelő CD4 + T-sejtek gyakorisága hasonló volt az ex-Treg-sejt populációkban a kezelt és nem kezelt csoportokban (5. ábra E). Az IL-17-et termelő ex-Treg sejtek jelentős növekedését figyeltük meg a GITR-L-kezelt egerek mLN-jében (5F. Ábra). A fennmaradó Foxp3 + T sejtek nagyon alacsony (

Vita

Aligha kétséges, hogy a Foxp3 + Treg sejtek számának és/vagy funkciójának modulálása jelent fő célt az autoimmun betegségek terápiájában. A TNFRSF tagjai sokféle szerepet játszanak az immunválasz finomhangolásában, és több tagot előnyösen expresszálnak a Foxp3 + Treg sejtek, beleértve a GITR (TNFRSF18), OX40 (TNFRSF4) 25 és DR3 (TNFRSF25) 26. Az egyik fő kérdés, amely továbbra is megoldatlan, az, hogy a TNFRSF-tagok terápiás célzása használható-e a Treg-sejtek működésének javítására in vivo, és hogy ez a megközelítés használható-e az IL-2 kezelés 27 vagy a Treg-sejtes sejtbioterápia 28 alternatívájaként. Bár egyes tanulmányok kimutatták, hogy az agonista mAb-k vagy az oldható ligandumok ezekre a receptorokra gyakorolják az egér Treg-sejt funkcióját 13, a legtöbb tanulmány értelmezése bonyolult, mivel ezek a reagensek szintén hatékony kostimuláló hatást fejtenek ki a Teff sejtekre és néhány a reagensek a Treg-sejtek kimerülését eredményezhetik 16. Ez utóbbi vizsgálatok közül néhányat valószínűleg félreértelmeztek, mivel a Treg-sejtek szuppresszor funkciójának megfordulását másodlagosnak bizonyítják a GITR Treg sejteken való bekapcsolódása miatt.

Általánosságban elmondható, hogy a GITR-L kezelés megnövelte az IFN-γ-termelő sejtek számát, de nem befolyásolta az IL-17-t termelő sejtek számát. Az IL ‐ 17 szerepe az IBD patogenezisében továbbra is ellentmondásos 29. Egyes tanulmányokban az IL ‐ 17-termelő sejtek növekedését figyeltük meg olyan körülmények között, amikor a Treg-sejteknek terápiás hatása volt. Lehetséges, hogy ezek a sejtek védő Th17 sejteket képviselnek 30. Amikor a WT Treg sejteket Teff sejtek hiányában RAG KO egerekbe vitték, az Fc-GITR-L kezelés a Foxp3 expresszió szinte teljes elvesztését eredményezte, de az ex-Treg sejtek fennmaradtak, és nem okoztak betegséget a a tanulmány. Valószínű, hogy a betegség megfigyelésének elmulasztása ebben az időszakban másodlagos volt egyes Treg sejtek perzisztenciája miatt, amelyek fenntartották a Foxp3 expressziót. A betegség indukciójának hasonló hiányát észlelték egy másik vizsgálatban, amelyben a Foxp3 + T sejteket RAG -/- recipiensekre vitték át 31. Míg a sejtek 50% -a elvesztette a Foxp3 expresszióját, a recipienseknél nem alakult ki IBD. Amikor azonban a Foxp3-sejteket elkülönítettük és másodlagos RAG -/- egerekbe helyeztük, a recipiensekben szöveti gyulladás alakult ki.

Összességében elmondható, hogy a Treg sejteken végzett GITR aktiválásnak különböző eredményei lehetnek a kísérleti kontextustól függően, a normál egerek kiterjedésétől az IBD modellben bekövetkező halálig. Ez a kettős GITR-kapcsolat Treg sejteken nem váratlan, mivel a TNFRSF többi tagjához hasonlóan a GITR egynél több jelátviteli utat is aktiválhat. Az NF ‐ κB útvonal aktiválása a Treg-sejt 32 terjeszkedését eredményezheti, míg a SIT-en keresztüli GITR jelzés apoptózist 33 eredményezhet. Az is lehetséges, hogy a Treg-sejtek proliferációjának gyors indukciója erősen gyulladásos környezetben aktiváció okozta sejthalált eredményezhet FAS/FAS-L vagy TNF/TNFR révén. Összességében a GITR funkció egérmodellben végzett vizsgálatának lefordítását az emberben az Fc-GITR-L vagy agonista mAb-k használatára óvatosan kell elvégezni, a vizsgált betegségtől (autoimmunitás vagy tumor immunitás) és a a gazda.

