A Spexin egy újszerű emberi peptid, amely csökkenti a hosszú láncú zsírsavak zsírsejtek felvételét és súlyvesztést okoz az étrend okozta elhízással rendelkező rágcsálóknál *

José L. Walewski

1 Orvostudományi Kar, Columbia Egyetem Orvosi Központ, New York, NY 10032

Fengxia Ge

1 Orvostudományi Kar, Columbia University Medical Center, New York, NY 10032

Harrison Lobdell, IV

1 Orvostudományi Kar, Columbia Egyetem Orvosi Központ, New York, NY 10032

Nancy Levin

2 CovX Pharmaceuticals, San Diego, CA 92121

Gary J. Schwartz

3 Élettani Tanszék, Albert Einstein Orvostudományi Főiskola, Bronx, NY 10461

Joseph Vasselli

4 The New York Obesity Nutrition Research Center, St. Luke's Hospital, New York, NY 10025

Afons Pomp

5. sebészeti osztály, The Weil-Cornell Medical Center, New York, NY 10021

Gregory Dakin

5. sebészeti osztály, The Weil-Cornell Medical Center, New York, NY 10021

Paul D. Berk

1 Orvostudományi Kar, Columbia Egyetem Orvosi Központ, New York, NY 10032

Társított adatok

Absztrakt

Célkitűzés

A microarray vizsgálatok szerint a Ch12: orf39 (Spexin) az elhízott emberi zsírban a leginkább szabályozatlan gén. Ezért megvizsgáltuk annak szerepét az elhízás patogenezisében.

Tervezés és módszerek

A táplálékbevitelre, az étkezési szokásokra, a testtömegre, a légzéscsere arányra (RER) és a mozgásszervi aktivitásra gyakorolt spexin hatásokat elektronikusan követtük nyomon C57BL/6J egerekben vagy Wistar patkányokban, akik étrend okozta elhízással (DIO). Meghatároztuk az adipocita [3H] -oleaát felvételére gyakorolt hatását.

Eredmények

Emberekben a Spexin gén expressziója 14,9-szeres mértékben volt szabályozva az elhízott omentális és szubkután zsírban. A keringő Spexin párhuzamosan változott, korrelált (r = −0,797) a Leptinnel. Patkányokban a Spexin (35 μg/kg/nap s.c.) csökkentette a kalóriabevitelt

32% megfelelő súlycsökkenéssel. Az étkezési minták nem változtak. Egerekben a Spexin (25 μg/kg/nap i.p.) szignifikánsan csökkentette az éjszakai RER-t és fokozta a mozgást. A spexin in vitro inkubálása jelentősen gátolta a megkönnyített zsírsav (FA) felvételt a DIO egér adipocitákba. A kondicionált ízkerülés-teszt (70 μg/kg/nap i.p.) nem mutatott ki averzív Spexin hatást.

Következtetések

Az elhízott emberi zsírban a spexin gén expressziója jelentősen csökkent. A peptid fogyást eredményez a DIO rágcsálókban. Az étvágyra és az energiaszabályozásra gyakorolt hatása feltehetően központi; azok, akik az adipocita FA felvételén vannak, közvetlennek és periférikusnak tűnnek. A spexin egy új hormon, amely részt vesz a súlyszabályozásban, és potenciálisan képes elhízási terápiára.

BEVEZETÉS

Az elhízás világméretű járványa várhatóan a 21. század egyik legnagyobb közegészségügyi kihívása marad. Különösen az Egyesült Államokban tapasztalható elhízási járvány, amelynek mély következményei vannak (1), pl.

Évente 300 000 haláleset (2), a várható élettartam csökkenése (3) és óriási egészségügyi költségek (4). Az elhízás számos olyan betegség előfordulásának jól dokumentált növekedésével függ össze, amelyek túlzott morbiditást és mortalitást okoznak (5).

