A keto-savakkal kiegészített alacsony fehérjetartalmú étrend hatása 5/6 nephrectomizált patkány autofágjára és gyulladására

Yue-yue Zhang, Juan Huang, Man Yang, Li-jie Gu, Jia-yao Ji, Li-jun Wang, Wei-jie Yuan; A keto-savakkal kiegészített alacsony fehérjetartalmú étrend hatása 5/6 nephrectomizált patkány autofágjára és gyulladására. Biosci Rep 2015. október 1 .; 35 (5): e00263. doi: https://doi.org/10.1042/BSR20150069

Hivatkozási fájl letöltése:

BEVEZETÉS

A krónikus vesebetegségben (CKD) szenvedő betegek száma világszerte folyamatosan növekszik. Mivel a dialízis technikák fejlesztésének köszönhetően a CKD-betegek hosszú távú túlélése nagymértékben javult, az alultápláltság gyakoribb és komolyabb, mint valaha. Az alultápláltság és a gyulladásos állapot pozitívan elősegítik egymást egy olyan körben, amely felgyorsítja az artériás elváltozásokat, és végül alultápláltság-gyulladás-érelmeszesedés szindrómát eredményez; növekvő halálozás. A fehérje-energiapazarlást (PEW) javasolták a fehérje- és energiatárolók egyidejű veszteségeinek jelölésére [1], és a vázizom-pazarlás volt a PEW fő jellemzője. A PEW mechanizmusának meghatározása és a beavatkozások feltárása segíteni fog gyakorlati és hatékony kezelési megközelítések biztosításában a CKD betegek klinikai prognózisának javítása érdekében.

A mitofágia, egyfajta specifikus mitokondrium-lebontó autofágia, képes a kóros mitokondriumok megtisztítására és a mitokondriális tömeg szabályozására. Korábbi tanulmányaikban ez a kutatócsoport felfedezte, hogy a CKD a mitophagy aktiválódását és a vázizomzat megnövekedett mitokondirális DNS (mtDNS) szintjét eredményezheti [13]; következetesen ezúttal azt tapasztaltuk, hogy az aktivált mitofágia nem képes megtisztítani a kóros mitokondriumokat, amelyek súlyosbítják a vázizomzat kimerülését az mtDNS és a reaktív oxigénfajok (ROS) által közvetített gyulladás aktiválásával.

A CKD jelenleg alacsony fokú gyulladásos betegségnek számít, amely tovább elősegítheti a fehérje pazarlását a vázizomzatban [14]. Ezenkívül a kaszpáz-1 fokozott proteolitikus aktivitását a vázizomzatban daganat okozta cachexia miatt jelentették [15]. Emellett Rawat et al. [16] beszámolt a NALP3 gyulladásának aktiválódásáról a dyferlinhiányos vázizomzatban, és bebizonyította, hogy az immunsejtek mellett a vázizomsejtek is kialakulhatnak gyulladásos állapotban, ha bizonyos körülmények között stimulálják őket. A NACHT-PYD-tartalmú 3-as fehérje (NALP3) aktiválása apoptózis-asszociált CK-t (ASC) és kaszpáz-1-t tartalmazó foltszerű fehérjét eredményezhet, ami a gyulladás kaszkádjához vezethet.

Köztudott, hogy a fehérje-korlátozott diétaterápia, mint a CKD egyik fő terápiás stratégiája, csökkentheti a glomeruláris hipertranszfúziót és a hiperszűrést [17]; mivel az α-ketoavval (KA) kiegészített alacsony fehérjetartalmú étrend (LPD) terápiája késleltetheti a vesebetegség progresszióját és fenntarthatja a táplálkozási állapotot a CKD-s betegeknél [18]. A kutatócsoport korábbi tanulmányai a Ketosteril Research Award 2010 Alapítvány projektben azt találták, hogy a normál-fehérjetartalmú étrend (NPD) és az LPD terápia összehasonlításához az LPD + KA terápia enyhítheti a vázizomzat kimerülését diabéteszes nephropathiában szenvedő patkányokban, és javíthatja a morfológiai és a mitokondrium funkcionális rendellenességei [13]. Ezenkívül azt is kimutatták, hogy az LPD + KA terápiával kezelt patkányoknál alacsonyabb az autofágia szintje a vázizomzatban, mint a normál fehérje és az LPD csoportban [12]. Ezek a megállapítások azt jelezték, hogy az LPD + KA terápia enyhíti a vázizomzat kimerülését, valószínűleg az aktivált mitofágia szintjének csökkentésével.

