A VEGF-D propeptidjei meghatározzák a heparin kötődését, a receptorok heterodimerizációját és a tumorbiológiára gyakorolt ​​hatásokat *

Nicole C. Harris

A um Tumor Angiogenezis Programból, Peter MacCallum Rákközpont, Kelet-Melbourne, Victoria 3002, Ausztrália,

meghatározzák

a § Ludwig Rákkutató Intézet, Royal Melbourne Kórház, Parkville, Victoria 3050, Ausztrália és

Natalia Davydova

A um Tumor Angiogenezis Programból, Peter MacCallum Rákközpont, Kelet-Melbourne, Victoria 3002, Ausztrália,

Sally Roufail

A um Tumor Angiogenezis Programból, Peter MacCallum Rákközpont, Kelet-Melbourne, Victoria 3002, Ausztrália,

Sophie Paquet-Fifield

A um Tumor Angiogenezis Programból, Peter MacCallum Rákközpont, Kelet-Melbourne, Victoria 3002, Ausztrália,

Karri Paavonen

a § Ludwig Rákkutató Intézet, Royal Melbourne Kórház, Parkville, Victoria 3050, Ausztrália és

Tara Karnezis

A um Tumor Angiogenezis Programból, Peter MacCallum Rákközpont, Kelet-Melbourne, Victoria 3002, Ausztrália,

Te-Fang Zhang

A um Tumor Angiogenezis Programból, Peter MacCallum Rákközpont, Kelet-Melbourne, Victoria 3002, Ausztrália,

Teruhiko Sato

A um Tumor Angiogenezis Programból, Peter MacCallum Rákközpont, Kelet-Melbourne, Victoria 3002, Ausztrália,

Julie Rothacker

a § Ludwig Rákkutató Intézet, Royal Melbourne Kórház, Parkville, Victoria 3050, Ausztrália és

Edouard C. Szép

a § Ludwig Rákkutató Intézet, Royal Melbourne Kórház, Parkville, Victoria 3050, Ausztrália és

Steven A. Stacker

A um Tumor Angiogenezis Programból, Peter MacCallum Rákközpont, Kelet-Melbourne, Victoria 3002, Ausztrália,

a § Ludwig Rákkutató Intézet, Royal Melbourne Kórház, Parkville, Victoria 3050, Ausztrália és

a ¶ Sir Peter MacCallum Onkológiai Tanszék, Melbourne-i Egyetem, Parkville, Victoria 3050, Ausztrália

Marc G. Achen

A um Tumor Angiogenezis Programból, Peter MacCallum Rákközpont, Kelet-Melbourne, Victoria 3002, Ausztrália,

a § Ludwig Rákkutató Intézet, Royal Melbourne Kórház, Parkville, Victoria 3050, Ausztrália és

a ¶ Sir Peter MacCallum Onkológiai Tanszék, Melbourne-i Egyetem, Parkville, Victoria 3050, Ausztrália

Absztrakt

Bevezetés

Az angiogenezis és a lymphangiogenesis kulcsfontosságú folyamatok az embriogenezisben, a sebgyógyulásban és az immunfunkcióban, valamint olyan betegségekben, mint az áttétes rák, a gyulladásos rendellenességek és a lymphangioleiomyomatosis (LAM) 2 (1–4). A szekretált glikoproteinek VEGF családjának tagjai elősegítik a limfangiogenezist és/vagy az angiogenezist azáltal, hogy aktiválják a sejtfelszíni receptor tirozin kinázokat az endoteliális sejteken, például a VEGF receptor (VEGFR) -2 és a VEGFR-3. Például az emberi VEGF-D mind a VEGFR-2-t, mind a VEGFR-3-at aktiválja (5), és az erek és a nyirokerek növekedését ösztönzi különböző körülmények között (6–12). A rák állatmodelljeiben a VEGF-D expressziója elősegíti az erek és a kis nyirokerek növekedését a daganatokban és azok környékén, megkönnyítve a tumor növekedését, és fokozva a nyirokcsomók és a távoli szervek metasztázisát (13–15). A VEGF-D elősegíti a daganatot elvezető gyűjtő nyirokerek tágulását is, ami megkönnyíti a daganatos sejtek transzportját és tovább fokozza az áttéteket (16).