A fehér zsírszövet (WAT) fontos szerepet játszik az energiatárolásban. Ezen túlmenően a különféle WAT-raktárak „endokrin szervként” is működnek azáltal, hogy szekretálják az adipokinek egyedi profiljait, több mint 50 citokin, kemokin és sokféle hormonszerű faktor sokféleségű gyűjteményét, amelyek hozzájárulnak az energia homeosztázis fenntartásához. Noha nem kifejezetten WAT-ok fejezik ki, kimutatták, hogy egyes lokálisan szekretált adipokinek befolyásolják az étvágyat, a jóllakottságot, valamint a glükóz- és lipid-anyagcserét (6). Ezen adipokinek közül sokan végső soron integrálódnak a glükóz- és energia-anyagcsere, a hosszú láncú zsírsavfelvétel (LCFA) felvétele és tárolása, valamint az inzulinaktivitás szabályozására mind parakrin, mind endokrin mechanizmusok révén.

2008 óta a laboratóriumunkban végzett mikroarray vizsgálatok, amelyek összehasonlítják az elhízott és a nem elhízott emberi omentális és szubkután zsír gén expresszióját, azonosítottak mind az egyes géneket, mind a biológiai útvonalakat, amelyek komponensei jelentősen szabályozatlanok az elhízott zsírban. A legkorábbi tanulmányaink között a szondákkal ellátott tömbök használata a

55K gént és EST-t azonosítottunk

3500 gén és EST, amelyek jelentős különbségeket mutatnak az expresszióban (7). Ezek közül a leginkább lefelé szabályozott gén a Ch12: orf39 volt, amelynek mRNS-ét 14,9-szeres mértékben fejezték ki elhízott zsírban. Úgy tűnik, hogy egy szekretált peptidet kódol, amelyet később azonosítottunk a Spexinnel, egy új peptiddel, amelyet Mirabeau és mtsai 2007-ben azonosítottak Markov-modellezéssel (8).

Az a tény, hogy az elhízott emberi zsírban a Spexin volt az egyetlen leginkább szabályozott gén, Mirabeau és munkatársai megfigyeléseivel párosulva, miszerint a Spexin in vitro muszkarinszerű összehúzódásokat indukált a gyomor simaizomzatában (8), arra késztetett bennünket, hogy feltételezzük, hogy normálisan az adipociták által expresszált jóllakottsági tényező, és hogy az elhízott zsírok Spexin-expressziójának hiánya egy kulcsfontosságú adipokin elvesztéséhez vezethet, amely potenciálisan szerepet játszik a bélmozgás, az élelmiszer-bevitel, az energia-anyagcsere és a hosszú láncú zsírsavak (LCFA) felvételében és tárolásában. zsírsejtekben. Ezért biológiai szerepének meghatározását tűztük ki az étrend okozta elhízás rágcsáló modelljeiben.

MÓD

Betegek

A klinikailag jelzett hasi laparoszkópos sebészeti beavatkozásokon átesett betegek hozzájárultak az omentális és a szubkután zsírminták eltávolításához az LCFA transzport tanulmányozásához, molekuláris vizsgálatokhoz és vénás vérmintához a keringő adipokinek méréséhez. Az elhízott betegek bariatéri sebészeti beavatkozásokon estek át, a nem elhízott betegek pedig más klinikailag jelzett laparoszkópos eljárásokon estek át a New York-i Presbiteriánus Kórház Weill Cornell vagy Columbia Presbiteriánus campusain. A tanulmányok protokolljait, beleegyezési dokumentumait és eljárásait a Columbia Egyetem és a Weill Cornell Orvosi Központok egyes intézményi felülvizsgálati testületei hagyták jóvá.

Anyagok

9,10- [3H] -olajsavat (OA) a NEN Life Science Products-tól (Boston, MA, USA), az I. típusú kollagenázt a Sigma-tól (St. Louis, MO, USA) és zsírsavmentes szarvasmarha-szérumot vásároltunk. albumin (BSA) Boehringer Mannheim-től (Indianapolis, IN, USA).

