A venezuelai lovak encephalitis elleni új vakcina egyesíti a DNS-immunizálás előnyeit és az élő attenuált vakcinát

Irina Tretjakova

1 Medigen, Inc., 4539 Metropolitan Court, Frederick, MD 21704, USA

Igor S. Lukashevich

2 University of Louisville, 505 S Hancock St., Louisville, KY 40202, USA

Pamela Glass

3 amerikai hadsereg fertőző betegségek orvosi kutatóintézete, 1425 Porter St., Frederick, MD 21702, USA

Eryu Wang

4 Intézet az emberi fertőzésekért és immunitásért, Sealy Vakcinák Fejlesztési Központja és Patológiai Osztály, Texas Egyetem Orvosi Osztálya, GNL, 301 University Blvd., Galveston, TX 77555, USA

Scott Weaver

Pushko Péter

1 Medigen, Inc., 4539 Metropolitan Court, Frederick, MD 21704, USA

Absztrakt

1. Bemutatkozás

A kísérleti, élő attenuált TC-83 vakcina [12] jelenleg az egyetlen élő vakcina, amelyet Investigational New Drug (IND) protokoll alapján használnak a veszélyeztetett egészségügyi személyzet immunizálására [7, 13, 14]. A TC-83 vakcina védelmet nyújt a VEEV komplex [15] számos epizootikus vírusa ellen, beleértve az IAB-t, az IC-t és az IE-t. Az oltás azonban az oltottak körülbelül 23% -ánál káros hatásokat, például fejfájást és lázat okozhat. A vakcinázottak további körülbelül 18% -ánál nem alakul ki elegendő semlegesítő antitest-titer [16]. A TC-83 vírus genetikai megfordulása káros hatásokkal járt [17]. Az RNS vírusok magas mutációval rendelkeznek [18, 19], amelyek hozzájárulnak a genetikai instabilitáshoz és a potenciálisan káros mutációk felhalmozódásához a vírus passzálásai során a vakcina előállításához.

Hosszú klinikai alkalmazásának köszönhetően a TC-83 logikus kiindulópontot jelent a VEEV elleni biztonságosabb és jobb vakcina előállításához [17]. Itt egy új immunizációs DNS (iDNA) vakcina platformot írunk le, amely potenciálisan képes leküzdeni a TC-83 vakcina gyengeségeit azáltal, hogy egyesíti a DNS immunizálás előnyeit az élő attenuált vakcina hatékonyságával. A pTC83 iDNS vakcina egy rekombináns plazmid, amely a TC-83 vírus teljes genomiális RNS-ét kódolja eukarióta promoter irányítása alatt. Vakcinázás után az iDNS plazmid in vivo a vírus RNS transzkripcióját hajtja végre, és egy genetikailag meghatározott, TC-83-szerű vakcinavírus korlátozott replikációját indítja el. Így egy élő attenuált vakcinát indítanak el az iDNS-ből in vivo, nincs szükség külső sejtszubsztrátokra vagy vírusátjárásokra az oltóanyag előállításához, ami minimalizálja a megfordulás vagy káros hatások lehetőségét, biztosítja a genetikai stabilizációt és hatékony immunizációt eredményez. Így az iDNS vakcina technológia lehetővé teszi a DNS immunizálás hatékony átalakítását erősen immunogén élő, legyengített vakcinává, és egyesíti mindkét vakcina platform előnyeit.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Sejtek és vírusok

A baba hörcsög vese (BHK-21), a kínai hörcsög petefészke (CHO) és a Vero sejtvonalakat az American Type Culture Collection (Manassas, VA) sejtekből nyertük, és párásított inkubátorban 37 ° C-on, 5% CO2-ban αMEM-ben kiegészítve. 10% szarvasmarha-magzati szérum (FBS) és gentamicin-szulfát (10 ug/ml) (Life Technologies, Carlsbad, CA). A TC-83 élő attenuált vakcinát az Egyesült Államok hadseregének Orvosi Kutatási és Materiális Parancsnokságától (Fort Detrick, MD) szereztük be, egyszer CHO sejtekben amplifikáltuk és -80 ° C-on tároltuk. izolátum egy járványból/járványos állatból [20], egy szokásos provokációs állomány, amelyet az amerikai hadsereg fertőző betegségekkel foglalkozó orvosi kutatóintézetében (USAMRIID, Fort Detrick, MD) használtak. A VEEV 3908 törzs vírus, egy 1995-ös epidémiás altípusú IC izolátum (Weaver et al., 1996), egy szokásos provokációs állomány, amelyet a Texasi Egyetem Orvosi Osztályában (UTMB, Galveston, TX) használtak.