A VEGF-D egy sor humán daganatban expresszálódik, és korrelálhat a nyirokcsomó metasztázisával és a beteg rossz kimenetelével (Ref. 17–21); áttekintésre lásd: Refs. 2, 22). A klinikopatológiai és a kísérleti adatok azt mutatják, hogy a VEGF-D jelátviteli út terápiás célpont lehet a rák terjedésének korlátozásában (23, 24). Javasolták továbbá, hogy a VEGF-D a tumor angiogenezisének alternatív mediátora a VEGF-A-val szemben (25, 26), amely hozzájárulhat a bevacizumab, a VEGF-A-t célzó, széles körben alkalmazott rákellenes gyógyszerrel szembeni rezisztencia mechanizmusaihoz (27). ). A VEGF-D klinikai mintákban, például daganatos szövetekben történő elemzését bonyolítja az a tény, hogy ez egy proteolitikusan feldolgozott fehérje (28), amely különböző formákban, különböző méretben és alegység-összetételben detektálható. Alapvető fontosságú megérteni a VEGF-D különböző doménjeinek funkcióit az optimális terápiás és diagnosztikai megközelítések megtervezéséhez, amelyek a fehérje klinikailag fontos formáját/formáit célozzák meg.

Kimutatták, hogy a VEGF-D által közvetített tumor növekedéséhez és terjedéséhez feltétlenül szükséges a proteolitikus feldolgozás (34); a propeptidek ezekben az eseményekben betöltött funkcióiról azonban keveset tudni. A propeptid funkció elemzését bonyolítja a részben feldolgozott VEGF-D tisztításának vagy specifikus expresszálásának nehézsége (amelyben bármelyik propeptidet hasítottuk a VHD-ből) teljes hosszúságú vagy érett anyag hiányában (28, 34). Itt megkerüljük ezt a problémát a VEGF-D olyan formáinak felhasználásával, amelyekben bármelyik propeptidet törölték, és a másik propeptid feldolgozását mutáció blokkolja. Ez lehetővé tette számunkra, hogy teszteljük azt a hipotézist, miszerint a propeptidek modulálják a VEGF-D különféle kölcsönhatásait, és annak rákos hatásait. Megmutattuk, hogy a propeptidek meghatározzák a VEGF-D kötődését a VEGF receptor heterodimerekhez, társreceptorokhoz és heparinhoz, és befolyásolják a tumorbiológia kulcsfontosságú aspektusait, például az elsődleges tumor növekedési sebességét és az áttéteket.

KÍSÉRLETI ELJÁRÁSOK

Sejtkultúra

293EBNA-1 és humán mikrovaszkuláris endoteliális sejteket (HMVEC) tenyésztettünk, mint korábban (28, 34), és Suspension Freestyle TM 293-F sejteket a szállító szerint (Invitrogen, Carlsbad, CA).

VEGF-D fehérjeszerkezetek

A tanulmányban használt VEGF-D származékok a következők. (i) VEGF-DSSTS.IISS: a proteolitikus hasítási helyeken a humán VEGF-D N-terminálisan FLAG-jelölt teljes hosszúságú formája, amely mutációkat tartalmaz, amelyek megakadályozzák mindkét propeptid hasítását (29); (ii) VEGF-DΔNΔC: a humán VEGF-D érett formája, amely az N-terminálison FLAG-tal jelölt VHD-ből áll (5, 28); (iii) VEGF-D-CPRO: a humán VEGF-D C-terminális propeptidje (206–354. aminosavmaradék), amelyet az N-terminálison FLAG-nal jelölünk (35); (iv) VEGF-DΔNIISS: a VEGF-D N-terminálisan FLAG-jelölt formája (amely magában foglalja a 89–354. aminosavat), hiányzik az N-terminális propeptidből, és olyan mutációkat tartalmaz (R204S és R205S), amelyek megakadályozzák a C-terminális hasítását propeptid; (v) VEGF-DΔCSSTS: a VEGF-D N-terminálisan FLAG-jelölt formája (amely magában foglalja a 24–205. aminosavakat) hiányzik a C-terminális propeptidből, és olyan mutációkat tartalmaz (R85S és R88S), amelyek megakadályozzák az N-terminális hasítását. propeptid. A VEGF-DΔNIISS és a VEGF-DΔNΔC tartalmazza a VHD N-terminális régióját, amelyet fontosnak tartanak a VEGFR-3-mal való kölcsönhatás szempontjából (36). Ezen fehérjék expressziós vektorait a pApex-3-ból állítottuk elő (Alexion Pharmaceuticals, Cheshire, CT).

Transzfekció és fehérjetisztítás

293EBNA-1 sejteket transzfektáltunk, és stabilan expresszáló klónokat választottunk ki a leírtak szerint (34). 293F sejteket transzfektáltunk a szállító (Invitrogen) szerint. A VEGF-D fehérjéket kondicionált táptalajból tisztítottuk affinitáskromatográfiával M2 (anti-FLAG) gélen, a korábban leírtak szerint (28), és spektrofotometriásán kvantitáltuk.