A Spexin két készítményét alkalmazták: az első a Phoenix Pharmaceuticals-tól (Burlingame, Kalifornia), a második pedig a Ferring Research Institute (San Diego, Kalifornia) egyedi szintézisterméke. Mindkettő> 99% -os tisztaságú volt HPLC-vel, és azonos volt LC/MS-vel.

Adipociták izolálása

Az emberi omentális és szubkután zsírbiopsziákból (9) és elhízott egerek (18 hetes) epididymális zsírpárnáiból (10) származó adipocitákat izoláltuk és méreteztük közvetlen fénymikroszkóppal a leírás szerint (9, 10).

Az LCFA felvételi kinetikájának tanulmányai

A humán és az egér adipociták mind a [3H] -OA felvételének kezdeti sebességét gyors szűréssel határoztuk meg (9, 11). Az egyes vizsgálati oldatokban a nem kötött oleaátkoncentrációt ([OAu]) az OA/BSA mólarány (11) (12) alapján számítottuk ki, Spector és munkatársai (13) LCFA/BSA kötési állandóinak felhasználásával. Az adatillesztéshez Berman és Weiss SAAM II programját használták (14).

Statisztikai szempontok

A fiziológiai változók értékeit, hacsak másképp nem jelezzük, átlag ± standard hibaként adjuk meg, és a leíró statisztikák standard módszereivel számoljuk (15). A csoportok közötti különbségek szignifikanciáját Student kétfarkú t-tesztjeivel értékeltük, szignifikánsnak tekintve a p ≤0,05 értéket.

Gén expressziós vizsgálatok

Egész emberi genom mikrorajz

Az elhízott és nem elhízott alanyok omentális és szubkután zsírmintáinak génexpresszióját teljes genom mikroarray elemzéssel hasonlítottuk össze, amint azt korábban részletesen leírtuk (7). A medián normalizált gén expressziós adatokat (tetszőleges expressziós egységeket) a GeneSifter Data csomag segítségével elemeztük, az eredmények statisztikai kezelésével, amint arról korábban beszámoltunk (7).

qRT-PCR

A spexin gén expresszióját ugyanazokban a zsírszövet mintákban és további elhízott és nem elhízott emberi omentális zsírszövetekben vizsgáltuk qRT-PCR-rel a korábban közölt módszerekkel (7). A PCR-re szánt Spexin primereket Primer 3 szoftver (v.0.4.0) felhasználásával terveztük meg a http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm címen. Hasonló módszereket alkalmaztunk a Spexin gén expressziójának tesztelésére egér epididymális zsírszövetekben. Az emberi és az egér Spexin specifikus primer szekvenciáit az 1. kiegészítő táblázat mutatja be. Kontrollként 18S RNS-t használtunk a génexpresszió normalizálására. Az átlagos hajtásváltozást (AFC) az egyes tesztgének és az egyes minták 18S közötti átlagos ΔCt különbség alkalmazásával számítottuk, azaz AFC = 2 - (átlagos ΔΔCt) .

Mennyiségi immunvizsgálatok

Kvantitatív immunvizsgálatokat a Spexin keringő szintjének meghatározása céljából kompetitív EIA (Cat # EK-023-81) és humán Leptin antigén elfogó ELISA (Cat # EK-003-12) segítségével végeztünk a Phoenix Pharmaceuticals-tól (Burlingame, CA) vásárolt készletekkel. Az ismeretlen mintákat két példányban mértük, és az OD értékeket kvantifikáltuk, összehasonlítva a vizsgálaton belüli standard görbékkel. A kvantitatív validálást „bekerülési” kísérletek is megerősítették, amelyek során ismert mennyiségű Spexin standardot adtak az egyes szérummintákhoz (lásd a Kiegészítő adatokat).

Anyagcsere értékelések DIO egerekben

A metabolikus és viselkedési méréseket a korábban leírtak szerint végeztük (16). Az egyedileg elhelyezett C57BL/6J egereket étrend okozta elhízással (DIO) vagy életkornak megfelelő kontrollokkal (Jackson Labs, Bar Harbor, ME, USA) magas zsírtartalmú étrenden (HFD, D12492, Research Diets, New Brunswick, NJ), amely az összes kalória 60% -át adta zsírként.