2.2. Plazmidok és iDNS előállítás

A TC-83 vakcinavírust CHO sejtekben szaporítottuk 75 cm 2 -es lombikban. A fertőzés után 48 órával a vírust összegyűjtöttük, tisztítottuk és -80 ° C-on 1 ml-es alikvotokban lefagyasztottuk. A vírusos RNS-t a Trizol LS (Life Technologies) segítségével extraháltuk. Négy cDNS-fragmenst állítottunk elő egylépéses RT-PCR rendszer alkalmazásával specifikus oligonukleotid primerekkel. Ezután a cDNS-fragmenseket a pcDNA3.1-ből származó plazmidba állítottuk össze CMV-promóter ellenőrzése alatt.

2.3. Transzfekciók és in vitro vizsgálatok

A CHO és Vero sejteket transzfektáltuk az iDNS plazmid elektroporációjával 8 ng és 5 ug közötti koncentrációban 75 cm 2 -es lombikokban. A CHO és a Vero sejtek transzfekciója lényegében a korábban leírtak szerint történt [21]. Kontrollként a sejteket 10-10-10 PFU TC-83 vírussal fertőztük. A vírusnövekedési görbék esetében a vírusmintákat meghatározott időközönként gyűjtöttük be, és két példányban kvantáltuk őket standard plakk-vizsgálattal Vero sejtekben.

2.4. Védőoltások és kihívás

Az iDNS plazmidot izoláltuk az E. coliból endotoxinmentes módszerrel (Qiagen, Valencia, Kalifornia), és foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) formuláztuk 1 mg/ml koncentrációig. Az oltások előtt három hetes nőstény BALB/c egereket izofluránnal altattunk. Az egereket intramuszkulárisan (i.m.) 50 µl iDNS-sel oltottuk be a mediális combokban, majd in vivo elektroporációt folytattunk 100 V amplitúdón, 50 ms impulzus időtartammal és 200 msec impulzusok közötti intervallummal. A kontrollok hasonló módon kaptak nem rokon pcDNS3.1-alapú plazmid DNS-t PBS-ben. Az állatokat az injekció beadásának helyén kéttűs elektróddal és négyszögletes elektroporátorral (ECM 830, BTX Genetronics, San Diego, CA) használtuk. Vérmintákat gyűjtöttünk a retro-orbitális sinusból a virémia kimutatására az oltás után 3 napig a plazma vírus Vero sejtekkel történő amplifikálásával. Annak megerősítésére, hogy az iDNS-ből in vivo indított vakcinavírus fenntartotta a TC-83 E2 szekvenciát, a plazma vírusból származó E2 gént a következő primerek felhasználásával amplifikálták: 8559-GGAGATCCACCGAGGAGCTG-8578; 9157-GGAATGCGAGTGTGGCGGCAC-9177; 9190-GGCGGCACAAAGATCTCCGAG-9170; és 9850-GCCGAGACCACCTGGGAGTCC-9830. Az E2 cDNS-fragmenseket klónoztuk a pCR2.1-TOPO-ba, és meghatároztuk a DNS-szekvenciát.

