Az adipocita glicerin csatorna Aquaporin 7 gén funkcionális változata elhízással és a kapcsolódó anyagcserezavarokkal társul

Absztrakt

AQP7, aquaporin 7
C/EBP, CCAAT/enhancer kötő fehérje
FFA, szabad zsírsav
HWE, Hardy-Weinberg egyensúly
LD, a kötés egyensúlyhiánya
MAF, kisebb allél frekvencia
PPAR, peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor
RXR, retinoid X receptor
SNP, egyetlen nukleotid polimorfizmus
UTR, lefordítatlan régió

Az elhízás és a kapcsolódó rendellenességek, beleértve a 2-es típusú cukorbetegséget és a dislipidémiát, járványossá válnak, ami jelentős egészségügyi problémákat jelent (1). Bár ezek a rendellenességek egyértelmű genetikai összetevővel rendelkeznek, az érintett gének többnyire ismeretlenek (2,3).

A zsírszövet egy endokrin szerv, amely az anyagcsere fluxusait a tárolt energia mennyiségéhez igazítja (4). Ha energiára van szükség, a zsírszövet trigliceridjeit szabad zsírsavvá (FFA) és glicerinné (5) hidrolizálják. A glicerin a máj glükoneogenezisének szubsztrátjaként szolgál, és bizonyos körülmények között a glicerin-3-foszfát forrásaként is szolgál az adipociták triglicerid-szintéziséhez (6,7). Így a glicerin termelés és annak adipocitákból történő kiáramlása modulálja a lipid és a glükóz homeosztázisát, és végül a testtömeg szabályozását (6,8).

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

Eset-kontroll tanulmány felvétele a 2-es típusú cukorbetegséggel való összefüggéshez.

Elektroforetikus mozgáseltolódási vizsgálat.

AQP7 expresszió humán szubkután zsírszövetben.

Az összes RNS-mintát 13 nem diabéteszes, kezeletlen, 3 hónapos, súlystabil egyén szubkután zsírszövetéből nyertük, akiknek elektív hasi műtéten estek át (kolecisztektómia vagy bariatrikus [nem elhízott vagy elhízott egyéneknél] beavatkozás). Minden RNS-minta egy mikrogrammját reverz átírással cDNS-be transzformáltuk a T-alapú első szálú Ready-To-Go (Amersham) készlettel a gyártó protokollja szerint. Az AQP7 génexpressziót ezután valós idejű PCR-rel értékeltük előre elkészített Fam-jelöléssel ellátott TaqMan tesztekkel (Applied Biosystem). A reakciókat az ABI Prism 7000HT szekvencia detektáló rendszeren (Applied Biosystems) hajtották végre. Az AQP7 (Hs00357359_m1) expressziós szint normalizálására az emberi háztartási GAPDH (4333764F) gént használtuk referenciaként, kompenzálva ezzel a reverz transzkriptáz hatékonyságában mutatkozó esetleges különbségeket. Az összes mintát három példányban elemeztük. Az adatokat Ct értékként kaptuk a gyártó útmutatásai szerint. A génexpresszió számos változását a 2 -ΔΔCt módszerrel számoltuk (21).

Statisztikai analízis.

Az értékeket átlag ± SD értékként jelentjük. A csoportok közötti összehasonlításokat nem párosított Student t teszttel teszteltük. A csoportok közötti összehasonlításokat egyirányú ANOVA-val teszteltük. Az átlagértékeket, miután a kovariátokra beállítottuk, ANCOVA teszttel értékeltük. Az eset-kontroll vizsgálatban χ 2 tesztet alkalmaztunk a 2-es típusú cukorbetegség és a genotípus közötti összefüggés, valamint a Hardy-Weinberg-egyensúly (HWE) tesztelésére. A különböző genotípusok betegségkockázatra gyakorolt hatásának modellezéséhez többváltozós logisztikus regresszióanalízist alkalmaztunk. Az A-953G SNP és a nem közötti kölcsönhatást a 2-es típusú cukorbetegség kockázatán és a BMI-értékeken logisztikai regresszió-analízissel, illetve általános lineáris modellel teszteltük. Az összes elemzést az SPSS szoftver 12.0-s verziójával (Windows, Chicago) végeztük.