24 órás etetési viselkedés DIO patkányokban

Az elhízott (DIO) felnőtt nőstény Wistar patkányokat ad lib 60% HFD-n (D12492) tartották fenn egyedi kamrákban, ahol táplálkozási magatartásukat folyamatosan rögzítették egy BioDaq elektronikus táplálékfelvétel ellenőrző rendszeren keresztül (Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ).

Kondicionált ízkerülési vizsgálatok patkányokon

Kondicionált ízkerülési vizsgálatokat végeztek felnőtt nőstény Wistar patkányokkal, a bevett protokollok szerint (17-19). A kiképzéshez a patkányok 20 órán át (18:00 -14: 00 óra után) megfosztottak vizet, de nem táplálékot, majd 20 percig ad libitum egy üveg vizet kínáltak. Az edzés minden hét 2 napján zajlott, 3-4 napos időközönként, a normál táplálékfelvétel és a testsúly helyreállítása érdekében. Összesen 7 edzést hajtottak végre, mire minden állat megtanult azonnal inni, amikor folyadékot kínáltak.

EREDMÉNYEK

Az emberi zsír génexpressziós profilozása

Az elhízott és normál testsúlyú alanyok omentális és szubkután zsírmintáinak génexpresszióját teljes genom mikroarray elemzéssel hasonlítottuk össze (7). Az egyes próbákhoz tartozó medián normalizált génexpressziós arányokat, amelyek 55K ismert gént és EST-t képviselnek, log-log görbével hasonlítottuk össze ( 1A. Ábra ). A Ch12, ORF39 (Spexin) mRNS-je rendkívül szignifikáns 14,9-szeres expressziócsökkenést mutatott elhízva a nem elhízott zsírszövetekhez képest ( 1B. Ábra ), az elhízott emberi zsírban megfigyelt legnagyobb változás a génexpresszióban (p = 0,00292).

A) A nem elhízott zsírok és az elhízottak teljes genomjának mikroarray elemzése (log-log plot): a színes pontok jelentős különbségű géneket képviselnek (p 1C ábra ; p 2A ábra ). Ezenkívül a Spexin koncentrációk szignifikánsan negatívan korreláltak ( 2B. Ábra ) és a leptin koncentrációk pozitívan korreláltak ( 2C. Ábra ) ugyanazon betegek omenta adipocitáinak LCma felvételének Vmax értékével. A keringő Spexin-koncentrációkat szintén mértük 20 hetes DIO egerekben (2,24 ± 0,07 ng/ml, n = 17) és az életkornak megfelelő C57BL5/6J háttérkontrollokban (4,28 ± 0,48 ng/ml, n = 5) (Kiegészítő 1B. Ábra). Az emberi mintákhoz hasonlóan a keringő spexin koncentrációja szignifikánsan magasabb volt a nem elhízott kontroll egerekben, mint az elhízott DIO állatokban (p 3. ábra). Párhuzamos vizsgálatokban, amelyekben élelmiszer-fogyasztást is mértek, az élelmiszer-fogyasztás az idő múlásával fokozatosan csökkent a Spexinnel kezelt egerekben, de a PBS-sel kezelt kontrollokban lényegében változatlan maradt (2. kiegészítő ábra). Az elhízott DIO egerekkel ellentétben a normál testsúlyú C57BL/6J egerek nem fogyottak, ha hasonló dózisú spexinnel kezelték őket.

Felnőtt hím C57BL/6J DIO egerek (Jackson Labs) 10 napon keresztül napi Spexin injekciókat kaptak (25 μg/kg IP 0,1 ml 1X PBS-ben). A kontrollok napi IP injekciót kaptak a járműből. Minden egeret ad lib magas zsírtartalmú étrenden tartottunk (D12492, Research Diets, New Brunswick, NJ). A testtömegeket naponta mértük. Az adatok az alapváltozás átlagos változása ± SE, (n = 5/csoport). Az 1. nap az injekció első napja. Valamennyi Spexinnel kezelt állat fokozatosan fogyott (meredekség = - 0,1742 g/nap, r = - 0,8901). A kontrollok tovább növelték a zsírtartalmú étrendet (meredekség = + 0,0896, r = 0,7041).