A kutatócsoport korábbi tanulmányaiban kimutatták, hogy az LPD + KA terápia gátolhatja a krónikus gyulladásos reakciókat a veseszövetekben [19], de jelenleg nincsenek jelentések a CKD vázizomzatának krónikus gyulladásos állapotára gyakorolt hatásairól, vagy arról, hogy Az LPD + KA terápia javíthatja a mitokondriális rendellenességeket, és megoldhatja az autofágia fel-szabályozását és a vázizomzat elpazarlását, arra következtetve, hogy a mitofágia, mint adaptív védelmi mechanizmus, képes csökkenteni a gyulladásos aktivációt és következésképpen megoldani a vázizomzat elhasználódását az abnormális mitokondriumok eltávolításával és megtisztításával. Az LPD + KA terápia képes megoldani a vázizomzat kimerülését azáltal, hogy javítja a kóros mitofágia-gyulladásos útvonalat.

Ezért krónikus veseelégtelenségi modellként 5/6 nephrectomiával rendelkező patkányok alkalmazásával a jelen tanulmány célja volt a mitofágia, mtDNS, ROS, gyulladásos és egyéb gyulladásos tényezők változásainak megfigyelése a CKD vázizomzatában, az LPD + hatásainak összehasonlítására. KA terápia az ilyen változások javításában, és magyarázza el az LPD + KA terápia molekuláris mechanizmusát a vázizomzat pusztulásának javítására CKD-ben, ezáltal kísérleti bizonyítékot szolgáltatva az LPD + KA terápia klinikai alkalmazására CKD betegek kezelésében.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Állatok és kísérleti tervezés

Vér- és vizeletvizsgálat

A 24 órás vizeletmintákat metabolizmus ketrecekben gyűjtöttük a fehérje elemzéséhez. Vérmintákat vettünk, miután az állatok érzéstelenítést kaptak a szérum albumin-, kreatinin- és karbamid-nitrogénszint mérésére. Az összes vizsgálatot rutineljárások szerint végeztük a Sanghaji Jiaotong Egyetem Első Népi Kórházának biokémiai laboratóriumában.

ELISA

A citokin koncentrációkat ELISA-val határoztuk meg. Az interleukin tumor nekrózis faktor-a (TNF-a), az interleukin-6 (IL-6), az IL-1β és az IL-18 plazmaszintjét a gyártó utasításainak megfelelően elemeztük. Minden szérumból száz mikroliteret keverünk össze vizsgálati pufferrel, és az abszorbanciát 420 nm-en mértük Synergy 2 ELISA lemezolvasóval (Bio-Tek).

Szövettan

A Gastrocnemius izommintákat az állatok leölése után gyűjtöttük össze. A mintákat három csoportra osztottuk elektronmikroszkóppal (EM), Haematoxylin és Eosin (H&E) festés céljából, vagy azonnal lefagyasztottuk, és –80 ° C-on tartottuk a valós idejű PCR és a Western blot elemzés céljából.

Transzmissziós elektronmikroszkóp (TEM)

A TEM általi megfigyeléshez az izomintákat 2% glutáraldehidben rögzítettük 0,1 M kakodilát pufferben. A mintákat utólag rögzítettük 1% -os ozmium-tetroxidban ugyanabban a pufferben, dehidratáltuk osztályozott etanol-sorozatokkal és eponba ágyazottuk, amint azt korábban leírtuk [21]. Az ultravékony metszeteket uranil-acetáttal és ólommal citráltuk, majd Philips CM120 TEM (FEI) segítségével elemeztük.

Haematoxilin és eozin

Az izommintákat megtisztítottuk a látható kötőszövet- és zsírszövetektől, valamint a vértől, majd lemértük. A gastrocnemius izmokat fagyasztva rögzítettük folyadék-nitrogénnel hűtött izopentánban, és –70 ° C-on tároltuk, a korábban leírtak szerint [22]. 10 mm vastagságú soros keresztmetszeteket festettünk H & E-vel. A myofibre méreteket Image-Pro Plus szoftverrel (Media Cybernetics) mértük, és az izomrost keresztmetszeti területét (CSA) minden patkány 50 izomszálának elemzésével számítottuk ki. A rost CSA-t öt területről határoztuk meg 40-szeres nagyítással.

