Az alacsony dózisú eritropoietin serkenti az egerek csontgyógyulását †

Trauma-, kéz- és rekonstruktív sebészeti tanszék, Saarlandi Egyetem, Homburg/Saar, Németország

dózisú

Együttműködési Kutatóközpont, AO Alapítvány, Homburg/Saar, Németország

Trauma-, kéz- és rekonstruktív sebészeti tanszék, Saarlandi Egyetem, Homburg/Saar, Németország. T: + 49-6841-16-31502; F: + 49-6841-16161503 Keresse meg a szerző további cikkeit

Trauma-, kéz- és rekonstruktív sebészeti tanszék, Saarlandi Egyetem, Homburg/Saar, Németország

Együttműködési Kutatóközpont, AO Alapítvány, Homburg/Saar, Németország

Együttműködési Kutatóközpont, AO Alapítvány, Homburg/Saar, Németország

Klinikai és Kísérleti Sebészeti Intézet, Saarlandi Egyetem, Homburg/Saar, Németország

Együttműködési Kutatóközpont, AO Alapítvány, Homburg/Saar, Németország

Klinikai és Kísérleti Sebészeti Intézet, Saarlandi Egyetem, Homburg/Saar, Németország

Trauma-, kéz- és rekonstruktív sebészeti tanszék, Saarlandi Egyetem, Homburg/Saar, Németország

Együttműködési Kutatóközpont, AO Alapítvány, Homburg/Saar, Németország

Trauma-, kéz- és rekonstruktív sebészeti tanszék, Saarlandi Egyetem, Homburg/Saar, Németország

Együttműködési Kutatóközpont, AO Alapítvány, Homburg/Saar, Németország

Trauma-, kéz- és rekonstruktív sebészeti tanszék, Saarlandi Egyetem, Homburg/Saar, Németország

Együttműködési Kutatóközpont, AO Alapítvány, Homburg/Saar, Németország

Együttműködési Kutatóközpont, AO Alapítvány, Homburg/Saar, Németország

Klinikai és Kísérleti Sebészeti Intézet, Saarlandi Egyetem, Homburg/Saar, Németország

Trauma-, kéz- és rekonstruktív sebészeti tanszék, Saarlandi Egyetem, Homburg/Saar, Németország

Együttműködési Kutatóközpont, AO Alapítvány, Homburg/Saar, Németország

Trauma-, kéz- és rekonstruktív sebészeti tanszék, Saarlandi Egyetem, Homburg/Saar, Németország. T: + 49-6841-16-31502; F: + 49-6841-16161503 Keresse meg a szerző további cikkeit

Trauma-, kéz- és rekonstruktív sebészeti tanszék, Saarlandi Egyetem, Homburg/Saar, Németország

Együttműködési Kutatóközpont, AO Alapítvány, Homburg/Saar, Németország

Együttműködési Kutatóközpont, AO Alapítvány, Homburg/Saar, Németország

Klinikai és Kísérleti Sebészeti Intézet, Saarlandi Egyetem, Homburg/Saar, Németország

Együttműködési Kutatóközpont, AO Alapítvány, Homburg/Saar, Németország

Klinikai és Kísérleti Sebészeti Intézet, Saarlandi Egyetem, Homburg/Saar, Németország

Trauma-, kéz- és rekonstruktív sebészeti tanszék, Saarlandi Egyetem, Homburg/Saar, Németország

Együttműködési Kutatóközpont, AO Alapítvány, Homburg/Saar, Németország

Trauma-, kéz- és rekonstruktív sebészeti tanszék, Saarlandi Egyetem, Homburg/Saar, Németország

Együttműködési Kutatóközpont, AO Alapítvány, Homburg/Saar, Németország

Trauma-, kéz- és rekonstruktív sebészeti tanszék, Saarlandi Egyetem, Homburg/Saar, Németország

Együttműködési Kutatóközpont, AO Alapítvány, Homburg/Saar, Németország

Együttműködési Kutatóközpont, AO Alapítvány, Homburg/Saar, Németország

Klinikai és Kísérleti Sebészeti Intézet, Saarlandi Egyetem, Homburg/Saar, Németország

P. Garcia és V. Speidel egyformán járult hozzá ehhez a munkához.

Absztrakt

A vörösvértestek proliferációjának szabályozásában betöltött szerepén túl a glikoprotein eritropoietin (EPO) kimutatták, hogy számos nem vérképző szövetben védő és regeneráló hatást fejt ki. 1