Az exogén Spexin hatása a metabolikus paraméterekre DIO egerekben

A kezeletlen DIO egerekből izolált adipocitákat jeges PBS-ben szuszpendáltuk, amíg készen állunk a vizsgálatra. 37 ° C-ra történő felmelegítés után a sejteket két órán át inkubáltuk PBS-ben (kontroll) vagy PBS + Spexin-ben, 10 különböző koncentrációban, 0,01 és 80 ng/ml között. Ezután a sejteket mostuk, és meghatároztuk LCFA felvételi kinetikájukat. A kétfázisú dózis-válasz görbe összhangban van a hormonokkal (lásd Megbeszélés).

A Spexin hatása a 24 órás etetési viselkedésre és a testtömegre DIO patkányokban

Az ebben a vizsgálatban alkalmazott nőstény DIO patkányok a kezelés kezdetén körülbelül 20% -ban túlsúlyosak voltak. Az egyes testtömegeket és az összes elfogyasztott ételt naponta mértük. A napi táplálékfelvétel csökkenése a 3. napra (

32%) volt statisztikailag szignifikáns a 4-6. Napon, az utolsó kezelési napon és az első két mosási napon, ( 7A. Ábra ). A 4. napon észlelt testtömeg-csökkenés jóval a kezelési periódus után is fennmaradt ( 7B. Ábra ). Ebből a vizsgálatból a 24 órás táplálékfelvétel kumulatív görbéit folyamatos rögzítéssel nyertük ( 7. ábra C-F ). A kiinduláskor a két állatcsoport lényegében azonos etetési viselkedést mutatott. Figyelemre méltó, hogy az étkezés gyakorisága és az időbeli (világos/sötét) táplálási mintázat a 24 órás táplálkozási periódusokban a Spexinnel kezelt csoportban az egész kezelési és kimosási időszakban normális maradt. Mind az étkezés mérete (az elfogyasztott étel/étkezés gramma), mind az étkezés időtartama (az etetéssel/étkezéssel töltött idő) kisebb volt a spexinnel kezelt állatokban, akik a kezelés utolsó napján összességében körülbelül 32% -kal kevesebb kalóriát fogyasztottak, mint a kontrollok, és a kezelést követő első két napon.

Kondicionált ízkerülés teszt Wistar Rats-ban

A LiCl-kezelt állatok által fogyasztott szacharinoldat teljes mennyisége lényegesen kisebb volt, mint a sóoldattal vagy a Spexinnel kezelt állatoké ( 8. ábra , Az injekció beadásának második napja és azt követően lényegesen kevesebb volt, mint amennyit a fiziológiás sóoldattal vagy a spexinnel kezelt állatok fogyasztottak, ** p 2A ábra) a Leptin és a Spexin között elhízott betegek szérumában, és a normál testsúly-ellenőrzések alátámasztják azt az elképzelést, hogy ezek a peptidek antagonista szerepet játszhatnak szerepek az éhség, a jóllakottság, a test zsírossága és a test normális szabályozásában azáltal, hogy a negatív visszacsatolási hurok ellentétes komponenseiként szolgálnak. Ezért megvizsgáltuk a Spexin biológiai szerepét az energia-anyagcserében és az étrend okozta elhízás két rágcsáló-modelljében. A Spexin napi intraperitoneális injekciói az élelmiszer-fogyasztás és a testtömeg csökkenését eredményezték a DIO egerekben, míg a hordozóval injektált DIO egerek tovább híztak. Analóg adatokat kaptunk külön tanulmányban DIO patkányokkal. A hivatalos tesztelés során a Spexin kimutatható íz-averzív hatásainak hiánya érezhetően növeli e megfigyelések fontosságát.