A páronkénti egyensúlyhiány mértékét (D ′ és r 2) a polimorfizmusok között számítottuk ki a PHASE (22) 2.0 verziójú és a Haploview (23) 3,32 verziójú szoftverprogramokkal. Haploview-t alkalmaztak a haploblokkok azonosítására is, amelyeket szilárd tüskékként határoztak meg a kötési egyensúlyhiányban (LD) (D ′> 0,9).

A PHASE-t az egyes haplotípusok rekonstrukciójára is használták. Haplotype asszociációs elemzéseket Haplo Stats (24) segítségével végeztünk, és nem tekinthetők jelentéktelennek, ha az empirikus globális P érték ≥0,05.

EREDMÉNYEK

Újraszekvenálás és LD-értékelés.

A HapMap adatok (20/Gen06 kiadás) felhasználásával értékelték az európai származású utah lakosok (CEU csoport) CEPH mintájának haploblokk szerkezetét. Az LD szilárd gerincét D ′> 0,90-ként definiálva hat haploblokk ocks50 kb méretű genomi régióban, az AQP7 lókuszt átfogva (1. ábra és az online függelék 1. táblázata [elérhető a http://dx.doi.org/10.2337/db06 oldalon) -1389]) azonosították. A régióban megfigyelt LD mintázat meglehetősen szerény volt. Részletesen, erősen megőrzött LD-t figyeltek meg az AQP7 gén 5 ′ -es régiójában, míg az 5 ′ és 3 ′ régiók között kevéssé szignifikáns LD-t észleltek (online melléklet, 1. ábra).

A populációnkban található új AQP7 variánsok igazolására és/vagy azonosítására a teljes kódoló régiót (hét exon) és a szabályozó szekvenciákat, mind az 5 ', mind a 3' UTR-eket és a 2,5 kb promótert (18), megkülönböztettük egy szűrővizsgálati mintából 50 egyén (25 egészséges alany és 25 elhízott 2-es típusú cukorbeteg páciens). A kódoló régióban nem azonosítottak variánsokat, ideértve a korábban leírt missense mutációkat (18), míg öt SNP-t, amelyeket már közöltek a nyilvános adatbázisban (National Center for Biotechnology Information dbSNP), a szabályozó régiókban felismerték: rs13434 (kisebb allél frekvencia [MAF ] = 0,04), rs2989924 (MAF = 0,46), rs3758269 (MAF = 0,11), rs3758268 (MAF = 0,07) és rs3758267 (MAF = 0,11); Az rs13434 a 3 'UTR-ben, a másik négy pedig a promoterben található (1. ábra). A szűrőmintánkban az SNP-k között értékelt LD fok nagyon hasonló volt a HapMap CEU mintájával kapott értékhez, erősen megőrzött LD értéket csak a gén 5 ′ régiójában figyeltünk meg (online melléklet 2. ábra).

A páros egyensúlyhiány mérései azt mutatták, hogy az rs3758269 (amelyet a HapMap mintában nem genotipáltak) tökéletes LD-ben volt (r 2 = 1) az rs3758267-tel, de az rs2989924 esetében nem (r 2 = 0,1). Figyelemre méltó, hogy az rs3758269 és az rs2989924 is közel vannak a C/EBPβ transzkripciós faktor előre jelzett kötődési helyéhez (18). MAF-jeik alapján (azaz kizárva azokat a nem gyakori variánsokat, amelyek meghatározása szerint MAF 2, 24,8 ± 2; n = 275), szemben a kóros elhízottakkal (BMI ≥40 kg/m 2, 48,1 ± 6; n = 211). Amint a 3. táblázat mutatja, az XG egyedek aránya szignifikánsan magasabb volt a kóros elhízottaknál, mint a nem elhízott női alanyoknál; ezzel ellentétben a férfi alanyok esetében ez nem így történt.

