Határok az onkológiában

Molekuláris és sejtes onkológia

Ez a cikk a kutatási téma része

A proteomika és alkalmazásai a rákban Az összes 22 cikk megtekintése

Szerkesztette
Suman S. Thakur

Celluláris és Molekuláris Biológiai Központ (CCMB), India

Felülvizsgálta
Daniele Vergara

Salento Egyetem, Olaszország

Alessandro Carrer

Veneto Molekuláris Orvostudományi Intézet (VIMM), Olaszország

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

epeúti

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • 1 Doktori Iskola, CES Egyetem, Medellín, Kolumbia
  • 2 Alapvető tudományos kutatócsoport, Orvostudományi Kar, CES Egyetem, Medellín, Kolumbia
  • 3 docens Patológiai Tanszék, Antioquia Egyetem, Medellín, Kolumbia
  • 4 Kolumbiai Trópusi Orvostudományi Intézet (ICMT), Sabaneta, Kolumbia
  • 5 Máj- és hasnyálmirigy-sebészeti osztály, CES Klinika, Medellín, Kolumbia

Célja: Elemezni az epében lévő emberi és baktériumok proteomprofiljait, ha tumornak vannak kitéve, és nem tumoros mikrokörnyezetben, annak érdekében, hogy azonosítsák az ezen állapotok közötti különbségeket, amelyek hozzájárulhatnak a hasnyálmirigy-karcinogenezis jobb megértéséhez.

Betegek és módszerek: Folyadékkromatográfia és tömegspektrometria alkalmazásával összesen 20 epeminta (7 epekő (GS) betegből és 13 hasnyálmirigy-fej duktális adenokarcinóma (PDAC) betegből) humán és baktérium proteom profilja, amelyeket műtét során gyűjtöttek és közvetlenül a epehólyag, összehasonlították. g: Profilert és KEGG-t (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Mapper Reconstruct Pathway-t alkalmaztak fő összehasonlító platformként, amely az emberi fehérjék közötti felülreprezentált biológiai útvonalakra és a bakteriális fehérjék közötti interakciós utakra összpontosított.

Eredmények: Három bakteriális fertőzési útvonal volt felülreprezentálva a humán PDAC fehérjék csoportjában. Az IL-8 az egyetlen emberi fehérje, amely egybeesik a három útvonalon, és ez a fehérje csak a PDAC csoportban van jelen. A bakteriális fehérjék mennyiségi és minőségi különbségei diszbiotikus mikrokörnyezetre utalnak a PDAC csoportban, amelyet az antibiotikus bioszintézis enzimek jelentős részvétele támogat. A prokarióták kölcsönhatását jelző útvonalak kiemelik a zeatin jelenlétét a GS csoportban és a surfaktint a PDAC csoportban, előbbit a terpenoidok és a poliketidek metabolizmusában, utóbbit pedig mind a terpenoidok, mind a poliketidek és a kvórumérzékelés metabolizmusában. Eredményeink alapján javaslatot teszünk egy baktérium által kiváltott karcinogenezis modellre az epeutakra.

Következtetés: Legjobb tudásunk szerint ez az első olyan vizsgálat, amelynek célja az emberi és a baktériumok epefehérjeinek összehasonlítása daganatos és nem tumoros mikrokörnyezetben. Javasoltunk egy új carcinogenesis modellt az epeutakra az epe metaproteomiás eredményei alapján. Eredményeink azt sugallják, hogy a baktériumok kulcsszerepet játszhatnak az epeutak karcinogenezisében, egy hosszan tartó dysbiotikus és epitheliálisan káros mikrokörnyezetben, amelyben a baktériumok fajainak biofilm-képződése kiemelkedően fontos. Megállapításunkat a jövőben tovább kell vizsgálni in vitro és in vivo vizsgálatok.

Bevezetés

A baktériumokat jóindulatú és rosszindulatú betegségekkel társították, és a baktériumok karcinogenezise még mindig részletesen jellemzett folyamat. Az ilyen tanulmányból származó ismeretek kiindulópontot jelenthetnek a rák megelőzésére összpontosító klinikai beavatkozások hajtására. A vírusokkal társuló karcinogenezis a vírusgenomnak a gazdaszervezet DNS-be történő integrálásán alapul (azaz Human Papilloma Virus, Epstein-Barr), és alaposan tanulmányozták és jellemezték (10). Ezzel szemben a bakteriális karcinogenezis olyan jelenség, amelyet a hámsejteknek a baktériumok által súlyosbított gyulladáscsökkentő közegben való krónikus expozíciójának eredményeként hoztak létre (11, 12). Ez a gyulladáscsökkentő, fiziopatológiai mechanizmus azonban önmagában nem tudja meggyőzően megmagyarázni a karcinómák kialakulását a gyomor-bélrendszerben és az epeúti rendszerben, mivel a gyulladásos jelenségek az ember egész életében rendszeresen előfordulnak, és csak néhány embernél alakul ki rosszindulatú daganat.