Egy korábbi vizsgálatban kimutathattuk, hogy 5000 U/kg EPO napi 5 napon át történő alkalmazása (nagy dózisú, rövid időtartamú) növeli a korai endokondrális csontosodást és a mechanikai szilárdságot egerek zárt combcsonttörési modelljén. 2 Az EPO rövid idejű és nagy dózisú alkalmazásának kezdeti hatása azonban öt hét után eltűnt, valószínűleg az egerek zárt töréseinek jó gyógyító reakciója és az EPO beadásának csak a törést követő 5 napra való korlátozása miatt. Jelen tanulmányban azt elemeztük, hogy az EPO képes-e felgyorsítani az egerek kis szegmentális hibáival járó törések gyógyulását. Mivel számos tanulmány kimutatta, hogy a szövetvédelem eléréséhez nincs szükség nagy, legfeljebb 5000 U/kg/nap EPO-dózisra, és hogy ez a magas dózis káros hatásokkal járhat együtt, 3 alacsony dózisú kezelést csak 500 E/kg/nap EPO. Továbbá, mivel a törésgyógyulás során az EPO-receptor kimutatták, hogy a periostealis kalluszban expresszálódik több héten keresztül, 2 EPO-t adtak hosszú távú kezelésként 5 héten keresztül.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Állatok

Összesen 52 CD ‐ 1 egeret (35 ± 3 g testtömeg) használtunk ebben a vizsgálatban. Az egereket 12 órás nappali/éjszakai ciklusban, vízzel és táplálékkal ad libitum alkalmazásával tartottuk. Valamennyi kísérletet az Országos Egészségügyi Intézet kísérleti állatok felhasználására vonatkozó irányelveinek betartásával hajtották végre, és az állatok védelméről szóló német jogszabályok (engedélykód K110/180-07) jóváhagyták őket. Az egereket naponta EPO-val kezeltük (500 E/ttkg (testtömeg)), csak intraperitoneális injekcióval vagy vivőanyaggal. Az állatokat 2 és 5 hetes törésgyógyulás után méhnyak diszlokációval leöltük radiológiai, biomechanikai és hisztomorfometriai elemzés céljából (n = 8 csoportonként). Az eritrocitákat, a hemoglobint és a hematokritot teljes vérmintákban mértük a megfigyelési periódus végén. További állatokat megöltünk 2 hét elteltével a Western blot elemzés céljából (n = 3 csoport) és a keringő endotheliális progenitor sejtek áramlási citometriával történő elemzéséhez (n = 6 csoport).

Sebészeti eljárás

Az egereket 25 mg/ttkg xilazin és 75 mg/ttkg ketamin intraperitoneális injekcióval altattuk. Steril körülmények között 4 mm-es medialis parapatelláris bemetszést hajtottunk végre a jobb térdnél, és a térdkalácsot oldalirányban elmozdítottuk. Miután furatot fúrtunk (Ø = 0,5 mm) az intracondyláris résbe, egy disztálisan lapított 4 tűt 4 implantáltunk intramedullárisan, és a sebet lezártuk. Ezután a combcsont közepét oldalirányú megközelítéssel állítottuk ki, és 4 mm hosszúságú egyedi klipet ültettünk ventor-dorálisan a combcsontba, az előzőekben leírtak szerint. 5 Gigli drótfűrésszel 0,25 mm résméretű oszteotómiát hoztunk létre. A seb lezárása befejezte az operatív eljárást.

Radiológiai elemzés

A 2–5 hetes megfigyelési periódus végén az egereket altattuk (25 mg/ttkg xilazin és 75 mg/ttkg ketamin), és a meggyógyult comb ventro-dorzális röntgenfelvételeit készítettük (MX-20D, Faxitron (Lincolnshire, IL). A kallus átmérőjét a combcsont átmérőjéhez (%) és a kallusz sűrűségét az ipsilaterális tibialis fejhez (%) viszonyítva képelemző rendszerrel mértük (ImageJ, NIH, Bethesda, MD).

Biomechanikai elemzés

Az implantátumok eltávolítását követően mechanikai tesztet hajtottak végre. A kontra-laterális combcsont párosított kontrollként szolgált. A hajlítási merevséget roncsolásmentes hárompontos hajlítási teszttel elemeztük (1454 Zwick, Ulm, Németország). A combcsontot a hárompontos vizsgálóberendezésre rögzítettük, a combcsont oldalirányával felfelé (6 mm munkahossz). Ezután a femorákat állandó, 1 mm/perc sebességgel töltöttük be. A terhelés alakváltozási görbéjét rögzítettük, és a hajlítási merevséget kiszámítottuk a terhelés alakváltozási görbéjének lineáris meredekségeként. Minden adatot az ellenoldali egészséges combcsont százalékában adunk meg.