A vakcinázást követően az állatokat naponta megfigyelték a fertőzés klinikai jeleit illetően, és a testtömeget az oltást követő 1. – 7., 14. és 21. napon határozták meg. A szérumokat a vakcinázást követő 21. napon gyűjtöttük össze, nem sokkal a vírusfertőzés előtt. Western-blotot, plakk-redukciós semlegesítési vizsgálatot (PRNT) és közvetett immunfluoreszcencia-vizsgálatot (IFA) végeztünk a TC-83 elleni antitest-válaszok meghatározására. Az egereket ezután BSL3-létesítménybe helyeztük, és virulens VEEV 3908 törzzsel fertőztük 105 pFU dózisban 100 ul-ban, szubkután (s.c.) úton. Vérmintákat vettünk a virémia kimutatására a fertőzés után 3 napig. Az elektroporáció helyett a BALB/c/egerek pTC83-mal történő iDNS-oltását in vivo transzfekciós reagens alkalmazásával hajtottuk végre. A TransIT gén-szállító polimert (Mirus, Madison, WI) használtuk az iDNS vakcina intravénás (i.v.) transzfektálására a gyártó utasításai szerint. Az oltott és a kontroll állatok közötti vírustiter-különbségek statisztikai szignifikanciáját Student t-tesztjével határoztuk meg.

2.5. Szerológia

A TC-83 vírus elleni semlegesítő antitesteket a Vero sejtekben a PRNT80 segítségével határoztuk meg. A szerológiai vizsgálatok tartalmazzák a Western blotot és az IFA-t is. A Western blot esetében a TC-83 vírusfehérjéket 4–12% -os gradiens SDS-PAGE alkalmazásával szétválasztottuk és egér antiszérummal vizsgáltuk. Az IFA esetében CHO sejteket növesztettünk 8 üregű kamrákon, és a vírusmintákat 10-szeres hígítással hígítottuk a 10% FBS-t tartalmazó αMEM-ben, és abszorbeáltuk (0,1 ml/üreg) CHO sejt monorétegekre 1 órán át 37 ° C-on. . Ezután lyukanként 0,3 ml táptalajt adunk hozzá, és az inkubálást a megadott ideig folytatjuk. A sejteket hideg acetonnal fixáltuk és antiszérummal vizsgáltuk, majd fluoreszceinnel jelölt IgG (H&L) követte őket.

3. Eredmények

3.1. PTC83 iDNS előállítása

RT-PCR-rel TC-83 vírusos RNS-ből származó négy cDNS-fragmenst kombináltunk a pcDNA3.1-ből származó plazmidba, amelynek eredményeként a pTC83 iDNS-plazmid a TCV-83 genomiális RNS teljes hosszúságú cDNS-jét tartalmazta a CMV-fő fő közvetlen korai promoter (1a. ábra). Mivel az RNS hiteles 5 ’és 3’ vége kritikus fontosságú az alphavirus replikációja szempontjából [8], a CMV promoter és az RNS polimeráz transzkripció megkezdése közötti távolságot optimalizálták a funkcionális TC-83 genomi RNS transzkripciójának biztosítása érdekében. A hepatitis delta vírusból származó ribozim szekvenciát inszertáltuk a TC-83 3’-terminális poli-A szekvenciától lefelé.

a) A pTC83 plazmid sematikus ábrázolása. A teljes hosszúságú TC-83 klón előállításához használt restrikciós helyeket jelezzük.

(b) pTC83 iDNS-sel transzfektált CHO sejtek indirekt immunfluoreszcencia vizsgálata (IFA). Az IFA-t 24 órával (bal panel) és 48 órával az elektroporáció után végeztük. A transzfektált sejtekben a sejtmagok megjelenítéséhez a 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) festést alkalmaztuk.

(c) pTC83 iDNS-sel (bal panel) transzfektált CHO sejtek Western-blotja és a pTC83 iDNS-sel transzfektált CHO sejtek felülúszójának plakk-vizsgálata (jobb oldali panel). A Western blotot az elektroporáció után 24 órával végeztük ATCC antiszérummal a VEEV ellen. A plakk-vizsgálatot Vero sejt monorétegekben végeztük.

(d) Az iDNS-eredetű TC-83 vírus replikációja fertőzött Vero sejtekben. A Vero sejteket 100 PFU iDNS-eredetű TC-83 vírussal fertőztük. A plakk-titert két példányban határoztuk meg, a hibasávok a látható log-skálán nem láthatók.

