Az áfonya hatása a májfibrózisra és az Nrf2 transzkripciós faktorra patkányokban

Levelezés: Ming-Liang Cheng, MD, Fertőző Betegségek Osztálya, Guiyang Orvosi Főiskola, Guiyang 550004, Guizhou tartomány, Kína. moc.nc12@lmgnehc

Telefon: + 86-851-6752795 Fax: + 86-851-6741623

Absztrakt

CÉL: Az áfonya májfibrózisra és az NF-E2-hez kapcsolódó 2-es faktor (Nrf2) transzkripciós faktorra gyakorolt hatásainak vizsgálata patkányokban.

MÓDSZEREK: Negyvenöt hím Sprague-Dawley patkányt véletlenszerűen felosztottunk a kontroll csoportba (A); CCl4 által kiváltott májfibrózis csoport (B); áfonya prevenciós csoport (C); Dan-shao-hua-xian kapszula (DSHX) prevenciós csoport (D); és áfonya + DSHX prevenciós csoport (E). Patkányokban a májfibrózist CCl4 szubkután injekciójával és magas lipidtartalmú/alacsony fehérjetartalmú étrenddel indukálták 8 hétig (a kontrollcsoport kivételével). Megvizsgáltuk a hialuronsav (HA) és az alanin-aminotranszferáz (ALT) szintjét a szérumban. Meghatároztuk a szuperoxid-diszmutáz (SOD), a glutation-S-transzferáz (GST) és a malondialdehid (MDA) aktivitását a máj homogenizátumaiban. A májfibrózis mértékét hematoxilin, eozin és Masson festéssel értékeltük. Az Nrf2 és a NADPH kinon-oxidoreduktáz 1 (Nqo1) expresszióját valós idejű reverz transzkriptált polimeráz láncreakcióval, immunhisztokémiai technikákkal és western blot-módszerrel detektáltuk.

EREDMÉNYEK: A B csoporttal összehasonlítva a májindexek, a C, D és E csoport szérum HA és ALT szintje csökkent (májindexek: 0,038 ± 0,008, 0,036 ± 0,007, 0,036 ± 0,005 vs 0,054 ± 0,009, P Áfonya, májfibrózis, NF-E2-rel kapcsolatos faktor 2, NADPH-kinon-oxidoreduktáz 1, glutation-S-transzferáz

BEVEZETÉS

A májfibrózis a máj krónikus károsodásának gyakori eredménye [1]. Az oxidatív stresszt a közelmúltban felismerték a különböző májbetegségeknél megfigyelt kóros elváltozások alapvető tényezőjeként [2,3]. Az oxidatív stressz túlzott károsodást okozhat a májsejtekben a lipidperoxidáció és a fehérjealkilezés révén [4,5]. Az NF-E2-hez kapcsolódó 2-es faktor (Nrf2) fontos transzkripciós faktor, amely szabályozza az antioxidáns stressz reakciókat. A NADPH kinon-oxidoreduktáz 1 (Nqo1) és a glutation-S-transzferáz (GST) a fő II-es fázisú méregtelenítő enzimek, amelyeket az Nrf2 szabályoz [6,7].

Az áfonya virágos növény, amely a Vaccinium spp. az Ericaceae család. Az Emberi Táplálkozási Kutatóközpont (Mayer, USA) intenzív vizsgálatot végzett az áfonyáról. Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy az áfonya antocianinokat, polifenolokat és flavonoidokat tartalmaz, és úgy tűnik, hogy a legmagasabb antioxidáns kapacitással rendelkezik a közönséges gyümölcsök és zöldségek között [8,9]. Az áfonya gyulladáscsökkentő és daganatellenes mechanizmusokon keresztül is befolyásolhatja a krónikus betegségeket [10,11].

Jelen tanulmány középpontjában az áfonya májfibrózisra és detoxifikációs enzimrendszerekre gyakorolt hatásának vizsgálata szolgált patkányokban.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

A vizsgálati protokoll etikai jóváhagyása

Minden állatkísérlet megfelelt a Guiyang Orvosi Főiskola (Guiyang, Kína) állatgondozási és használati irányelveinek.

Reagensek és állatkezelések

Negyvenöt hím Sprague-Dawley patkányt (200 ± 20 g) nyertünk a Guiyang Orvosi Főiskola Kísérleti Állatközpontjából [Engedélyszám SCXK (Guizhou) 2002-0001]. A patkányokat véletlenszerűen öt kilenc csoportba osztották: kontrollcsoport (A); CCl4 által kiváltott májfibrózis csoport (B); áfonya prevenciós csoport (C); Dan-shao-hua-xian kapszula (DSHX) prevenciós csoport (D); áfonya + DSHX prevenciós csoport (E).