Immuncsapadék és Western Blotting

A VEGF-D származékokat immunprecipitáltuk és Western-blotokban detektáltuk a leírtak szerint (33, 34). A VEGFR-2/VEGFR-3 heterodimerek elemzéséhez a HMVEC-ket növekedési faktorokkal kezeltük 10 percig, majd a sejteket 15 percig jéghideg pufferben (1% Nonidet P-40, 20 mm Tris-HCl, pH-érték) lizáltuk. 8,0, 137 mm NaCl, 10% glicerin, 2 mm EDTA, 1 mm aktivált nátrium-ortovanadát, 10 μg/ml aprotinin és 10 μg/ml leupeptin). A VEGFR-2-t immunprecipitáltuk és Western-blotokban megcéloztuk egy mab-nal a humán VEGFR-2 (55B11, Cell Signaling Technologies, Beverly, MA) C-terminálisához, és a VEGFR-3-at egy poliklonális antitesttel a humán VEGFR-2 C-terminálisához. 3 (sc-321, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia). A foszfotirozin maradványokat foszfotiramin elleni mab-nal (4G10, Millipore, Billerica, MA), a VEGF-A-t pedig a VEGF-A165 (Santa Cruz Biotechnology Inc.) elleni mab-nal céloztuk meg. A kimutatáshoz szekunder 800 IRDye®-konjugált IgG antitestet (LI-COR Biosciences, Lincoln, NB) használtunk. A fehérjéket vizualizáltuk, és a relatív sávintenzitást megmértük egy Odyssey infravörös képalkotó rendszeren (LI-COR Biosciences).

Bioszenzor elemzés
ELISA-k a receptor aktiválásához

A HMVEC-ket 10 percig növekedési faktorokkal stimuláltuk, és a Total és Phospho VEGFR-2 vagy VEGFR-3 ELISA-kban (R&D Systems, Minneapolis, MN) használt mintákat a gyártó utasításainak megfelelően.

Heparin affinitáskromatográfia

A fehérjéket 1 ml-es heparin-Sepharose oszlopra (GE Healthcare) töltöttük. Az oszlopot PBS-sel mossuk a meg nem kötött fehérje eltávolítása céljából, és a megkötött fehérjét 0,1-2,0 M NaCl gradienssel PBS-ben 2 ml-es frakciókban eluáljuk, majd ezt követően Western-blot-analízissel analizáljuk.

Neuropilinekhez való kötődés

A VEGF-D származékok neuropilinekhez való kötődését a patkány neuropilin-1 vagy humán neuropilin-2 extracelluláris doménjeiből és az emberi IgG Fc részéből (R&D Systems, Minneapolis, MN) tartalmazó fúziós fehérjék alkalmazásával értékeltük, ahogy azt korábban leírtuk (34). ).

Egér tumor Xenograft modell

11–12 hetes nőstény SCID/NOD egereket (Animal Resources Center, Perth, Ausztrália) használtunk. A daganatok 293EBNA-1 sejtvonalak szubkután injektálásával jöttek létre az egér szárnyába, és a tumor térfogatát a leírás szerint határoztuk meg (13). Minden vizsgálati csoport 10 egeret tartalmazott, és a kísérletet kétszer hajtották végre, hasonló eredményekkel. A PECAM-1 vagy LYVE-1 kimutatását szövetszelvényekben, immunváladékot és a tumorszövet Western blot-ját a VEGF-D fehérjék szintjének figyelemmel kísérésére és a daganatos sejtek kimutatását a nyirokcsomókban a korábban leírtak szerint végeztük (34), amikor az elsődleges tumorok elérték ∼ 2500 mm 3. A statisztikai elemzések a korábban leírtak szerint történtek (34).

EREDMÉNYEK

VEGF-D propeptid mutánsok expressziója és receptor kötése

A propeptidek szerepének tanulmányozásához a VEGF-D molekuláris kölcsönhatásaiban és biológiai funkcióiban olyan mutánsokat hoztak létre, amelyekben bármelyik propeptidet deletálták, és a fennmaradó propeptid feldolgozási helyét a folyamat blokkolásához mutálták. Ezeket a FLAG oktapeptiddel jelölt fehérjéket VEGF-DΔNIISS és VEGF-DΔCSSTS-nek neveztük el, és az 1. ábrán láthatók. Ezeknek a fehérjéknek a expressziója 293F vagy 293EBNA-1 sejtekben és redukáló SDS-PAGE elemzés azt mutatta, hogy a VEGF-DΔNIISS és a VEGF-DΔCSSTS alegységei ~ 43 kDa, illetve ~ 31 kDa voltak (1. B ábra), amint az várható volt a VHD és a propeptidek ismert mérete alapján (28). Egyik fehérjét sem dolgozták fel érett VEGF-D előállítására, amelynek alegysége ~ 21 kDa (5).

