Az alacsony dózisú aszpirin hatása az érgyulladásra, a lepedék stabilitására és az aterogenezisre alacsony sűrűségű lipoprotein receptor-hiányos egerekben

A Pennsylvaniai Egyetem Kísérleti Terápiás Központjától és a Farmakológiai Tanszéktől, Philadelphia Orvostudományi Kar.

A Pennsylvaniai Egyetem, Kísérleti Terápiás Központ és Farmakológiai Tanszék, Philadelphia Orvostudományi Kar.

Ön a cikk legfrissebb verzióját nézi. Előző verziók:

Absztrakt

Háttér- Az érelmeszesedés összetett érrendszeri gyulladásos betegség. Az alacsony dózisú aszpirin az érelmeszesedés érrendszeri szövődményeinek megelőzésének fő támasza. Meg akartuk állapítani az alacsony dózisú aszpirin hatását az érgyulladásra, a lepedék összetételére és az aterogenezisre magas zsírtartalmú étrenddel táplált LDL-receptor-hiányos egerekben.

Módszerek és eredmények— LDL-receptor-hiányos egerekben, amelyek magas zsírtartalmú étrendet fogyasztottak, összehasonlítva a kontroll egerekkel, az alacsony dózisú aszpirin a keringési szint jelentős csökkenését és az oldható intercelluláris molekula-1, a monocita kemoattraktáns fehérje-1, a tumor nekrózis-faktor-a, az interleukin jelentős csökkenését idézte elő. -12p 40, a lipidszint befolyásolása nélkül. Ehhez a nukleáris faktor κB aktivitásának jelentős csökkenése társult az aortában. Az alacsony dózisú aszpirin az érelmeszesedés mértékét is jelentősen csökkentette. Végül az aszpirinnel kezelt állatok aorta érrendszeri elváltozásai 57% -os csökkenést mutattak (P 1 Az aszpirin terápiás hatását általában a vérlemezkék gátló funkciójának tulajdonítják. 2,3 Teljesen tisztázatlan, hogy az aszpirin in vivo mélyebben és összetettebben hat-e, különösen az érrendszerben. Az elmúlt évtizedet egyre több bizonyíték jellemezte, hogy az érelmeszesedés az érrendszer gyulladásos betegsége. 4 A keringő gyulladásos markerek szintje tehát megjósolja a szív- és érrendszeri események kockázatát az érelmeszesedéses betegségben, 5 és az aszpirinbevitel csökkenti ezeket a szinteket és az érrendszeri események kockázatát. Korábban kimutattuk, hogy az indometacin, egy aszpirinszerű gyógyszer, elnyomta a tromboxán (Tx) A2 bioszintézisét és csökkentette az érelmeszesedést. Ebben a vizsgálatban az indometacin jelentősen csökkentette a prosztaciklint (PGI2) is, amelynek in vitro gyulladáscsökkentő hatása van. Gátolja a vérlemezkék aktiválódását, a leukocita-adhéziós kölcsönhatásokat, valamint az erek simaizomsejtjeinek migrációját és szaporodását, amelyek mind antiaterogén hatásúak lehetnek. 8 Legjobb tudomásunk szerint az aszpirin és más gyulladáscsökkentők hatása az atherogenezis érrendszeri gyulladásos komponensére és a lepedék összetételére nem ismert.

A jelen tanulmányokat két kérdés megválaszolására tervezték. Először azt szerettük volna megállapítani, hogy az alacsony dózisú aszpirin hatással van-e az érgyulladásra az aterogenezis során. Másodszor, meg akartuk határozni ennek a farmakológiai beavatkozásnak a plakk-összetételre gyakorolt hatását magas zsírtartalmú étrendben lévő LDL-receptor-hiányos (LDLR -/-) egerekben. Az aszpirin hosszú távú beadása jelentősen csökkenti az érgyulladást és az aorta érelmeszesedését. Ezenkívül csökkenti a makrofág-hab sejttartalmat, de növeli a kollagén mennyiségét és az érelmeszesedési plakkokban jelen lévő simaizomsejtek számát. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az aszpirin antiaterogén hatást fejt ki nemcsak a vérlemezkék aktivációjának gátlásával, hanem az érgyulladás elnyomásával és a plakk stabilitás növelésével is.