A kontrollcsoport kivételével a májfibrózist minden csoportban komplex módszerrel indukálták [12]. A B-E csoportba tartozó patkányok szubkután 40% -os CCl4-oldatot (tiszta CCl4 és mogyoróolaj keveréke) és 0,3 ml/100 g-ot kaptak hetente kétszer, 8 hétig (az első adag 40% -os CCl4 0,4 ml/100 g volt). A patkányokat magas lipid/alacsony fehérjetartalmú étrenddel (79,5% kukorica farina, 20% zsír és 0,5% koleszterin) etették minden nap. Az A csoportba tartozó patkányokat csak normál táplálékkal etették. Ugyanakkor áfonyalevet (1,5 g/100 g naponta, po, „Rabbiteye Blueberry”; Áfonya-termelési terület Ma-Jiang-ban, Kína) feldolgoztak. A mintákat felhasználásig -20 ° C-on tároltuk, és homogenizáltuk az áfonyalé előállításához (1 ml áfonyalé körülbelül 2 g szárított áfonyát tartalmazott). DSHX (1,0 g/kg naponta, po; tételszám 20081011; DSHX kapszula öt kínai növényi gyógyszerből, Tetrandrine, Radix Salviae Miltiorrhizae, Radix Paeoniae Rubra, Astragalus Membranaceus és Ginkgo leaf; Guiyang Pharmaceutical Company, Guizhou, Kína) és áfonyából gyümölcslevet + DSHX-t (1,5 g/100 g + 1,0 g/kg, po, naponta) a CE csoportba tartozó patkányoknak adtunk. 8 hét után nyolc túlélő volt az A, B, D és E csoportban, és kilenc a C csoportban.

A vér és a máj összegyűjtésére patkányokat leöltünk (a patkányokat leölés előtt lemértük). A nedves májat lemértük. Mindegyik májnak ugyanazt a részét eltávolítottuk és 10% semleges formalinban rögzítettük; a máj fennmaradó részét felhasználásig -80 ° C-on tároltuk. A patkány szérumot centrifugáltuk (1500 r/perc 15 percig szobahőmérsékleten), és felhasználásig -80 ° C-on tároltuk.

Hisztopatológia

10% -os formalinban 24 órán át végzett rögzítést követően a mintákat paraffinba ágyazottuk. Ezután a mintákat 5 μm-es darabokra vágtuk és diákra szereltük. Hematoxilinnal és eozinnal (HE) festették őket a hisztopatológiai vizsgálat céljából, és fibrózis-specifikus Masson festéssel festették a májfibrózis mértékét [13].

A májindex kiszámítása

A májindexet a [12] képlet szerint számoltuk: (májtömeg/patkánytömeg) × 100%.

A hialuronsav és az alanin-aminotranszferáz szintjének mérése

A hialuronsav (HA) (tételszám: 20090501, Sanghaji Tengeri Orvostudományi Intézet, Sanghaj, Kína) és az alanin-aminotranszferáz (ALT) koncentrációit radioimmunassay (RIA) vagy automatikus biokémiai analitikai eszközzel (Siemens Advia 1650, Bensheim, Németország) mértük. ).

A szuperoxid-dismutáz, a glutation-S-transzferáz és a malondialdehid szintjének mérése a máj homogenizátumaiban

Májhomogenátumokat készítettünk. A szuperoxid-diszmutáz (SOD) tartalmát xantin-oxidáz módszerrel határoztuk meg; a malondialdehid (MDA) tartalmat tiobarbitursav módszerrel teszteltük; dinitrobenzol kombinációs módszerrel megvizsgálva, a gyártó utasításainak megfelelően (20090521, 20090522 és 20090522 tételszám; Jiancheng Biologic Co., Nanjing, Kína).

Valós idejű reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakció-elemzések

A teljes RNS-t a májszövetekből Trizol reagenssel (13827390 tételszám; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) extraháltuk és megtisztítottuk. Ezt követte a reverz transzkripció (00033699 tétel; Fermentas, MBI, Burlington, ON, Kanada) Moloney egér leukémia vírus (MMuLV) reverz transzkriptáz és oligo (dT) 18 primerekkel. a polimeráz láncreakció (PCR) primereket Dr. Jie Liu (Amerikai Nemzeti Rákkutató Intézet az Országos Környezetegészségügyi Tudományok Intézetében (NC, USA) (táblázat (1. táblázat). 1) .SYBR Green DNS PCR kit (tétel 0804104 szám; Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) használtuk a valós idejű reverz transzkriptáz (RT) -PCR elemzésekhez. A kérdéses gének ciklusidejének (Ct) értékeit először ugyanazon β-aktinnal normalizáltuk. A csoportok közötti relatív különbségeket kiszámítva és relatív növekedésként kifejezve, a kontrollt 100% -ra állítva.