A VEGF-D propeptidek meghatározzák a receptor heterodimerizációját és a neuropilinekkel való kölcsönhatásokat

A VEGF-D indukálja a VEGFR-2/VEGFR-3 heterodimerek képződését az endoteliális sejteken, amelyekről azt gondolják, hogy pozitívan szabályozzák az angiogén csírázást (39), bár nem volt világos, hogy a VEGF-D mely formái elősegítik ezt a heterodimerizációt. A propeptidek VEGFR-2/VEGFR-3 heterodimerek képződésére gyakorolt ​​hatásának monitorozásához a HMVEC-ket stimuláltuk VEGF-D variánsokkal, a receptor heterodimereket pedig immunprecipitációval és Western blot-nal értékeltük (2. ábra A). A VEGFR-2/VEGFR-3 heterodimereket VEGF-DΔNIISS vagy VEGF-DΔCSSTS indukálták 500 ng/ml koncentrációban, de nem 200 ng/ml koncentrációban (az adatokat nem mutatjuk be). Ezzel szemben a receptor heterodimereket nem figyelték meg VEGF-DSSTS.IISS stimulációval 500 ng/ml koncentrációban. A korábbi vizsgálatok (39) elvárásai szerint a VEGF-DΔNΔC 200 ng/ml koncentrációban indukálta a receptor heterodimereket. A VEGFR-2 és a VEGFR-3 tirozin-foszforilációját a vizsgált VEGF-D minden formájára válaszul figyelték meg (2. A ábra), azzal a kivétellel, hogy a VEGF-DSSTS.IISS nem indukálta a VEGFR-2 foszforilezését. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a VEGF-DΔNIISS és a VEGF-DΔCSSTS aktiválja a VEGFR-2 és a VEGFR-3-t, és ösztönzi a heterodimer képződését, de arra utalnak, hogy a mindkét propeptid eltávolítására irányuló feldolgozás fokozza ezeket a hatásokat.

Beszámoltak arról, hogy a részben feldolgozott, de nem teljes hosszúságú VEGF-D megköti a neuropilin (NP) 1 és az NP2-t (34, 40), amelyek társreceptorként működnek a VEGFR-2 és a VEGFR-3 (41, 42) és kulcsmolekulák az erek és a nyirokerek fejlődésében (43, 44). A VEGF-D NP-hez való kötõdésének további jellemzésére teszteltük a VEGF-D variánsok azon képességét, hogy megkötjék az NP1 vagy NP2 extracelluláris doménjeibõl és az emberi IgG1 Fc részébõl álló fúziós fehérjéket (2. B ábra). Ezeket a kísérleteket heparin jelenlétében vagy távollétében hajtottuk végre, amely molekula szükséges lehet a VEGF-C NP1-hez való kötődéséhez (40). A VEGF-DΔNIISS nem kötötte sem az NP1, sem az NP2 konstrukciót, függetlenül a heparin jelenlététől vagy hiányától, ugyanakkor a VEGF-DΔCSSTS mindkét konstrukciót megkötötte. A heparin kissé fokozta a VEGF-DΔCSSTS kötődését az NP2-hez, de az NP1-hez nem. Az NP-ket megkötő VEGF-D domén (i) további értékeléséhez NP konstrukciókat használtunk a VEGF-DΔNΔC kicsapására. A VEGF-DΔNΔC az NP1-et és az NP2-t egyaránt megkötötte, ezeket a kölcsönhatásokat kissé fokozta a heparin. A VEGF-DΔCSSTS kötődése az NP1-hez és az NP2-hez azonban intenzívebb sávokat generált, jelezve, hogy az N-terminális propeptid fokozza az NP-kölcsönhatásokat.

A C-terminális propeptid közvetíti a heparinkötést

A heparin-kötés elemzése. A VEGF-D variánsok és a VEGF-A165 heparinhoz való kötődését affinitáskromatográfiával elemeztük. A tisztított fehérjéket heparin-Sepharose oszlopokra töltöttük, és megkötött fehérjét tartalmazó átfolyást (FT) gyűjtöttünk. A megkötött fehérjéket az oszlopokról eluáljuk növekvő NaCl-koncentrációjú pufferekkel (M), amint azt a blotok fentebb jeleztük. A frakciókat SDS-PAGE és Western blot redukálásával elemeztük FLAG-t célzó antitestekkel, a VEGF-D variánsok kimutatására, vagy anti-VEGF-A antitesttel. Összehasonlításképpen azokat a tisztított fehérjemintákat (S) mutatjuk be, amelyeket még nem heparin-Sepharose affinitáskromatográfiának vetettek alá. A molekulatömeg-markerek mérete (kDa) balra látható.