3.2. Vírus előállítás iDNS-ből in vitro

A pTC83 iDNS vakcinát elektroporációval transzfektáltuk CHO sejtekbe. A transzfektált sejteket kamra tárgylemezekre oltottuk és a TC-83 antigének expresszióját IFA-val detektáltuk 24 órával a transzfekció után ATCC TC-83-specifikus nyúl antiszérum alkalmazásával (1b. Ábra). A TC-83 antigéneket a transzfektált sejtek citoplazmájában expresszáltuk. 48 órára az összes sejt pozitív volt a TC-83 antigénekre, ami megerősítette a vírus replikációját (1b. Ábra). A TC-83 fehérjék expresszióját SDS-PAGE és Western blot segítségével igazoltuk (1c. Ábra). A transzfektált Vero sejtek eredményei hasonlóak voltak a CHO sejtekhez (az adatokat nem mutatjuk be). A replikáló vírus jelenlétét a sejttenyészet táptalajmintáinak közvetlen lepedékvizsgálatával (1c. Ábra), valamint a vírus amplifikációjával és növekedési görbével igazoltuk a Vero sejtek fertőzésével (1d. Ábra). Az amplifikációhoz és a növekedési görbéhez a Vero sejteket beoltottuk 100 pFU vírussal, amelyet pTC83 iDNS-sel transzfektált CHO sejtekből gyűjtöttünk be. Az inkubálást 72 órán át folytattuk. A korábbi megfigyelésekkel [22] összhangban a vírus gyorsan szaporodott, és a Vero sejtekben 30 9 óra utáni fertőzés után 10 9 PFU/ml titert ért el (1d. Ábra).

a) 5 µg vagy 1 µg iDNS-sel (felső panel) vagy 105 PFU TC-83 vírussal (alsó panel) transzfektált CHO sejtek IFA-ja.

(b) A TC-83 vírusok növekedési görbéi vírussal fertőzött és iDNS-sel transzfektált CHO sejtekben. A bal oldali panelen a CHO sejteket vagy 10 4-105 PFU vírussal fertőztük meg, vagy 0,2-5 ug pTC83 iDNS-sel transzfektáltuk. A jobb oldali panelen a CHO sejteket 8 ng - 1 ug pTC83 iDNS-sel transzfektáltuk. A plakk-titert két példányban határoztuk meg, a hibasávok nem láthatók a bemutatott skálán.

3.3. Az iDNS-ből in vitro előállított vírusokat egerekben gyengítik

Annak megerősítésére, hogy az iDNS-ből származó TC-83 vírusnak in vivo fenotípusa gyengült, a pTC83 iDNS-sel transzfektált CHO sejtekből gyűjtött vírust használtuk. Röviden, 10 4 PFU-t oltottunk szubkután (sz.c.) 10 BALB/c egérbe a BSL3 laboratóriumban. Kontroll céljából tíz BALB/c egeret oltottunk be hasonlóan 104 PFU virulens IAB Trinidad VEEV törzzsel. Az összes kontroll állat, amely Trinidad VEEV törzset kapott, az oltás után a 7. napra elpusztult (1. táblázat). Ezzel szemben az összes iDNS-eredetű vírussal oltott egér egészséges maradt, és nem volt kimutatható káros hatása, ami a vírus erősen gyengített fenotípusát mutatja BALB/c egerekben.

Asztal 1

A pTC83 iDNS-ből in vitro származó vírus gyengül a BALB/c egerekben.

VirusDoseRouteMorbidityMortality

I-DNS-ből származó TC-83 vírus a	10 4 PFU	s.c.	0/10	0/10
VEEV, Trinidad törzs	10 4 PFU	s.c.	10/10	10/10

3.4. Vírus előállítása iDNS-ből in vivo

(a) Viremia kimutatása a pTC83 iDNS-vel oltott BALB/c egerekből gyűjtött plazmamintákból. A BALB/c egereket intravénásán (i.v.) injektáltuk pTC83 iDNS és TransIT transzfekciós reagens (Mirus, Madison, WI) keverékével. A plazmamintákat az oltás utáni 1. napon gyűjtöttük és Vero sejtekkel inkubáltuk a vírus amplifikációja céljából. A 3. napon a táptalajt összegyűjtöttük és plakk-titrálással vizsgáltuk Vero sejt monorétegek alkalmazásával. Bal oldali panelen az iDNS-be oltott egerek plazmájából nyert TC83 vírus. Jobb oldali panel, a vírus kinyert a plazmából a VEEV TC-83 prototípusú vakcinával végzett immunizálás után.