Asztal 1

Primer szekvenciák valós idejű RT-PCR analízishez

Gének	GenBank
Gének	Szám	Előre	Fordított
β-aktin	> V01217	TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCT	GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGAA
Nrf2	> NM_057152	CCATGCCTTCTTCCACGAA	AGGGCCCATGGATTTCAGTT
Nqo1	> NM_017000	CCAATCCTCCACCCACTTGT	GTCCCTCAGCCATTGTTTGAG

RT-PCR: Fordított transzkriptáz-polimeráz láncreakció.

Immunhisztokémiai elemzés

Parafinmentesítés, rehidratálás és antigén hőkezeléssel történő leplezése után a szövettani metszeteket 10% -os 3% -os H2O2-ban helyeztük el. Ezután anti-Nrf2 (tételszám: K2008; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia, USA) és anti-Nqo1 (tételszám: B1508; Santa Cruz Biotechnology) inkubáljuk egy éjszakán át 4 ° C-on. Ezután a mintákat egy EnVision készlet segítségével (tételszám: 10N1775A; Dako, Dánia) dolgoztuk fel a gyártó protokolljainak megfelelően. PBS-t használtunk negatív kontrollként. A citolimfa/sejt sárga anyagát pozitív sejtnek tekintették. Öt mikroszkopikus mezőt (× 400-as nagyítás) választottunk véletlenszerűen szeletenként, és megszámoltuk a sejtek mezőnkénti számát.

Western blottolás

A teljes fehérjét és a citoplazmát Bradford-módszerrel extraháltuk, készletekkel számítva (tételszám: 090310 és 090401; Nanjing Kaiji Biological Engineering Research Institute, Peking, Kína). Negyven mikrogramm teljes kivonatot (Nrf2)/citoplazma kivonatot (Nqo1) azonos térfogatú 2 × SDS elektroforézis mintapufferben forralunk 5 percig, 12% SDS-PAGE előtt. Elektroforézis után a fehérjéket polivinilidén-fluorid membránokra vittük át (tételszám: K7KN9080G; Millipore, Billerica, MA, USA). A membránokat 5% zsírmentes száraz tej-TBST pufferral blokkoltuk 1 órán át szobahőmérsékleten, majd TBST pufferrel mostuk. A membránokat egy éjszakán át Nrf2 és Nqo1 primer antitest 1: 1000 hígításával inkubáltuk. A második napon a membránokat mossuk, majd inkubáljuk torma-peroxidáz szekunder antitest 1: 5000-es hígításával (tételszám: D2409 és G1009; Santa Cruz Biotechnology) 1 órán át. Az átvitt fehérjéket elektrokemilumineszcencia detektáló készlettel (tételszám: 09065A2; Millipore) és a membrán rövid expozícióját röntgenfilmekkel tettük láthatóvá. β-aktint (tételszám: 028K4826; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) használtunk belső referenciaként.

Statisztikai analízis

2. táblázat

Májindex, szérum HA, ALT és SOD, MDA, máj homogenizátum GST különböző csoportokban (átlag ± SD)

Csoport	n	Májindex (relatív májtömeg)	HA (ng/ml)	ALT (U/L)	SOD (μ/mg)	MDA (nmol/mg)	GST (μ/mg)
A	8.	0,03 ± 0,000	351,75 ± 125,16	57,25 ± 6,88	1,76 ± 0,34	0,206 ± 0,052	5,95 ± 1,97
B	8.	0,054 ± 0,009 a	828,50 ± 237,83 a	203,25 ± 31,62 a	1,08 ± 0,19 a	0,335 ± 0,056 a	7,30 ± 1,26 a
C	9.	0,038 ± 0,008 c	502,33 ± 110,57 c	149,44 ± 16,51 a c	1,36 ± 0,09 c	0,294 ± 0,026 a c	7,37 ± 0,87 a
D	8.	0,036 ± 0,007 c	524,25 ± 255,42 c	136,88 ± 10,07 a c	1,42 ± 0,13 c	0,285 ± 0,025 a c	7,35 ± 0,88 a
E	8.	0,036 ± 0,005 c	499,25 ± 198,10 c	127,38 ± 11,03 a c	1,50 ± 0,15 c	0,284 ± 0,028 a c	7,81 ± 1,16 a

Májszövet minden patkánycsoportban (HE festés, 40-szeres nagyítás). V: Fénymikroszkópia, amely a normál májszövetet mutatja a kontrollcsoportban; B: markáns ﬁ brózis a modellcsoportban; C-E: A patológiás változás a kezelési csoportban enyhébb volt, mint a modellcsoportban.

3. táblázat

A májfibrózis mértéke minden patkánycsoportban