A propeptidek befolyásolják az elsődleges tumor növekedését és az angiogenezist

A daganatokban lévő erek endotheliumát immunfestéssel kvantitáltuk a PECAM-1-re (4. ábra D). Statisztikailag nem volt szignifikáns különbség a festés során a VEGF-DΔNΔC és a VEGF-DΔCSSTS daganatok között, és mindkét tumorcsoport szignifikánsan több erek endotheliumot tartalmazott, mint a VEGF-DΔNIISS vagy a Vector Control tumorok. Tekintettel arra, hogy a VEGF-DSSTS.IISS nem segíti elő az angiogenezist ebben a modellben (34), ezek az adatok azt jelzik, hogy a C-terminális propeptid, de nem az N-terminális propeptid eltávolítása a teljes hosszúságú VEGF-D-ből elősegíti az angiogenezist, amely valószínűleg vezetett a VEGF-DΔCSSTS daganatok gyors növekedéséhez.

A propeptidek befolyásolják a nyirokcsomó metasztázisát és a tumor lymphangiogenesisét

Mivel a VEGF-D elősegítheti a nyirokcsomó áttétet (13), az axilláris nyirokcsomókat olyan tumorsejtek jelenlétére vizsgálták, amelyek sötét festésük, megnagyobbodott magjaik és szabálytalan alakjuk miatt könnyen azonosíthatók (5. ábra A). A VEGF-DΔNΔC expressziója daganatokban szignifikánsan fokozta a nyirokcsomó metasztázisát a Vector Control tumorokhoz képest, amelyek nem mutattak áttétes terjedést a nyirokcsomókba (5. ábra B). Amikor a daganatok VEGF-DΔNIISS-t vagy VEGF-DΔCSSTS-t expresszáltak, metasztatikus terjedés lépett fel a nyirokcsomókba, de szignifikánsan csökkent a VEGF-DΔNΔC tumorokhoz képest. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy mindkét propeptid eltávolítása szükséges a VEGF-D számára a nyirokcsomó metasztázis leghatékonyabb elősegítéséhez.

VITA

Az NP1 és NP2 a VEGFR-2 és a VEGFR-3 együttes receptoraként hat (41, 42), és fontosak az embriogenezis során az erek és a nyirokerek fejlődésében (43, 44). Már ismert volt, hogy a teljes hosszúságú VEGF-D nem képes megkötni az NP-ket, de a C-terminális propeptid feldolgozása lehetővé teszi a kötődést (34, 40). Itt megmutatjuk, hogy az érett VEGF-D megköti mind az NP1-et, mind az NP2-t, és hogy a kötődést mindkét receptorra fokozza az N-terminális propeptid jelenléte (azaz a VEGF-DΔCSSTS jobban kötődik, mint a VEGF-DΔNΔC). A C-terminális propeptid azonban gátolja a kötődést mindkét NP-hez, vagyis a VEGF-DΔNIISS nem képes megkötni az NP-ket a VHD jelenléte ellenére. A C-terminális propeptid gátló hatása azt is megmagyarázza, hogy a teljes hosszúságú VEGF-D miért nem köti meg az NP-ket.

Adataink azt mutatják, hogy a VEGF-D propeptidjei a VEGF receptor heterodimerizációjának, valamint a neuropilin ko-receptorokkal és a heparinnal való kölcsönhatások kritikus meghatározói. A propeptidek mély hatást fejtenek ki a VEGF-D tumor angiogenezist és lymphangiogenesist elősegítő képességére, és ezáltal elősegítik a rák növekedését és terjedését.

* Ezt a munkát az ausztrál Nemzeti Egészségügyi és Orvosi Kutatási Tanács programtámogatása és kutatási ösztöndíjai (az SAS-nak és az MGA-nak), egy melbourne-i kutatási ösztöndíj (az NCH-nak) és a viktoriánus kormány által biztosított operatív infrastruktúra-támogatási program támogatásával támogatta., Ausztrália. S. A. S. és M. G. A. a rákellenes terápiákat fejlesztő vállalat, a Vegenics Ltd. tanácsadói.

Ez a cikk tartalmazza az S1 kiegészítő ábrát.