Ezeket a megállapításokat tovább folytattuk olyan egerek külön csoportjában, akiket 19 napon át Spexin-kezelés alatt, metabolikus kamrákban végeztek. A kalorimetriás ketrec vizsgálatok azt mutatták, hogy a Spexin szignifikánsan csökkentette a RER értéket, ami preferenciális zsír oxidációra utal, különösen sötétség idején, amikor a Spexinnel és a hordozóval kezelt egerek közötti RER különbség nagyon szignifikáns volt. Az éjszakai RER megfigyelt csökkenése a szénhidrát-anyagcsere normál éjszakai emelkedésének gátlásából származik, és ezzel együtt jár a lipidoxidáció. A spexin szintén jelentősen növelte a mozgásszervi aktivitást, de csak a Z-síkságon, „neveléssel”. Nem volt bizonyíték véletlenszerűen megnövekedett „szorongás” aktivitásra.

A Spexinnel kezelt állatokban az RER csökkenésének és a mozgásszervi aktivitás növekedésének alapja továbbra is spekulatív. Mindazonáltal az élelmiszer-bevitel csökkentése az ízléstől való elzárkózás, a megváltozott anyagcsere és a megnövekedett mozgásszervi aktivitás mellett a Spexin alkalmazása során arra utal, hogy ezek a hatások együttesen központilag közvetíthetők. Ezt a kérdést a továbbiakban a Spexin beadásának az agyi aktivitás pozitron emissziós tomográfiai leolvasásában, valamint az alacsony dózisú intracerebroventrikuláris Spexin adagolásnak az élelmiszer-fogyasztásra és a testtömegre gyakorolt hatásainak tanulmányozásával fogjuk folytatni.

Tudomásunk szerint elsőként mutatjuk be a Spexin expresszióját emberi WAT-ban, azonosítva a Spexin expresszió szinte teljes hiányát emberi elhízott WAT-ban, és javasoljuk, hogy a Spexin szerepet játszik a zsírszövet működésének normális szabályozásában, beleértve az LCFA felvételét, hogy a Spexin hiánya az elhízott zsírokban megfigyelhető hormonális rendellenességek fő összetevője lehet, és hogy a keringő Spexin feltöltése hozzájárulhat az elhízott állatok és emberek normális táplálkozási viselkedésének és energiaegyensúlyának helyreállításához. A Spexin-történet nyilvánvalóan csak most kezdődik, és sok megválaszolatlan kérdés van, amelyek közül a Spexin testösszetételre gyakorolt hatása fontos, de az itt közöltek egyértelműen előre viszik a mezőt.

Ez a tanulmány, amely a lipid anyagcserére összpontosító laboratórium és a bariatrikus sebészcsoport eredményes együttműködésének egyik eredménye, erősen alátámasztja azt a hipotézist, miszerint a Spexin egy erős, természetes jóllakottságot kiváltó peptid, amely kulcsfontosságú szerepet játszik az etetési magatartás, a Az LCFA-k adipocitákká, energiafelhasználás és anyagcsere, valamint a testtömeg DIO egerekben és patkányokban. Az emberi elhízás kezelésében rejlő terápiás potenciál részletes feltárást igényel.

Amit már tudunk erről a témáról?

A Spexin egy új, nemrégiben leírt peptid hormon

A Spexin gén (Ch12: orf39) az elhízás különféle fenotípusos markereihez kapcsolódó lokuszra térképez

Nemrégiben kimutatták, hogy a spexin szerepet játszik az aranyhalak jóllakottságában

Mit ad hozzá ez a tanulmány?

A génexpressziós mikroszkópos vizsgálatokban a elhízott emberi zsírban a spexin arányosan a leginkább szabályozott gén.

Az exogén Spexin beadása csökkenti a táplálékfelvételt és a testtömeget a DIO rágcsálókban.

A spexin gátolja a DIO rágcsálókban a hosszú láncú zsírsavfelvételt az adipocitákban, és szabályozhatja az LCFA felvételét az emberi zsírszövetbe.