Az epét az epehólyagban tárolják és koncentrálják, amely egy tiszta víztározó, ahol ez a biológiai folyadék kinyerhető a fehérje elemzéséhez (24). A kutatás során az epemintákat tipikusan az epeutak disztális részéből veszik az endoszkópos beavatkozások, például az endoszkópos retrográd cholangiopancreatography (ERCP) során (25). Azonban az epeelzáródással járó gyulladásos folyamat a PDAC betegek többségében megváltoztathatja az epefehérje összetételét az epeutak distális részében, és korlátozhatja az értelmes biológiai információk megtalálását. Az értelmes biológiai leletek hiánya akadályozza az epeutak karcinogenezisének sajátos modelljének kidolgozását, amely figyelembe veszi annak egyedi fiziológiai körülményeit, valamint az emberi és bakteriális fehérjék kölcsönhatását.

Anyagok és metódusok

Etika és mintavétel

Fehérjekivonás

Az epemintákat szobahőmérsékleten felolvasztották, és a korábbiakban leírtak szerint, kis módosításokkal feldolgozták (29). Röviden: 1 ml epét 10 percig 4 ° C-on és 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltunk, majd 1 ml TRI-reagenst és 1 ml kloroformot adtunk hozzá. A keveréket 5 percig szobahőmérsékleten (20-25 ° C) inkubáltuk, és 15 percig 4 ° C-on és 12 000 x g-vel centrifugáltuk a fehérjék elválasztására. A központi lipidréteget elkerülve a fennmaradó csőtartalmat (felülúszó + pellet) új csőbe helyeztük. Ezután 1200 μl acetont adunk hozzá, összekeverjük, 4 órán át inkubáljuk, és 15 percig 4 ° C-on 12 000 x g-vel centrifugáljuk. Az acetont eldobtuk, és a csöveket szobahőmérsékleten szárítottuk, majd 200 μl rekonstituáló puffert adtunk az üledékhez, majd az oldatot szárítottuk és liofilizáltuk.

Proteomikai elemzések

A proteinom elemzést a Creative Proteomics (Ramsey Road, Shirley, NY 11967, USA) végezte, röviden, az alkalmazott technikákat a következőképpen írják le:

Minta előkészítés a fehérje elemzéshez

A fehérjeoldatból metanol és kloroform alkalmazásával az összes fehérjét kicsapjuk. Körülbelül 10 μg összfehérjét oldunk 6 M karbamid vizes oldatban, és 10 mM DL-ditiotreitollal denaturáljuk, 1 órán át 56 ° C-on inkubáljuk, majd alkilezzük 50 mM jód-acetamiddal, és 60 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. fénytől védve. Ezután 500 mM ammónium-hidrogén-karbonátot (ABC) adunk az oldathoz, hogy 50 mM ABC végső koncentrációt kapjunk, amelynek pH-ja 7,8. Promega tripszint adtunk az emésztéshez használt fehérjeoldathoz 37 ° C-on 15 órán át. A keletkezett peptideket tovább tisztítottuk a C18 SPE oszloppal (Thermo Scientific) a só eltávolítása céljából. A mintákat vákuumban szárítottuk, és felhasználásig -20 ° C-on tároltuk.

Nano folyadékkromatográfia

Egy Easy-nLC1000 (ThermoFisher Scientific, USA) egy 100 μm × 10 cm-es házon belüli oszlophoz kapcsolva, amely fordított fázisú ReproSil-Pur C18-AQ gyantával (3 μm, 120 Å, Dr. Maisch GmbH, Németország) van feltöltve. használtunk. 5 μl mintatérfogatot töltöttünk be, teljes áramlási sebességgel 600 nL/perc, és A mozgó fázissal: 0,1% hangyasav vízben; és B: 0,1% hangyasav acetonitrilben. Az analitikai szétválasztást gradiens alkalmazásával hajtottuk végre: 6–9% B 15 percig, 9–14% B 20 percig, 14–30% B 60 percig, 30–40% B 15 percig és 40-95% B 3 percig, 95% B-vel eluálva 7 percig.