Az AQP7 génhez tartozó KO egerek megnövekedett szérum FFA szintet mutatnak az intracelluláris adipocita metabolikus rendellenességek következményeként (6). Annak vizsgálata, hogy az A-953G SNP szerepet játszott-e a szérum FFA koncentrációjában, 541 nem cukorbeteg, egészséges egyén (338 36 ± 12 éves nő, BMI 24,9 ± 4,8 kg/m 2 és 203 37 ± 12 éves férfi alany), BMI 26,4 ± 3,9 kg/m 2). Az AA egyedekkel összehasonlítva az FFA-szintek magasabbak voltak az XG hordozókban a női alanyok között (0,55 ± 0,2 vs. 0,60 ± 0,2 mmol/l, AA vs. XG, illetve az életkorral korrigált P = 0,040), de a férfi alanyoknál nem (0,58 ± 0,3 vs. 0,54 ± 0,2 mmol/l, AA vs. XG, P = 0,363, az életkorhoz való igazodás után). A női alanyok statisztikai szignifikanciája nem változott sokat (P = 0,045), miután a BMI-t is korrigálták, amelynek átlagértékei nem különböztek a különböző genotípuscsoportokban (AA-ban és XG-ben 24,9 ± 4,7 és 24,9 ± 4,9 kg/m 2, P = 0,918) valószínűleg azért, mert a kiválasztási kritériumok szerint ezek egészségesek voltak, és többnyire fiatal és nem elhízott egyének voltak (lásd a kutatási tervet és módszereket).

Funkcionális és génexpressziós vizsgálatok.

Annak megvizsgálására, hogy az A-953G SNP befolyásolja-e a promóter transzkripciós aktivitását, luciferáz riporter gén vizsgálatot hajtottunk végre az A- vagy a G-953 variánssal transzfektált COS1 sejtekben (2A. Ábra). Ugyanezekben a sejtekben mind a PPARy2, mind az RXRα cDNS-jeit, amelyek az AQP7 promoter aktivitásának elengedhetetlen transzkripciós faktorai (26), kotranszfektálták. Különböző rosiglitazonkoncentrációkkal végzett stimuláció alatt a –953G promoter a transzkripciós aktivitás ~ 50% -os csökkenését mutatta a –953A promóterhez képest (n = 3, P = 0,001) (2B. Ábra). Megjegyzendő, hogy a –953G variáns 7 bp közel áll egy előre jelzett C/EBPβ transzkripciós faktor-kötő elemhez (18), amelyről ismert, hogy az adipocita-differenciálódás fő szereplője (27). Ezután géleltolódási vizsgálatot végeztek annak megvizsgálására, hogy az A-953G SNP befolyásolja-e a C/EBPβ kötődését. A –953A-t hordozó, radioaktívan jelölt oligonukleotiddal összehasonlítva a –953G variáns hordozója 30 ± 7% -kal csökkent kötődést mutatott a C/EBPβ-hoz (n = 3, P = 0,01) (3. ábra). Ez arra utal, hogy a csökkent C/EBPβ-DNS-kötés felelős legalább részben a -953G promoter által mutatott károsodott AQP7 transzkripciós aktivitásért.

Lehetőségünk volt arra is, hogy 13 nem cukorbeteg kezeletlen egyén szubkután zsírszövetében mérjük az AQP7 expressziós szintet: 8 (3 férfi/5 nő, 40,4 ± 11,9 év) nem volt elhízott (BMI 2, 23,7 ± 3,0) és 5 (2 férfi/3 nő (40,2 ± 16,4 év) nő elhízott (BMI ≥30 kg/m 2, 43,0 ± 12,2). Az elhízott egyéneknél az AQP7 expresszió markáns (P = 0,001) szabályozása csökkent a nem elhízott egyének vonatkozásában (4A. Ábra). Ezen túlmenően, bár az adatok kis számú egyénről származnak, és ezért nagy körültekintéssel kell értelmezni őket, úgy tűnt, hogy az AQP7 mRNS szintje fokozatosan csökken a –953G allélok számának megfelelően (nulláról két allélra AA, AG és GG egyedek, P = 0,036 lineáris regressziós analízissel), az A-953G SNP képes megjósolni az AQP7 mRNS-szint változékonyságának 34% -át (4B. Ábra). Bár ez az összefüggés már nem volt szignifikáns a BMI-hez igazítva (P = 0,085), mégis megfigyelhető volt, amikor csak nem elhízott személyeket elemeztek (r 2 = 0,68, P = 0,012), így nyitva hagyva a - 953G variáns in vivo AQP7 expresszión, BMI változásoktól függetlenül.

