Az adenozin-kináz genetikai megzavarása az egér hasnyálmirigy β-sejtjeiben véd a magas zsírtartalmú étrend okozta glükóz intolerancia ellen

Ebben a cikkben van egy javítás. Lásd:

Absztrakt

Bevezetés

A cukorbetegség a megszakadt glükóz homeosztázis kóros állapota, amelyet abszolút vagy relatív inzulinhiány és inzulintermelő β-sejtek elvesztése jellemez. A 2-es típusú cukorbetegségben (T2D) a β-sejtek elégtelensége az inzulinrezisztencia által kiváltott multifaktoriális folyamat eredménye, gyakran az elhízás hátterében (1–3). A T2D-ben számos sértés járul hozzá a progresszív β-sejtek kudarcához, beleértve az endoplazmatikus retikulum stresszt, a gyulladásos citokineket, a reaktív oxigénfeleslegek feleslegét és a glikolipid toxicitást (2). A β-sejt veszteség a megnövekedett apoptózis és a dedifferenciáció kombinációján keresztül következik be, bár ezen eredmények relatív hozzájárulása továbbra sem világos (3–6). Jelenleg egyik fő kutatási cél a β-sejtek kudarcának molekuláris mechanizmusainak megértése és stratégiák kidolgozása ennek a folyamatnak a megfordítására.

Noha a késői betegségben a T2D csökkent inzulinszekrécióval jár, a fokozott inzulinszekréció korai alkalmazkodás az inzulinrezisztenciához (7,8). Megjegyzendő, hogy a cukorbetegségben nem szenvedő egyéneknél, akiknek magas a genetikai kockázata a cukorbetegségre, csökkent a glükózstimulált inzulinválasz (9), de nem világos, hogy ez hibás β-sejtműködés vagy hiányos β-sejttömeg következménye-e. A T2D-hez kapcsolódó kockázati allélek olyan géneket vonnak maguk után, amelyek mindkét folyamatban részt vesznek (pl. CDKN2A, KCNQ1 [10–12]). Az egereken végzett vizsgálatok bebizonyították, hogy a β-sejtek tömegplaszticitása központi szerepet játszik az elhízással összefüggő inzulinrezisztencia kiegyenlítésében (13). Habár az adaptív β-sejtek terjeszkedése kevésbé nyilvánvaló az embereknél, az elhízott, cukorbetegség nélküli embereknél a β-sejtek tömege 1,5-szeres, a β-sejtek száma pedig megnő (14 Ezért az emberi β-sejttömeg esetleg szerény plaszticitást mutat, amely befolyásolja az egyén T2D iránti fogékonyságát (15).

Kutatási tervezés és módszerek

ADK-célzott egerek generálása, genotipizálása és etetése

Az ADK gén expressziójának feltételes megzavarása. V: Az Adk-lokusz és a célzó konstrukció sematikus ábrázolása: mutagén orientáció (ADK 1), Flp rekombináz-függő nem mutagén orientáció (ADK 2) és Cre rekombináz-függő mutagén orientáció (ADK 3). Bemutatjuk a primer primert (Fwd), a fordított primert (Rev), a B32 primert, a rekombinációs szekvenciákat (Frt és LoxP), az SA-t és a β-galaktozidáz/βgeo-t. B: Adk-célzott egerek hasnyálmirigy-szakaszainak hisztokémiai festése a β-galaktozidáz aktivitás szempontjából (kék); eozinnal (rózsaszín, felső sor) vagy inzulinnal (barna, alsó sor) ellentétes festés látható. C: ADK-irányított Western-blot májszöveti lizátumok Adk-célzott és kontroll egerekből. A nem specifikus felső sáv tükrözi a minta terhelését (terhelés ellenőrzése [LC]). D: Az ADK és az enoláz (LC) szempontjából vizsgált máj- és sziget-lizátumok.

Western Blotting

Az SDS-PAGE-hoz izolált szigeteket és homogenizált májszöveti lizátumokat használtunk (RIPA Lysis System, sc-24948; Santa Cruz Biotechnology). A szigetek által korlátozott ADK-rendellenességeket felnőtt βADKO és kontroll állatok máj- és szigeti lizátumainak felhasználásával értékeltük. A szigeteket a korábban leírt módon izoláltuk (20). Anti-ADK-t (1: 200, sc-32908) és anti-enolázt (1: 500, sc-15343) használtunk a fehérje kimutatására.