(b) IFA segítségével szérum antitest kimutatása a pTC83 iDNS-vel oltott BALB/c egerek 1–10-es plazmamintáiból. Tíz BALB/c egeret vakcináztunk elektroporációval pTC83 iDNS-sel. Az egyes egerek plazmamintáit a vakcinázást követő 21. napon gyűjtöttük össze, és TC-83-vírussal fertőzött CHO-sejtek egyrétegűivel vizsgáltuk MOI = 0,1-nél. A plazmamintákat 1:20 hígítás mellett alkalmaztuk.

3.5. Az iDNS vakcina immunogenitása és hatékonysága egerekben

A BALB/c egerek túlélése a VEEV-sel való fertőzés után. Az egereket elektroporációval vakcináztuk 50 ug pTC83 iDNS-sel. A vakcinázást követő 28. napon az egereket a BSL3-létesítménybe vitték, és megfertőzték s.c. 10 5 PFU VEEV vírussal. Az egereket naponta ellenőrizték a betegség és a halál jelei szempontjából. A kontroll egereknél egyenletes letalitást figyeltünk meg, míg az összes iDNS-vel oltott egér túlélte a fertőzést.

2. táblázat

A pTC83 iDNS vakcina immunogenitása és hatékonysága BALB/c egerekben.

4. Megbeszélés

Feltételezzük továbbá, hogy az iDNS stimulálhatja az immunrendszert bakteriális eredetű metilálatlan CpG motívumok és/vagy a DNS kettős szálú szerkezete révén, amelyek elméletileg javíthatják az immunogenitást és csökkenthetik a nem reagálók számát, bár ezt még tesztelni kell. A kettős szálú DNS aktiválja az interferon gének/TANK-kötő kináz 1 (STING/TBK1) -függő veleszületett immunjelző utak stimulátorát. A STING/TBK1 útvonal által in vivo indukált I-típusú interferonokat (IFN-ek) kulcsfontosságúnak találták mind a közvetlen, mind a közvetett antigén-prezentáció szempontjából különféle sejttípusokon keresztül, beleértve a dendritikus és izomsejteket is [50, 51]. Az IFN és az IFN által kiváltott útvonalak részt vesznek a TC-83 oltásban [38]. Más immunmodulátorok is szerepet játszhatnak a vírus replikációjában [52].

Összefoglalva, az iDNS genetikai és kémiai stabilitással rendelkezik a DNS vakcinák között, a hideg láncra nincs szükség. Ez fontos a meleg éghajlattal és korlátozott hidegláncú infrastruktúrával rendelkező VEEV földrajzi területek számára. Továbbá, hasonlóan az élő vakcinákhoz, az iDNS is erős védőimmunitást indukálhat az egyadagos vakcinázást követően, amint ez a tanulmány bemutatja. Tudomásunk szerint ez az első jelentés a meglévő klinikai élő attenuált vakcina in vivo bejuttatásáról DNS-immunizáció alkalmazásával. További kísérletekre van szükség, ideértve a nagyobb dózisú vagy a VEEV több altípusával járó kihívásokat, az immunválasz hosszú élettartamának tanulmányozását, az iDNS vektor in vivo perzisztenciáját és a szervek vizsgálatát a vírus replikációs jeleire az iDNS-sel történő oltást követően. Az iDNA platform konfigurálható más élő attenuált vírusoltásokra, és javíthatja azok termelését a hagyományos gyártási folyamat számos lépésének kiküszöbölésével.

Fénypontok

Újszerű iDNA platformot használtak a VEEV alfavírus elleni vakcinázáshoz

Kevesebb mint 10 ng pTC83 iDNS indította el a vakcinavírus replikációját in vitro