Mód

Állatok

Az LDLR -/- egereket (10 alkalommal vissza keresztezve a C57BL/6 egerekhez) a Jackson Laboratories-tól (Bar Harbor, Maine) szereztük be 6 hetes korban. Az összes eljárást és az állatok gondozását a Pennsylvaniai Egyetem IACUC-ja hagyta jóvá. 2 hét akklimatizáció után magas zsírtartalmú étrendet (0,15% koleszterinnel és 20% vajzsírral kiegészített normál chow-t) kaptak az egész vizsgálat során. Ekkor az állatokat 2 csoportra osztották (n = 14 mindegyik), és randomizálták, hogy placebót vagy aszpirint (30 mg/l) kapjanak ivóvízükben, amelyet minden második nap friss vízzel helyettesítettek. Figyelembe véve, hogy minden állat átlagosan 3-4 ml vizet iszik naponta, ez 30 g súlyú egér esetében napi 90–120 μg aszpirinnel egyenlő. A testskálával igazított skálán ez a mennyiség 180–240 mg/nap lenne, ha az állatok súlya 60 kg. A vizeletet és a plazmát összegyűjtötték az aszpirin megkezdése előtt (kiindulási helyzet, 8 hetes életkor) és a vizsgálat végén (26 hetes életkor), az előzőekben leírtak szerint. 7,9

COX-1 aktivitás Ex Vivo

Az ex vivo COX-1 aktivitást a szérum TxB2 és az arachidonsav (100 μM) által indukált vérlemezke aggregáció mérésével értékeltük, az előzőekben leírtak szerint. 7,9

Biokémiai elemzések

A szérum TxB2-t, a vizelet 2,3-dinoros TxB2-ét és a 2,3-dinoros 6-keto PGF1a-t gázkromatográfia/tömegspektrometriás vizsgálatokkal mértük, az előzőekben leírtak szerint. A 7,9 plazma koleszterin és triglicerid szintjét enzimatikusan határoztuk meg Sigma reagensek (Sigma Chemical Co) segítségével. Az oldható intercelluláris adhéziós molekula-1 (sICAM-1), a monocita kemoattraktáns fehérje-1 (MCP-1), a tumor nekrózis faktor-α (TNF-a) és az interleukin-12 p40 (IL-12p40) szintjét ELISA kit-ekkel mértük., a gyártó utasításainak betartásával (Pierce Endogen).

A citokinek aorta képződése

Miután az egereket leöltük, az aortafát EDTA-t (2 mmol/l) és butilezett hidroxi-toluol BHT-t (20 μmol/l) (pH 7,4) tartalmazó perfúzióval perfundáltuk egy kanül behelyezésével a bal kamrába és a bemetszésből szabad kiáramlást. az alsó vena cava-ban. A környező adventitialis zsírszövet eltávolítása után a mellkasi aortát elválasztották az ívtől és a hasi régióktól. A mellkasi aorta egy centiméterét (n = 5) levágtuk és szérummentes táptalajban inkubáltuk 37 ° C-on 24 órán keresztül, enyhe rázással. Az inkubációs idő végén a felülúszókat összegyűjtöttük, és megvizsgáltuk a citokinszintet.