Glükóz-fiziológiai kísérletek

Az összes glükózfiziológiai kísérletet életkor és nem szerint egyeztetett kohorszokon végeztük. A glükózméréseket a megadott időpontokban TRUEresult glükométerrel és TRUEtest csíkokkal végeztük. Az éhgyomri glükózméréshez és az intraperitoneális glükóztolerancia-teszthez (IPGTT) az egereket lemértük és egy éjszakán át éheztettünk (14 óra, 18:00 és 8:00 között). A glükózszinteket 0 percnél értük el 1,5-2,0 g/kg glükóz injekció beadása előtt, i.p. (10 μL/g) és az ezt követő megadott időpontokban. Véletlenszerű glükózszinteket kaptunk az etetett egereknél 10: 00-kor. Az intraperitoneális inzulin tolerancia tesztet (IPITT) 0,5-1,5 egység/kg Humulin (R-100; Eli Lilly) alkalmazásával végeztük, amint azt 4 órás gyors 8-kor kezdtük. 00:00 In vivo glükózstimulált inzulin szekréciót (GSIS) mértünk a vérben, amelyet éjszakán át éheztetett egerekből gyűjtöttünk a 0 időpontban és 3 g/kg glükóz injekció után. Az inzulint Alpco Mouse ultraibens inzulin ELISA készlettel (80-INSMSU-E01) mértük. Az ADK 2/+ Rip-Cre állatok nem mutattak ki detektálható fenotípust, és kontroll állatokként az ADK +/+ Rip-Cre-t is felvették.

Szövettan

In vitro β-sejt replikáció

Szigeteket izoláltunk 36 hetes vivőanyaggal injektált (n = 4) és tamoxifennel injektált (n = 4) iβADKO egerekből. Az injekciókat 18 hetes korban hajtották végre, hogy elkerüljék a fejlődési hatást, és a szigeteket 18 hetes késés után szüretelték a lehetséges rövid távú tamoxifen és rekombinációs hatások elkerülése érdekében. A szigeteket diszpergáltuk, lemezeztük (60 órán át hagytuk a tapadást), kezeltük (60 órán át tartó időtartam), rögzítettük és megvizsgáltuk (PDX-1 és ki67 festés) a korábban leírtak szerint (19, 20).

Statisztika

A kísérleti adatokat szóródási ábrákként mutatjuk be a statisztikai átlag szomszédos ábrázolásával, amely tartalmaz egy hibasávot, amely az SD-t ábrázolja. A statisztikailag szignifikáns különbségeket Student kétfarkú t teszttel határoztuk meg, ahol a P ≤ 0,05 szignifikánsnak tekintettük. A kísérleti eredményeket minden esetben független kísérletekkel igazolták, kivéve az in vivo β-sejt replikációs kísérleteket.

Eredmények

Adk-célzott egérmodell

Az ADK in vivo funkciójának tanulmányozásához β-sejtekben olyan egereket generáltunk, amelyek feltételesen az Adk-lokuszra irányultak (1A. Ábra). Az integrált mutagén orientáció (ADK 1) rendkívül hatékony splice-akceptor szekvenciát (SA)/βgeo expressziós kazettát (β-galaktozidáz-neomicin rezisztencia fúziós gén) helyezett az 1a és 1b exonok keretébe, az ADK transzkripciós kezdőhelyeket, amelyek kódolják az ADK- rövid (citoplazmatikus), illetve ADK hosszú (mag) izoformák (28). P-galaktozidáz aktivitást alkalmaztunk az ADK expressziójának értékelésére az Adk 1/+ egerek hasnyálmirigyében (1B. ábra, bal oldali panelek). Az ADK nagymértékben expresszálódott az exokrin hasnyálmirigyben, és szerényen expresszálódott az endokrin hasnyálmirigyben, ahol a magban elhelyezkedő (ADK hosszú) izoform dominál. A heterozigóta (Adk 1/+ × Adk 1/+) tenyészpárok újszülött almaiban Adk 1/+ kölykök voltak Mendeli-gyakorisággal. Az ADK-null állatok publikált fenotípusával összhangban azonban az elválasztáskor nem azonosítottak ADK 1/1 egeret (> 150 átvilágított egér) (29). Ezenkívül az ADK fehérje szinte nem volt kimutatható az Adk 1/1 újszülött kölyök hepatocita lizátumában (1C. Ábra). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a célzási stratégia hatékonyan megzavarja az ADK expresszióját.