Hisztomorfometrikus elemzés

A reszekció után a meggyógyult combcsontot IHC cinkfixálóban (BD Pharmingen, San Diego, Kalifornia) rögzítettük 12–24 órán át, 10% EDTA-oldatban 3 hétig meszeztük és paraffinba ágyazottuk. 5 um vastagságú hosszmetszeteket vágtunk és festettünk Masson és Goldner trikróm módszerével. 1,25 × nagyítással (Olympus BX60 mikroszkóp, Olympus, Tokió, Japán; Zeiss Axio Cam és Axio Vision 3.1, Carl Zeiss, Oberkochen, Németország; ImageJ Analysis System, NIH) a strukturális indexeket a nómenklatúra és a az American Society of Bone and Mineral Research (ASBMR) ajánlásai: (i) periostealis kallusz területe [Pc.Ar (mm 2)]; (ii) maximális kalluszátmérő/combcsontátmérő [Cl.Dm/F.Dm] és (iii) a csont, a porc és a rostos szövetek szöveti eloszlása ​​a kallusz területén (%). A periostealis kallusz területét a kallusz külső átmérője határozta meg sugárirányban, és 2 mm távolságra a tengelyirányú törési réstől. Ezenkívül mindkét agykérget elemeztük az oszteotómiás rés csontos áthidalására 2 és 5 hét elteltével.

Immunhisztokémiai elemzés

Western Blot

A kalluszszövetet lefagyasztották, és további feldolgozásig -80 ° C-on tárolták. A mintákat homogenizáltuk és 10 mM Tris (pH 7,5), 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,5% Triton-X 100, 0,02% NaN3, 0,2 mM PMSF és proteáz inhibitor koktél (1: 100; Sigma, Taufkirchen) lízispufferben extraháltuk., Németország). A fehérjéket standard protokollokkal elválasztottuk és membránokra helyeztük, és anti-PCNA (1: 250; Dako Cytomation, Hamburg, Németország) és anti-NFkB (1: 300; Santa Cruz, Heidelberg, Németország) segítségével próbára tettük. A fehérje expresszióját luminol-fokozott kemilumineszcencia (ECL, GE Healthcare, Freiburg, Németország) segítségével vizualizálták, miután a membránt kék fényre érzékeny autoradiográfiás filmnek tették ki (Hyperfilm ECL, GE Healthcare, Freiburg, Németország). A jeleket densitometriásan értékeltük (Geldoc, Quantity one szoftver; BioRad, Hercules, CA) és normalizáltuk a β-aktin jelekre (egér monoklonális anti-β-aktin antitest, 1: 20 000; Sigma, St. Louis, MO). egyenlőtlen terhelés.

Áramlási citometria

Az EPO-val kezelt állatok és kontrollok perifériás vérét 2 hét múlva gyűjtöttük össze. A teljes vér lízise és az Fc blokád (Fc-Block, BD Pharmingen) után az életképes limfocita populációt elemeztük a Sca ‐ 1 ‐ FITC (E13–161.7 klón, BD Pharmingen) és a vaszkuláris endotheliális növekedési faktor receptor ‐ 2 expressziója szempontjából. az A3-as klón, Santa Cruz) konjugálva a megfelelő fikoeritrinnel jelölt másodlagos antitesttel (Sigma, St. Louis, MO), az előzőekben leírtak szerint. 6, 7 izotípusnak megfelelő antitestek szolgáltak kontrollként (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Az egy- és kétszínű áramlási citometriás elemzéseket argonioni lézerrel felszerelt Becton Dickinson FACScan alkalmazásával végeztük. Az adatokat Cellquest szoftverrel értékeltük ki.

Statisztikai analízis

Minden adatot átlagként ± SEM adunk meg. Az adatok nem normális eloszlásának kizárása és az egyenlő variancia feltételezésének igazolása után a kísérleti csoportok közötti összehasonlítást a hallgatók végezték t-teszt. A nem parametrikus adatokhoz Mann – Whitney tesztet alkalmaztunk. A statisztikákat GraphPad Prism 4.0 (San Diego, Kalifornia) alkalmazásával végeztük. A o-érték

EREDMÉNYEK

Hemoglobin

Az EPO-val kezelt állatok teljes vérmintáiban a hemoglobin-koncentráció szignifikánsan magasabb volt, mint a kontrolloknál a 2. héten (19,0 ± 0,4 vs. 12,9 ± 0,2; o

Radiológiai elemzés

2 hetes törésgyógyulás utáni reprezentatív röntgenfelvételeket az 1. ábra mutatja. A periostealis kallus átmérője szignifikánsan nagyobb volt az EPO-val kezelt állatokban, összehasonlítva a kontrollokkal (1. és 2A. Ábra). Ez a különbség azonban 5 hét után eltűnt (2B. Ábra). A kallusz radiológiai sűrűsége szignifikánsan nagyobb volt az EPO-val kezelt állatokban 2 és 5 hét után a kontrollokhoz képest (2C. Ábra, D).