VITA

A magasabb FFA-szintek ellenére nem figyeltek meg inzulinrezisztenciát (azaz, amint ezt az állapot helyettesítői jelzik, beleértve a szérum inzulinszintet és/vagy a homeosztázis modell értékelési indexét) a nem cukorbeteg kezeletlen -953G hordozókban. Ez a megállapítás valószínűleg annak tudható be, hogy az inzulinrezisztencia finom változásainak észlelésében a szubsztátumok alacsony érzékenysége következik be, amelyek feltehetően a keringő FFA-koncentrációk kismértékű növekedésével adódtak, amelyet –953G hordozóknál figyeltek meg.

Úgy tűnik, hogy az összes genotípus-fenotípus asszociáció nemspecifikus, és megfigyelhető a női, de nem férfi alanyok körében. Ami azt illeti, a BMI modulációjára vonatkozó nemspecifikus genetikai hatásról korábban több állatmodellben (28,29), valamint emberben (30) számoltak be. Ezenkívül a szexuális dimorfizmusról beszámoltak a keringő FFA-koncentráció modulációjában is (31), amely megállapítás egy nemspecifikus genetikai hatásnak köszönhető, mint amit itt leírtunk. Hogy az általunk megfigyelt nemi specifitás az AQP7 génnek a nemhez kötött génekkel és/vagy nemi hormonhatásokkal való kölcsönhatásának köszönhető-e, nem ismert, és további, külön megtervezett tanulmányokat érdemel.

Meg kell jegyezni, hogy a kódolás és a szabályozás teljes újraszekvenálását elvégeztük, de nem az intronikus régiókat, amelyek a HapMap legújabb kiadása (2006. július 21.) szerint csak két intragén közös változatot tartalmaznak, amelyek közül az egyik egy rekombináns forró pont. Tehát ezen belső korlátok miatt az általunk megtervezett tanulmány nem reprezentálja a teljes AQP7 gén átfogó vizsgálatát, és valójában főként a promóter régióra korlátozódik. Ez nyitva hagyja annak lehetőségét, hogy más, még azonosítatlan SNP-k kiderülhetik, hogy elhízással és a kapcsolódó rendellenességekkel társulnak.

Tudomásul vesszük, hogy összetett rendellenességekben a genotípus-fenotípus asszociációk hamis pozitív eredményeket képviselhetnek a populáció rétegződése és/vagy véletlenszerűsége miatt. Úgy tűnik, hogy a jelen tanulmány nem ez a helyzet a következő okok miatt. Először is, a vizsgált népesség viszonylag homogén, minden egyén kaukázusi származású Közép-Olaszországból, így a népesség rétegződésének lehetősége távoli. Másodszor, a megnövekedett BMI-vel való összefüggést megismételték egy második független mintában. Végül a zsírszövet expressziós adatai és a transzfektált sejtekben végzett funkcionális vizsgálatok egyértelműen alátámasztják a –953G variáns biológiai szerepét az AQP7 expresszió negatív modulálásában. Ezek az adatok megerősítik a megfigyelt genotípus-fenotípus asszociációt. Ezért, bár adataink jelenleg nem állíthatók véglegesnek, valószínűtlen, hogy hamis pozitív eredményeket képviselnek, és új hipotézisek funkcióját szolgálhatják, amelyek további nagyobb vizsgálatokban egyértelműen megerősítést nyerhetnek.

Összegzésként elmondhatjuk, hogy a –953G hordozókban kapott jelenlegi adatok nagyban hasonlítanak az AQP7 KO egerekben kapott adatokra (6), ami arra utal, hogy az embereknél is az AQP7 downreguláció patogén az elhízásra és a kapcsolódó rendellenességekre, ami az AQP7-et új vonzó gyógyszercélzattá teszi. Megjegyzendő, hogy a tiazolidindionok, a közelmúltban kifejlesztett inzulin-szenzibilizáló gyógyszerek, amelyeket jelenleg a 2-es típusú cukorbetegség kezelésére használnak, upregulálják az AQP7 expressziót (26,32). Ha a –953G variánsra vonatkozó adatok további vizsgálatokban megerősítést nyernek, akkor fontos funkciót tölthetnek be annak a veszélyeztetett egyénnek az azonosításában, akinek konkrét és korai megelőző stratégiákat kell céloznia.