Határok a mikrobiológiában

Élelmiszer mikrobiológia

Ez a cikk a kutatási téma része

A gyümölcsök és zöldségek utáni betakarítási patológiájának fejlődése Az összes 17 cikk megtekintése

Szerkesztette

Nengguo Tao

Xiangtan Egyetem, Kína

Felülvizsgálta

Xingfeng Shao

Ningbo Egyetem, Kína

Jun Tian

Jiangsu Normal University, Kína

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

Cikk letöltése
- PDF letöltése
- ReadCube
- EPUB
- XML (NLM)
- Kiegészítő
  Anyag
Exportálás
- EndNote
- Referencia menedzser
- Egyszerű TEXT fájl
- BibTex

OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

Élelmiszertudományi és Mérnöki Főiskola, Kínai Óceán Egyetem, Qingdao, Kína

A patulin a gyümölcsök és zöldségek gyakori szennyezője, amelyet nehéz eltávolítani. Ebben a tanulmányban a sertés hasnyálmirigy-lipáz (PPL) alkalmazásával a patulin biodegradációját vizsgálták. A patulin koncentrációjának elemzésére HPLC módszerét használtuk. Kötegelt lebontási kísérleteket végeztünk a PPL mennyiségének, pH-jának, hőmérsékletének, érintkezési idejének és kezdeti koncentrációjának hatásának szemléltetésére. Emellett a patulin lebomlási termékét teljes hullámhosszú pásztázás és MS technológiák jellemezték. Az eredmények azt mutatták, hogy a PPL optimális lebomlási körülményeit a patulin esetében pH 7,5, 40 ° C hőmérsékleten 48 órán keresztül figyelték meg. A lebomlás százaléka meghaladhatja a 90% -ot. A patulin lebontható termékének szerkezetére a 159,0594 molekulatömeg alapján következtettünk, amelynek neve C7H11O4 +. Jelezte, hogy a PPL hatásos a patulin lebontásában a gyümölcs- és zöldséglében.

Bevezetés

A mikotoxin-szennyeződésű patulint (4-hidroxi-4H-furo [3, 2c] pirán-2 [6H] -on) különféle gombák szintetizálják, különösen Penicillium, Aspergillus, és Byssochlamys fajok (Moake és mtsai, 2005; Castoria és mtsai, 2011; Zhu és mtsai, 2015) (1. ábra). Ezek a gombák az alma, a körte, az őszibarack, a kajszibarack, valamint egyes zöldségek (pl. Paradicsom) betakarítás utáni fontos kórokozói, és a patulin felhalmozódását okozták a fertőzött termékekben (Yuan et al., 2010; Castoria et al., 2011) . A patulin akut és krónikus hatásokat követően, még viszonylag alacsony koncentráció mellett is egészségügyi kockázatot jelent az emberekre és az állatállományra (Moake et al., 2005; Zhu et al., 2015; Peng et al., 2016). Mérgező hatása miatt számos ország és szervezet, köztük Kína és a WHO, meghatározta a gyümölcs- és zöldségfélékből készült termékek ideiglenesen megengedett patulin-szennyezettségi szintjét (Élelmezési Mezőgazdasági Szervezet/Egészségügyi Világszervezet [FAO/WHO], 1995; Castoria és munkatársai, 2005; Yuan és mtsai, 2010). Ezért el kell távolítani a patulint az élelmiszerekből.

1.ÁBRA. A patulin molekuláris szerkezete.

A patulin szerkezete feltárja a laktonkötés jelenlétét. Ezért a redukáló enzimek, például az élesztő fermentációjában részt vevők, valamint a laktont lebontó enzimek, például a laktamáz, önmagában képesek lebontani a patulint (Moake et al., 2005). Ez a cikk az enzimek patulin lebontására gyakorolt hatásának vizsgálatára összpontosított.

A lipázok (triacil-glicerin-észter-hidrolázok; E. C. 3.1.1.3.) Mikroorganizmusokban, növényekben és állati szövetekben találhatók. Közülük a sertés hasnyálmirigy-lipáz (PPL) az egyik legszélesebb körben alkalmazott lipáz a különféle reakciók, például észterezés, érdesítés és hidrolízis katalizálásában, amely olcsóbb, mint más kereskedelmi mikrobiális és állati lipázok (Kartal et al., 2009; Li és mtsai, 2009; Mendes és mtsai, 2012). A vizsgált PPL egyetlen láncból áll, amely 449 féle aminosavat és 7 féle diszulfidkötést tartalmaz (Giessauf és Gamse, 2000; Mendes et al., 2012). A PPL-t már biokatalizátorként alkalmazták a glicidol enantioszelektív észterezéséhez (Martins és mtsai., 1994), valamint a triolein és részleges gliceridjeinek enzimatikus hidrolíziséhez (Glowacz és mtsai., 1996). Ebben a vizsgálatban a PPL-t választották katalizátorként, amely esetleg felhasználható a patulin lebontására.