Elektroforetikus mobilitási elmozdulás

Az egér aortákból (hasi régiókból) származó nukleáris kivonatokat habarcs és mozsártöréssel disszociáltuk, majd NE-PER nukleáris és citoplazmatikus extrakciós reagensekkel (Pierce Chemical Co) extraháltuk. A fehérjekoncentrációkat Bradford módszerrel (Bio-Rad Laboratory) határoztuk meg. Kétszálú nukleáris faktor-κB (NF-κB) konszenzusos oligonukleotidot (5′-AGTTGAGGGGGA-CTTTCCCAGGC-3 ′) (Promega Corp, Madison, Wis) használtunk próbaként az 5'-végi jelölés és tisztítás után. A kötési reakciókat az alábbiak szerint hajtottuk végre: a magkivonatokat (10 μg fehérje) radioaktívan jelölt DNS-szondákkal (70 fmol, 2,5x10 4 cpm) inkubáltuk szobahőmérsékleten 30 percig 20 μL kötőpufferben (4% glicerin; 1 mmol/1). L MgCl2; 0,5 mMEDTA; 0,5 DTT; 50 mmol/l NaCl; 10 mmol/l trisz-HCl, pH 7,5; 0,05 mg/ml poli dI-dC). Versenyző jelöletlen oligonukleotidot adunk a reakcióhoz 50-szeres moláris feleslegben. A szupershift assay elemzésekhez a mintákat anti-p50, anti-p65, anti-C-Rel vagy anti-p52 nyúl poliklonális antitestekkel (Santa Cruz Biothecnol, Santa Cruz, Calif) inkubáltuk. A kötési reakció termékeit elektroforézissel végeztük 5% nem denaturáló poliakrilamid géleken, 1x TB pufferben. A géleket megszárítottuk és autoradiográfiával elemeztük. A vizsgálatokat mindig vak módon hajtották végre.

Egérorták elkészítése és az ateroszklerózis számszerűsítése

A végső vérgyűjtés után az egereket leöltük, és az aortafát 10 percig jéghideg PBS-sel perfundáltuk, a korábban leírtak szerint. 7,9 Az aortát az aorta gyökerétől hosszanti irányban a csípő elágazásáig nyitottuk, formális szacharózban rögzítettük (4% paraformaldehid, 5% szacharóz, 20 μmol/L BHT és 2 mmol/L EDTA, pH 7,4), majd festettük Szudán IV. (N = 9). Az érelmeszesedés mértékét en face módszerrel határoztuk meg. 7,9 Az érelmeszesedést az aorta gyökér keresztmetszeteiben is meghatároztuk frissen fagyasztott TOT-beágyazott szívekből, amint azt korábban leírtuk. 9 Röviden, alternatív 10 μm-es fagyasztott szakaszokat az aorta gyökérnél, amelyek a proximális aorta 300 μm-jét fedik le, a sinustól kezdve, acetonban rögzítették, rehidrálták és olajvörös O-val festették az ateroszklerotikus elváltozásokat. A képeket digitálisan rögzítették és mindig elemezték. vak módon, ahogy azt korábban leírtuk. 7,9

Szövettan és immunhisztokémia

Statisztikai analízis

1113380 táblázat. Testtömeg, plazma-koleszterin, trigliceridek, szérum TxB2, arachidonsav által kiváltott vérlemezke-aggregáció, vizelet 2,3dinorTxB2 és 2,3dinor 6keto PGF1α szintek LDLR -/- egerekben 8 hetes korban (bázis) és 18 hét után egy héten Nagy zsírtartalmú étrend (végleges), alacsony dózisú aszpirinnel vagy anélkül (n = 14 állat minden csoportban)

Érgyulladásos válaszok

Az aterogenezissel járó vaszkuláris gyulladásos válaszok feltárására az LDLR -/- csoportban két kísérleti csoportot hajtottunk végre. Először meghatároztuk az ateroszklerózisban szerepet játszó számos gyulladásos citokin keringési szintjét. 12 A vizsgálat végén az LDLR -/- egereknél (n = 10 minden csoportnál) a magas zsírtartalmú étrendben szignifikánsan megnőtt a sICAM-1 (5,1 ± 1 versus 13,5 ± 1,2 ng/ml, P

1.ábra. Az alacsony dózisú aszpirin csökkenti a citokin termelést. Az aortákat 24 órán át inkubáltuk szérummentes táptalajban, 37 ° C-on. Az inkubációs idő végén a felülúszókat összegyűjtöttük, és ELISA-val megvizsgáltuk az s-ICAM-1, MCP-1, TNF-a és IL-12p40 tartalmát (n = 5 minden csoportnál, *P