Megbontottuk az ADK expresszióját a β-sejtekben (βADKO egerek) a Rip-Cre driver törzs alkalmazásával (30). Megerősítettük a β-sejtek által korlátozott rendellenességet a hasnyálmirigy szöveti szakaszainak β-galaktozidáz aktivitásának mérésével 1) a géncsapdavektort hordozó egerek nonmutagén orientációjában (Adk 2/+ egerek), 2) Rip-Cre egerekben és 3) Rip-Cre Adk 2/+ egerek (βADKO-Het) (1B. Ábra). Ahogy az várható volt, az Adk 2/+ és a Rip-Cre állatok hasnyálmirigy-szakaszaiból hiányzott a β-galaktozidáz aktivitás, míg a βADKO-Het szelvényekben β-sejtekkel korlátozott β-galaktozidáz aktivitás mutatkozott. Megjegyzendő, hogy a Rip-Cre egerek rekombinációs aktivitással rendelkeznek az agyban, és glükóz-intoleranciát mutatnak (31,32). Következésképpen minden vizsgálat Rip-Cre kontrollállatokat tartalmazott. Ezután megvizsgáltuk az ADK megszakadását a máj és a szigeti lizátumok Western blot-jával Rip-Cre, βADKO-Het és βADKO egerekből (1D. Ábra). Míg a máj ADK expressziója hasonló volt a genotípusok között, a szigeti ADK expresszió csökkent a βADKO állatokban. A szigeti minták maradék ADK-expressziója tükrözheti az exokrin és/vagy az inzulin-negatív szigeti sejtek szennyeződését. Ezek az adatok együttesen azt jelzik, hogy az ADK expressziója sikeresen megszakadt a hasnyálmirigy β-sejtjeiben.

A βADKO egereket védik a HFD által kiváltott glükóz intolerancia ellen

A fiatal βADKO állatok nehezebbek voltak, mint a Rip-Cre kontroll alomtársak (2A. Ábra). 8 hetes korban a nőstény βADKO egerek súlya ~ 2 g volt, mint a Rip-Cre kontrollállatoké (18,3 ± 0,3 vs. 16,1 ± 0,6 g; P 0,05). 52 hétre a Rip-Cre (28,9 ± 1,4 g) és a βADKO (29,2 ± 1,5 g) testsúlya megkülönböztethetetlen volt. A HFD-vel táplált 13 hetes βADKO és Rip-Cre egerek nagyobb súlygyarapodást mutattak, összehasonlítva a genotípussal illeszkedő NC táplált egerekkel, 2 héttel a HFD megkezdése után (P 0,05 minden időpontban) (2B. Ábra). Így a βADKO állatok átmenetileg nehezebbek voltak, mint a kontroll állatok, de nem voltak hajlamosak a HFD által kiváltott súlygyarapodásra.

Értékeltük a tamoxifen által kiváltott β-sejt-specifikus ADK-zavarok hatását érett állatokban a glükóz homeosztázisra és a β-sejtek replikációjára (5A. Ábra). Az ADK expressziójának tamoxifen-függő zavarát a β-galaktozidáz aktivitás indukciójával igazolták (5B. Ábra). Az NC-vel táplált βADKO egerekhez hasonlóan az NC-vel táplált vivőanyaggal és tamoxifennel kezelt iβADKO egerek hasonló IPGTT-ket mutattak (5.C ábra). Következésképpen a tamoxifen-kezelésnek nincs hatása az IPGTT-re. Szintén összhangban a βADKO fenotípussal, a HFD-vel táplált tamoxifennel kezelt egerek szignifikánsan alacsonyabb táplált glükózértékeket (5D. Ábra) és fokozott IPGTT-t mutattak 3 (5E. Ábra) és 11 (5F. Ábra) HFD után. Ezzel szemben az IPITT-vel mért inzulinérzékenység változatlan volt (5G. Ábra), ami talán a méhen kívüli rekombináz aktivitás hatását jelzi a βADKO egerekben. Végül felmértük, hogy az ADK megszakítása fokozta-e az in vivo GSIS-t. Valójában a tamoxifennel kezelt egerek fokozott inzulinszekréciót mutattak ki glükózfertőzés után (15 perces vivőanyag-kezelés 0,15 ± 0,02, szemben a tamoxifen-kezeléssel 0,24 ± 0,04 ng/ml; P = 0,01) (5H ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az ADK β-sejt-specifikus megzavarása felnőtt egerekben védett volt a HFD által kiváltott glükóz intolerancia és fokozott GSIS ellen in vivo.