Anyagok és metódusok

Állatok

A C57BL/6 egereket a National Cancer Institute-tól (Frederick, MD) szereztük be. A Foxp3 ‐ GFP egereket Dr. V.J. Kuchroo (Harvard Egyetem, Boston, MA) és a Taconic Farms (Germantown, NY) fenntartja a NIAID szerződésével. A Taconic Farms-tól nyert RAG -/- egerek. GITR +/ - Az embriókat (Sv129 × B6) C. Ricarrdi (Perugia University Medical School, Perugia, Olaszország) biztosította. Újratervezve GITR +Az egereket egyszer keresztbe kereszteztük C57BL/6 egerekkel, és a kapott utódokat PCR-rel szűrtük a mutáns allél szempontjából. Az azonosított GITR +/ - az utódokat ezután kereszteztük a termeléshez GITR -/- egerek. Valamennyi egeret az Országos Egészségügyi Intézet/Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézetében tenyésztették és helyezték el, specifikus kórokozóktól mentesen. Valamennyi vizsgálatot a NIAID Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá.

Táptalaj, mAb-k és reagensek

Az Fc-GITR-L, # 178–14 konstrukció, a korábban leírt módon készült 15. Anti-CD4 V-500 és PE-Cy5, anti-CD25 PE, anti-GITR-PE, anti-CD44 Alexa Fluor 700, CD45.2 allofikocianin-eFluor 780, anti-CD45.1 PE-Cy7, rögzíthető életképességű festék allofikocianin -EFluor 780 és eFluor 450, anti-Foxp3 PE, eFlour 450 és allofikocianin, ant-IL-17 Alexa Fluor 647 és anti-IFN-γ PE-Cy7 vásároltak (eBioscience, San Diego, Kalifornia). A PE – anti-CD25 (PC61), az anti-GITR PE-Cy7, az anti-CD45RB FITC és PE, az anti-Ki67 PE és az anti-BrdU FITC-t a BD Biosciences-től (San Jose, Kalifornia) vásároltuk. Az intracelluláris festést a Foxp3 festési pufferkészlettel végeztük, a gyártó protokollja szerint (eBioscience vagy BD Biosciences). CD4 mikragyöngyöket a Miltenyi Biotec-től (Auburn, Kalifornia) szereztünk be. Az áramlási citometriás elemzést FlowJo szoftverrel végeztük.

A T-sejt részhalmazok tisztítása

Perifériás LN-ket és lépeket gyűjtöttünk 8 hetes nőstény egerekből. CD4 + T-sejteket, ahol az Automacs CD4 mikragyöngyökkel dúsította, anti-CD4 PE-Cy5, anti-CD25 PE és CD45RB FITC vagy anti-CD4 PE-Cy5 és anti-CD45RB PE jelzéssel, és sejtrendezéssel tisztították. A CD4 + CD25 - CD45RB hi, CD4 + CD25 +, CD4 + GFP - CD45RB hi, CD4 + GFP + sejtek tisztasága> 98% volt.

T-sejt rekonstrukció és Fc-GITR-L kezelés

A RAG KO egereket iv. rendezett CD4 + T-sejt szubpopulációkkal PBS-ben. Az egerek 5x10 5 CD4 + CD45RB magasat kaptak a WT GITR vagy a GITR KO egerekből önmagában vagy 2 × 105 CD4 + GFP + GITR WT, CD4 + CD25 + GITR WT vagy CD4 + CD25 + GITR KO sejtekkel kombinálva; az egerek egy csoportja önmagában 2 × 105 CD4 + GFP + GITR WT-t kapott. Az Fc-GITR-L-t (200 μg) iv. egy nappal a T-sejtek feloldása után, majd hetente egyszer, amíg a vizsgálatot befejezik. Az egereket hetente lemértük.

Elnyomási vizsgálat

A CD4 + CD25-T-sejteket és a CD4 + CD25 + T-sejteket sejtrendezéssel tisztítottuk; az utólagos tisztaság> 98% volt. A szuppressziós vizsgálatokat a 3. leírás szerint hajtottuk végre .

Statisztikai analízis

A statisztikai vizsgálatokat Mann – Whitney segítségével hasonlítottuk össze U tesztet, és a különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintették o

Köszönetnyilvánítás

Ezeket a tanulmányokat az Országos Allergia- és Fertőző Betegségek Intézetének intramurális programjának forrásai támogatták.

Összeférhetetlenség

A szerzők nem jelentenek be pénzügyi vagy kereskedelmi összeférhetetlenséget.

Ez a folyóirat a szerzőink és olvasóink számára nyújtott szolgáltatásként a szerzők által szolgáltatott támogató információkat tartalmazza. Az ilyen anyagokat szakértői véleményezés alatt tartják, és át lehet őket szervezni az online kézbesítéshez, de nem másolatos vagy szedett. A támogató információkból (a hiányzó fájlok kivételével) felmerülő technikai támogatási kérdéseket a szerzőkhöz kell intézni.