Eddig kevés tanulmány készült a patulin közvetlen enzimatikus lebontásáról. A munka célja a patulin lebomlásának tanulmányozása volt PPL alkalmazásával, amely egyfajta anyagot szolgáltathat a patulin lebontásához a gyümölcsökben és zöldségekben. Ennek az itt közölt tanulmánynak az volt a célja, hogy megvizsgálja a PPL lebomlási sebességét a patulin esetében különböző körülmények között, és a teljes hullámhosszú pásztázással és tömegspektrometriás elemzéssel jellemezze a hatásmechanizmust.

Anyagok és metódusok

Anyagok

A PPL-t (II. Típusú E.C. 3.1.1.3., Specifikus aktivitása 100–400 olívaolaj egység/milligramm fehérje) a Sigma-Aldrich, Co., Ltd. (St. Louis, MO, Egyesült Államok) szállította; Az ecetsav analitikai tisztaságú volt, és további tisztítás nélkül kapottként használták fel. Az acetonitril és a kloroform nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás minőségűek voltak. A patulint a Sigma-Aldrich, Co., Ltd.-től szereztük be. Az összes kísérlet során ultratiszta vizet használtunk.

Patulin oldat elkészítése

A működő megoldás

A szilárd patulint 50 ml kloroformban oldjuk, így 100 mg/l standard patulinoldatot kapunk, és –18 ° C-on tároljuk. A patulin standard oldat szárazra párologhat, majd ionmentes vízben (pH-ját ecetsavval 4,0-ra állítva) feloldjuk 5 mg/l végkoncentrációval (Zhang et al., 2016). Az A munkaoldatot kaptuk.

B működési megoldás

A Penicillium expansum az M1 törzset laboratóriumunkban kaptuk. Az M1 törzseket 14 napig 28 ° C-on tenyésztettük PDA tápközegben. A patulin extrakciós eljárást a MacDonald és munkatársai által leírt módszer szerint állítottuk elő. (2000) néhány módosítással: a gomba és a táptalaj keverékét elválasztjuk, majd etil-acetáttal háromszor extraháljuk, majd 10 ml 1,5 tömeg% -os nátrium-hidrogén-karbonát vizes oldattal extraháljuk. Az etil-acetátos extraktumot rázó-inkubátoron vezetjük 180 fordulat/perc sebességgel, 25 ° C-on 1 órán át, és szárazra pároljuk. Ezután a patulint feloldjuk 1 ml ionmentes vízben, pH-ját ecetsavval 4,0-ra állítjuk. Így a B munkaoldatot kaptuk.

Patulin lebomlás PPL által

A patulin vizes oldatban történő lebontási kísérleteit 50 ml-es Erlenmeyer-lombikokban hajtottuk végre. A porított PPL-t folyamatosan 5 ml B munkaoldathoz adtuk. A kontrollt PPL hozzáadása nélkül készítettük el (Guo et al., 2013). Rázó-inkubátorba helyeztük 180 r/perc, 30 ° C hőmérsékleten. A lebomlás után a patulin koncentrációja vizes oldatban HPLC-vel mérhető. Ezután a kimutatás előtt 0,45 μm microPES-t (Shimadzu, Japán) használtunk a tisztításhoz (Peng et al., 2016). A mintákat HPLC-vel detektáltuk UV-detektálással (Li et al., 2007).

A lipázmennyiségek hatását a lebomlási sebességre 0,3–2,4 mg között vizsgálták. A pH hatását 3,5 és 8,5 közötti pH-tartományban vizsgáltuk. A pH-értéket a kívánt 1 mol/l foszfátpuffer oldathoz állítottuk. A hőmérséklet hatását a lebomlási sebességre 20-60 ° C között vizsgáltuk. Az érintkezési idő hatását kilenc különböző szinten végeztük 6 óránként, 54 órán át. A kezdeti patulin-koncentráció 5-30 mg/l tartományban történt.

A PPL lebomlási sebességét a patulin esetében az Eq. (1):

hol, ω (%) a PPL lebomlási sebessége a patulinban; C0 és Ce (mg/l) a patulin kezdeti és egyensúlyi koncentrációja az oldatokban.

A PPL bomlási képességét a patulin esetében az Eq. (2).

hol, qe (mg/mg) a PPL bomlási képessége a patulin esetében; C0 és Ce (mg/l) a patulin kezdeti és egyensúlyi koncentrációja az oldatokban. V (ml) a vizes patulin oldatok térfogata és m (mg) a száraz PPL tömege.