Tömegspektrometria és adatelemzés

Orbitrap Q Exactive ™ tömegspektrométert (Thermo Fisher Scientific, USA) 2,2 kV permetezési feszültségre és 270 ° C kapilláris hőmérsékletre állítottunk be. A tömegspektrometriás felbontást 70 000-re állítottuk 400 m/z-nél, és az előd m/z tartományban: 300,0 és 1800,0 között. A gyártási letapogatási tartomány m/z 100-tól indul, ütközés által kiváltott disszociációval (CID) aktiválva, és 3,00 izolációs szélességgel. A nyers fájlokat elemeztük, és az Uniprot humán fehérje adatbázisához kerestük a Maxquant (1.5.6.5) segítségével. A paramétereket a következőképpen állítottuk be: a fehérje módosításai karbamidometilezés (C) (fix), oxidáció (M) (változó); az enzimspecifitást tripszinnek állítottuk be; a maximális kimaradt hasításokat 2-re állítottuk; a prekurzor iontömeg-toleranciáját 10 ppm-re állítottuk, és az MS/MS-tolerancia 0,6 Da volt.

Humán és baktériumok peptid-fehérje lista kiválasztása elemzés céljából

A peptid-fehérje elemzést az ICMT-CES Egyetemen végeztük. A szennyeződéseket, az albumint, a hemoglobinnal kapcsolatos peptideket és a nulla intenzitású peptideket kiiktattuk a teljes peptid-fehérje humán és baktérium listáról. A fehérje azonosítóit szabványosítottuk, a hiányzó génneveket manuálisan kiegészítettük, és a fehérje taxonómiát igazoltuk.

Ezután a megosztott fehérjék teljes listáját úgy alakítottuk át, hogy megfeleljen a Prostar platform 1.18.1 (30) online verziójának követelményeinek, keresve a csoportok között eltérő módon bőséges emberi és bakteriális fehérjéket (GS vs. PDAC). Az intenzitás értékeket az átlagos központosítási módszerrel normalizáltuk, a variancia csökkentés nélkül. A részben megfigyelt értékeket az SLSA (Structured Least Squares Adaptive) módszerrel számoltuk be. A hipotézis tesztet a Student's segítségével végeztük t-tesztet, figyelembe véve a logaritmikus 2,5-ös változást, és a hamis felfedezés arányát 0,42% -ra állítva (o-= 0,00316). Megvizsgálták a nem megfigyelt fehérjék nem létező értékeinek beszámításának biológiai érvényességét a fehérjék kizárólagos csoportjainak összehasonlítása céljából. Az elemzést azonban csak a két csoport, a GS és a PDAC (megosztott fehérjék) megfigyelt értékei alapján végeztük el.

A további kvalitatív elemzéshez a GS és PDAC betegek teljes, exkluzív és differenciálisan gazdag fehérjéinek összes humán fehérje listáját (1. ábra) felvették az Universal Protein konzorcium erőforrásának (Uniprot http: // www) retrieve ID/mapping moduljába. .uniprot.org /, UniProt 2019_10 kiadás). Ezután a biológiailag integrált funkció mechanisztikus betekintése érdekében elemzésre kerültek az egyes csoportok Uniprot-standardizált emberi fehérje-listái a g: Profiler weboldalon (https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost ) (26). g: A Profiler több lekérdezéses megközelítést tesz lehetővé, amely több fehérje-gén lista túl reprezentatív funkcionális elemzését végzi, összehasonlítva a fehérjéket a csoportok között. Az alapértelmezett opciókat g-ban tartottuk: Profiler, elektronikus gén ontológiai annotációk hozzáadása nélkül, és Bonferroni korrekció a többszörös tesztbeállításokhoz. Jelentős, kiigazított, túlreprezentált utak (o-értékek Kulcsszavak: hasnyálmirigyrák, metaproteomikus, proteomikus, epe, zeatin, surfaktin, IL-8, karcinogenezis modell

Idézet: Arteta AA, Sánchez-Jiménez M, Dávila DF, Palacios OG és Cardona-Castro N (2020) Biliáris traktus karcinogenezisének modellje az epe metaproteomikáján alapul. Elülső. Oncol. 10: 1032. doi: 10.3389/fonc.2020.01032

Beérkezett: 2020. február 05 .; Elfogadva: 2020. május 26 .;
Publikálva: 2020. július 24.

Suman S. Thakur, Celluláris és Molekuláris Biológiai Központ (CCMB), India

Alessandro Carrer, Veneto Molekuláris Orvostudományi Intézet (VIMM), Olaszország
Daniele Vergara, Salentói Egyetem, Olaszország