Ennek a terápiás rendnek az in vivo molekuláris következményeinek feltárása érdekében bizonyítékokat kerestünk az NF-κB modulációjára, mivel ez a transzkripciós faktor az érrendszeri gyulladásos válaszgének modulációjához kapcsolódik. 13 egeret öltek meg a vizsgálat végén; az aortákat összegyűjtöttük, és a magkivonatokat izoláltuk, és megvizsgáltuk az NF-KB kötő aktivitást. A gél mobilitás elmozdulásának vizsgálati eredményei jelezték ennek a faktornak a funkcionális jelenlétét a magas zsírtartalmú étrendben lévő, 26 hetes LDLR -/- egerekből származó aorta magkivonatokban, NF-KB konszenzus szekvencia szonda alkalmazásával (2. ábra). Ez jelentősen (34%) csökkent az aszpirinnal kezelt állatok nukleáris kivonatmintáiban (2. ábra). Az NF-κB sáv azonosságát versenyvizsgálatokkal igazolták, amelyekben az 50-szeres felesleges jelöletlen NF-κB próba teljesen blokkolta az NF-κB kötési aktivitást (2. ábra). A p65 és p50 elleni antitestekkel végzett szupershift vizsgálatok, valamint az anti-p52 és anti-C-Rel inkubálás tovább erősítették az NF-κB kötő aktivitás specifitását (2. ábra).

2. ábra. NF-κA B-aktivitás csökken az aszpirinnel kezelt LDLR -/- egerek aortáiban. Az LDLR -/- aortáiból származó nukleáris kivonatok (10 μg) DNS-kötő aktivitását placebóra vagy aszpirinre jelölt NF-κB konszenzusos próbával teszteltük elektroforetikus mobilitási elmozdulással. A kötődést inkubálással versenyeztük 50-szeres feleslegben a jelöletlen NF-rel-κB. A nukleáris extraktumokat a p50, p65, C-Rel és p-52 elleni antitestekkel helyettesítettük. Az anti-p50 és anti-p65 sávokat nyíllal, illetve dupla nyílhegyrel jelöltük.

Az aorta ateroszklerózisának elemzése

Az aorta ateroszklerotikus elváltozásának területét két független módszerrel, az en face és a proximális aorta keresztmetszet elemzésével számszerűsítettük. Az aorta ateroszklerotikus elváltozásának átlagos (százalékos átlag) nagysága a placebo csoportban a teljes aorta felület 14 ± 2,3% -a volt; ez az aszpirinnel kezelt egerekben jelentősen, 5,1 ± 1,1% -ra csökkent (P= 0,001) (3. ábra). Az en-face analízishez hasonlóan az aszpirinnel végzett kezelés jelentősen csökkentette az elváltozás méretének keresztmetszeti elemzését a kontroll csoporthoz képest (565 670 ± 21 884 versus 400 385 ± 22 557 μ 2/szakasz, P= 0,03).

3. ábra. A teljes aorta ateroszklerotikus elváltozások százalékos aránya az LDLR -/- egerekben, magas zsírtartalmú étrendben, a vizsgálat végén (26 hetes korban) placebót vagy alacsony dózisú aszpirint kapva (n = 9 csoportonként, *P= 0,001).

Szövettani vizsgálatok

Ezt követően annak megvizsgálására, hogy az alacsony dózisú aszpirinnek van-e hatása a lepedék összetételére, részletes szövettani vizsgálatokat végeztek a makrofágok, a simaizomsejtek és a kollagéntartalom elemzésével. Ez a kezelés 57% -kal csökkentette a makrofágok pozitív területének százalékos arányát (P

4. ábra. Az ateroszklerotikus LDLR -/- egerek reprezentatív aorta sinus elváltozásának területe. Photomicrographs: Aorta gyök keresztmetszetei magas zsírtartalmú étrendben lévő LDLR -/- egerekben placebót (jobb oldali panel) vagy alacsony dózisú aszpirint (bal oldali panel) kaptak. A metszeteket lipid elváltozásokra (olajvörös O) (Oro) festettük, immunfestettük a makrofágtartalomra, a simaizomsejtekre (SMC) vagy a kollagénre (C).