Mitokondriális membránpotenciál

A mitokondriális membránpotenciált (MMP) a JC-1 (5,5 ′, 6,6′-tetraklór-1,1 ′, 3,3′-tetraetil-benzimidazol-karbocianin-jodid) MMP detektáló készlet (Beyotime) segítségével határoztuk meg. A JC-1 egy kationos fluoreszcens festékpróba (zöld mint monomer/piros mint aggregátum), amely a mitokondriumokban potenciálfüggő módon halmozódik fel. A funkcionális mitokondriummal rendelkező sejtek tartalmazzák a JC-1-t, ami JC-1 aggregátumok képződéséhez vezet, amelyek vörös spektrális eltolódást mutatnak, ami a vörös (fluoreszcencia, FL-2 csatorna) és zöld monomerekben (kimutatható FL-1 csatorna). Az összeomlott mitokondriumokkal rendelkező sejtek főleg zöld JC-1 monomereket tartalmaznak. Ezeket az előzőekben leírtak szerint hajtottuk végre [23]. Az összes standardot, kontrollt és mintát két példányban olvastuk el.

Western blot elemzés

A szöveti lizátumokat folyékony nitrogénben fagyasztott mintákból állítottuk elő. A mintákat porítottuk és RIPA-pufferben 2 órán át, 4 ° C-on lizáltuk. A lizátumokat 10000-nál centrifugáltuk g 10 percig 4 ° C-on, és a felülúszókat külön csövekbe helyeztük. Azonos térfogatú (20 mg) fehérjét SDS/PAGE alkalmazásával elválasztottuk és nitrocellulóz membránokra vittük. A membránokat egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on, 5% sovány tejben, primer antitestekkel. Az alkalmazott antitestek a következők voltak: PTEN által indukált feltételezett kináz 1 (PINK1) (Abcam); Parkin (Abcam); LC3 (Abcam); P62 (Abcam); TNF-a (Abcam); IL-6 (Abcam); NALP3 (Abcam); IL-18 (Abcam); ASC (Mikulás); kaszpáz-1 (Mikulás); IL-1β (Mikulás); GAPDH (glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz; Cell Signaling Technology). A membránokat ezután másodlagos nyúlellenes IgG-vel (Beyotime Biotechnológiai Intézet), antitesttel vagy egér-ellenes IgG-vel (Beyotime Biotechnológiai Intézet) vagy torma-peroxidázzal konjugált antitest (Beyotime Biotechnológiai Intézet) alkalmazásával inkubáltuk. A sáv vizualizációja ECL Western Blotting Substrate kit (Millipore) segítségével történt.

A mitokondriális ROS-t MitoSOX (Invitrogen) festéssel mértük (5 μM 15 percig 37 ° C-on). A mitokondriális tömeg mérésére a szöveteket 25 nM MitoTracker Green FM és MitoTracker Deep Red FM (Invitrogen; 15 perc 37 ° C-on) festettük. Az adatokat BD FACS Canto II áramlási citométerrel (BD Biosciences) gyűjtöttük és FlowJo analitikai szoftverrel (Treestar) elemeztük.

Kvantitatív valós idejű PCR

A teljes genomi DNS-t izomintákból izoláltuk a TIANamp Genomic DNA kit (Tiangen) segítségével a gyártó utasításainak megfelelően. A relatív mitokondriális DNS-szintet kvantitatív, valós idejű PCR elvégzésével mértük ABI PRISM7300 szekvencia detektáló rendszerben. Két független reakciót hajtottunk végre kimutatott primerek alkalmazásával a mitokondriális és nukleáris géneknél. Az mtDNS kópiaszámát kvantitatív PCR-rel mértük, és a nukleáris DNS szintjére normalizáltuk a citokróm c-oxidáz 1 (mtCOI) DNS arányában a nukleáris DNS-hez viszonyítva (a 18S riboszomális RNS-t kódolva) [24]. A következő primereket használtuk:

18S előre, 5′-GAGAAACGGCTACCACATCC-3 ’;

18S hátramenet, 5'-CACCAGACTTGCCCTCCA-3 ';

és COI előre, 5'-CATCCTCCATAGTAGAAGC-3 ';

COI hátramenet, 5′-CCTAAGATAGAAGACACCC-3 ′.