Ultrafiltrálás és meghatározás

A 3000 molekulatömegű Vivaspin centrifugális koncentrátorokat Millipore-tól (Bedford, MA, Egyesült Államok) szereztük be. A mintákat Vivaspin centrifugális szűrőkbe helyeztük 4000x-es centrifugálással g forgóvödör rotorban 25 ° C-on 10 percig a nagy molekulatömegű fehérjék kimerítésére. Végül 1 ml patulin lebomlását gyűjtöttük össze (Zheng et al., 2006).

Ezután UV-detektorral felszerelt 1260 HPLC rendszert (Agilent, Egyesült Államok) alkalmaztunk a patulin koncentrációjának kimutatására. Az analitikai oszlop Agilent ZORBAX SB-C18 volt, 5 μm × 4,6 mm × 250 mm; nem használtak védőoszlopot. A mobil fázis 1 ml/perc áramlási sebességgel eluálva acetonitril/víz (1: 9, v: v) izokratikus keverékéből állt. A számítások kromatogramjait 276 nm-en extraháltuk. A HPLC-oszlopot az elemzés előtt kondicionáltuk egy háttér befecskendezés nélküli futtatásával. A rendszeres elemzéshez 20 μL mintát vagy standard oldatot injektáltunk. A minták és a kalibrálási standardok mellett minden egyes mátrix esetében kontrollmintákat elemeztünk. A minták visszanyerésének követelményeit 60–115% -ra határozták meg. A kimutatási és a mennyiségi meghatározási határok 10,78 és 32,67 μg/L voltak (Li et al., 2015).

A bomlástermékek azonosítása

A porított PPL-t folyamatosan 5 ml A munkaoldathoz adtuk.

A minták optikai spektrumát Unico UV2102-PC UV-látható spektrofotométerrel (Sanghaj, Kína) rögzítettük (Zhu és mtsai, 2016). A mintákat 24 óra múlva Vivaspin centrifugális szűrőkbe helyeztük 4000x-es centrifugában g 10 percig a PPL kimerítéséhez. Végül 1 ml patulin-bomlásterméket gyűjtöttünk. A patulin oldatok elkészítését ultratiszta vízzel hígítottuk. Az UV-vis spektrumokat 190 és 700 nm között rögzítettük.

Pontos tömegű Q-TOF LC/MS-t (Agilent, Egyesült Államok) használtunk. A patulin-bomlástermékek molekulatömegét az ESI-MS segítségével határoztuk meg. A mobil fázis 0,4 ml/perc áramlási sebességgel eluálva metanol/víz (1: 9, v: v) izokratikus keverékéből állt. A minta injektálási térfogata 20 μL volt. Az ESI-MS kísérleteket pozitív ionizációs módban végeztük. Az MS működési paramétereit az alábbiak szerint állítottuk be: kapilláris feszültség 4000 V, szárító gázáram 10 L/perc, szárító gáz hőmérséklete 350 ° C, párologtató hőmérséklete 450 ° C és a porlasztó nyomása 40 psi. Az optimális fragmentorfeszültség 50 V volt, m/z tömegtartománya 20–500 volt a termék- és prekurzorion-vizsgálatokat tartalmazó MS/MS-szkennelési módokhoz. Az adatgyűjtéshez és elemzéshez az Agilent Mass Hunter szoftvercsomagot (6.1-es verzió) használták (Agilent, Egyesült Államok).

Statisztikai elemzések

Valamennyi kísérletet három példányban hajtottuk végre, és az eredményeket átlag ± szórásként fejeztük ki. Az adatokat egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük SPSS (19.0 verzió, SPSS, Inc.) alkalmazásával, és Duncan többszörös összehasonlítását alkalmaztuk a statisztikai szignifikancia értékelésére (P + adduktok C7H6NaO4 (M + Na) + számított: 177,0158, az ESI-MS talált: 176,9852. És a patulint m/z = 155,0054-nél azonosítottuk protonált kation [M + H] + esetén. A lebomlás utáni patulin MS (8B. Ábra) azt mutatta, hogy a PPL-vel kezelt mintákban a patulin nagyon kevesebb volt, mint a kezeletlen mintákban. A termék molekulatömege 159,0558 lehet, a C7H11O4 + 159,0594 molekulatömegével összhangban (9. ábra). Azt jelezte, hogy a patulint a gyűrűnyitási reakcióval reagálták PPL-vel. Az m/z 159-nél lévő fragmens alternatív módon áteshet a szén-dioxid egymást követő veszteségein (Malysheva et al., 2012). A spekuláció megfelel az előző vizsgálatnak UV-szkenneléssel. Felvetődött, hogy a patulin valószínűleg bomlástermékké metabolizálódik, amely kémiailag eltér a patulintól.

8. ÁBRA. MS/MS előtt (A) és utána (B) PPL lebomlás.