5. ábra. Az alacsony dózisú aszpirin hatása a makrofágok (A), a simaizomsejtek (B) és a kollagén (C) elváltozására LDLR -/- egerekben (n = 10 csoportonként, *P

Vita

Bár a nagy dózisú aszpirin in vitro gátolja az NF-κB aktiválódását, 23–25 azt tapasztaltuk, hogy az alacsony dózisú aszpirin in vivo csökkentette ezt az aktivációt. Számos szempont különbözteti meg tanulmányunkat az ebben a témában végzett vizsgálatok többségétől. Legtöbbjüket in vitro hajtották végre egy sejttípus, nagy dózisú aszpirin, és ami a legfontosabb, egyszeri megfigyelés, amely megegyezett a gyógyszer akut hatásával. Ezzel szemben egy komplex sejtrendszert (egeret) és sokkal alacsonyabb aszpirinmennyiséget, de hosszú távú orális adagolást alkalmaztunk, ami egyenlő lenne a gyógyszer krónikus hatásával. Mindezek a megfontolások megmagyarázhatják a különböző eredményeket. Ennek ellenére feltételezzük, hogy a vaszkuláris NF-κB aktivitás megfigyelt csökkenése nem közvetlenül függhet az aszpirin farmakológiai hatásától, hanem másodlagos esemény.

Az elmúlt években nyilvánvalóvá vált, hogy az érelmeszesedéses lepedék összetétele és a törésre való hajlam a betegség két fontos aspektusa. 26 Itt számolunk be először arról, hogy az alacsony dózisú aszpirin jelentős hatással van a lepedék összetételére. Növeli a simaizomsejtek számát és a kollagéntartalmat, de csökkenti az aorta ateroszklerotikus elváltozásainak habsejtjeit. Ezek a megállapítások határozottan arra utalnak, hogy az aszpirinkezelés stabilabb plakkfenotípus kialakulását eredményezi. Jelen tanulmányban nem tehetünk különbséget az aszpirin plakk-összetételre gyakorolt közvetlen hatása és a plakkra gyakorolt másodlagos hatás között antiatherosclerotikus aktivitása miatt. Korábban azonban kimutattuk, hogy az indometacin valóban csökkentette a makrofágokat, de nem befolyásolta az érelmeszesedéses elváltozások simaizomsejt-tartalmát. 7,10 Továbbá ismert, hogy az érelmeszesedés (elváltozás nagysága) csökkenése nem feltétlenül felel meg egy stabilabb fenotípusnak. 7,10

Összefoglalva, tanulmányaink azt mutatják, hogy az aszpirinnek a vérlemezke-gátló hatása mellett további in vivo tulajdonságai lehetnek az érrendszerben, amelyek szintén hozzájárulhatnak antiaterogén hatásához. Ide tartozik az érgyulladás elnyomása és kisebb érelmeszesedéses elváltozások kialakulása, amelyek több kollagént és simaizom sejtet, valamint kevesebb makrofágot és koleszterint tartalmaznak, összhangban a stabilabb plakkos fenotípussal. Vizsgálatunk potenciális korlátja, hogy annak ellenére, hogy aszpirin-rendszerünk hasonlóságot mutat az alacsony dózisú aszpirin beadásának emberi állapotával, vannak olyan szempontok, amelyeket figyelembe kell venni, mielőtt eredményeink átkerülnének az emberi érelmeszesedésbe. Először is, az aszpirin farmakokinetikája eltérhet az emberétől; másodszor, míg az emberek naponta egyszer adják be, a vizsgálatunkban szereplő állatoknak napi többszöri adagolása volt. Figyelembe véve, hogy viszonylag kevés irodalom létezik a gyógyszer érelmeszesedésre gyakorolt hatásáról, 27,28 megfigyelésünk azt sugallja, hogy az aszpirin átértékelése az ateroszklerotikus plakkok progressziójában és összetételében embernél időszerű.

Dr. Praticò ezt a munkát apja, Alfredo emlékének szeretné szentelni. Ezeket a tanulmányokat az Országos Egészségügyi Intézet (HL-54500 és HL-61364) és az American Heart Association (03021N) támogatásával támogatták. Köszönjük Garret A. FitzGeraldnak a hasznos beszélgetést.