Az mtDNS citoszolban történő méréséhez normalizáltuk a felülúszó fehérje koncentrációját és térfogatát, majd 10000 ° C-on centrifugáltuk g 30 percig 4 ° C-on a citoszolos frakciónak megfelelő felülúszó előállításához. DNS-t izoláltunk 200 μl citoszolos frakcióból. Az mtCOI DNS példányszámát kvantitatív valós idejű PCR-rel mértük, azonos térfogatú DNS-oldattal.

Statisztikai analízis

A ketoav-kezelés tovább javíthatja a vizelet fehérjéjét és a biokémiai paramétereket

A szérumalbumin, a PEW diagnózisának biokémiai mutatója, erősen megjósolja a mortalitást a fenntartó hemodialízisben szenvedő betegeknél [39]. A szérum albumin alacsonyabb volt a CKD csoportokban, mint a kontroll csoportban. A CKD csoportok közül az LPD csoport alacsonyabb volt, mint az NPD csoport, az LPD + KA csoport magasabb volt, mint az LPD csoport, de a különbségek nem voltak szignifikánsak. A vér karbamid-nitrogénje és a kreatinin az NPD csoportban volt a legmagasabb, az LPD csoportban pedig csökkent; az LPD + KA csoportban volt a legalacsonyabb érték, de a különbség nem volt szignifikáns a CKD csoportok között. A vizeletfehérje volt a legmagasabb az NPD csoportban, szignifikánsan csökkent az LPD csoportban és a legalacsonyabb az LPD + KA csoportban (2. ábra).

A vizelet fehérje és a kísérleti csoportok biokémiai paraméterei

A ketoacid kezelés tovább javíthatja a gastrocnemius izom autofágia/mitofágia kialakulását

Az autofágia – lizoszomális útvonalban a p62 egy ubiquitin-kötő állványfehérje, amely közvetlenül kötődik az LC3-hoz, hogy megkönnyítse az ubiquitinált fehérje-aggregátumok lebomlását. Az immunblotolás azt mutatta, hogy a p62 és az LC3 növekedett a CKD csoportokban, amelyek közül a p62 és az LC3 egyértelműen magasabb volt az NPD csoportban, mint a kontroll csoportban, de alacsonyabb volt az LPD csoportban, bár a p62 nem változott szignifikánsan. Ezenkívül a KA-kiegészítés tovább csökkentette a p62-t és az LC3-t, de a különbség szintén nem volt szignifikáns (3A – 3C. Ábra).

Az autofágia/mitofágia változása a kísérleti csoportokban

A mitokondriumok depolarizációja, az MMP csökkenése a mitofágia megindulásának markere. Az NPD csoport szignifikáns csökkenést mutatott az MMP-ben, mint a kontroll csoport, az LPD csillapíthatta az MMP csökkenését, míg az LPD + KA tovább csökkentette az MMP-t (3D ábra). Mint ismert, a mitokondriális lokalizációjú PINK1, amely általában gyorsan lebomlik, a mitokondriumok depolarizálásakor stabilizálódik a külső mitokondriális membránon (OMM) [40]. A felhalmozódott PINK1 a citoszolos Parkint toborozza depolarizált mitokondriumokba, ami E3 aktivitásának aktiválódását eredményezi, majd a Parkin ubiquitinálja a mitokondriális szubsztrátot. A szubsztrátok PINK1 általi foszforilezése előidézi az OMM fehérjéjét, hogy vagy kölcsönhatásba lépjen a Parkinnal, így szekvenálva a citoszolos Parkint a mitokondriumba, vagy hogy a Parkin ubiquitinizálja [41]. A Parkin és a PINK1 az NPD csoportban volt a legmagasabb és az LPD csoportban csökkent, bár a különbség nem volt szignifikáns. A KA kiegészítés tovább csökkentette a Parkin és a PINK1 értékeket, és az NPD csoport és az LPD + KA csoport közötti különbség szignifikáns volt (3E. És 3F. Ábra).

Ami a TEM képeket illeti, az NPD csoportban egyértelműen több autofagoszómát vagy autolizoszómát találtunk, mint a kontrollcsoportot, de az LPD csoportban az autofagoszóma vagy az autolizoszóma szignifikánsan csökkent és tovább csökkent az LPD + KA csoportban, az LPD + KA csoporthoz hasonlóan a kontrollcsoport (4. ábra).