A jobb combcsont reprezentatív röntgenfelvétele 2 héttel a kontroll egér (A) és egy EPO-val kezelt (B) állat törése és stabilizálása után. Vegye figyelembe az EPO-kezelés után megnövekedett kalluszképződést. A rúd 2 mm-t jelent.

Az EPO-val kezelt állatok és a vivőanyaggal kezelt kontrollok radiológiai elemzése. A kallusz átmérője a combcsont átmérőjéhez (%) viszonyítva a törés és a stabilizáció után 2 hét (A) és 5 hét (B) után. A kallusz-sűrűséget az ipsilaterális tibialis fej sűrűségéhez viszonyítva (%) szintén megadjuk a törés és a stabilizáció után 2 héttel (C) és 5 héttel (D). Az adatok átlag ± SEM, *o

Hisztomorfometrikus elemzés

A hisztomorfometrikus elemzés nem mutat különbséget a periostealis kallus átmérőjében (3A, B ábra) és a periostealis kallus területén (az adatokat nem mutatjuk be) 2 és 5 hét elteltével. A törés és a stabilizálás után két héttel a kallusz összetételének elemzése azonban azt mutatta, hogy az EPO-val kezelt állatokban szignifikánsan több csont és szignifikánsan kevesebb porc és rostos szövet volt a kontrollokhoz képest (3C. Ábra). 5 hét múlva ez a különbség eltűnt, és a periostealis kallusz mindkét csoportban főleg csontból állt (3D ábra). Érdekesség, hogy 2 hét elteltével a 8 EPO-val kezelt állat közül 2-nél mindkét kéreg csonthidat mutatott, szemben a 8 kontrollállat egyikével sem. 5 hét után a 8-ból 8, de a 8 kontrollállatból csak 4 gyógyult meg szövettanilag, amint azt a törésrés teljes csonthídja jelzi (o

A periostealis kallus átmérőjének hisztomorfometrikus elemzése a törés és a stabilizálás után 2 hét (A) és 5 hét (B) után. A C és D panel az EPO-val kezelt állatok kalluszának hisztomorfológiailag elemzett összetételét mutatja be, beleértve a rostos szövetet (fehér), a porcot (szürke) és a csontot (fekete) és a kontrollokat a 2. héten (C) és 5 héten (D). törés és stabilizáció. Az adatok átlag ± SEM (A és B) és átlag (C és D); *o

Immunhisztokémiai elemzés

Az érsűrűséget 2 hét múlva analizáltuk a kallusz különböző gyógyító zónáiban (periostealis, centrális, endostealis) a PECAM ‐ 1 (CD31) festésével (4. ábra). Az érsűrűség kvantitatív elemzése a periostealis gyógyító zónában és a központi gyógyító zónában nem mutatott különbséget az EPO-val kezelt állatok és a kontrollok között (5B, C ábra). Az endostealis gyógyító zónában az erek sűrűsége azonban szignifikánsan nagyobb volt az EPO-val kezelt állatokban a kontrollokhoz képest (5A. Ábra).

A repedések és a nem szakszervezetek különböző gyógyulási zónáinak CD31-re festett immunohisztológiai szakaszainak reprezentatív nagy teljesítményű mezői (HPF) a törés és a stabilizáció után a 14. napon. A rudak 100 µm-t képviselnek.

Az érsűrűség (erek/nagy teljesítményű mező (HPF)) kvantitatív elemzése 14 nap elteltével a kontrollokban (fehér sávok) és az EPO-val kezelt állatokban (fekete sávok) az endosztealis gyógyító zónában (A), a központi gyógyító zónában (B) és a periosztealis gyógyító zóna (C). Átlag ± SEM; *o

Biomechanikai elemzés

2 és 5 hét elteltével a hajlítási merevség szignifikánsan nagyobb volt az EPO-val kezelt állatokban a kontrollokhoz képest (6. ábra). Öt hét elteltével azonban az EPO-val kezelt állatokban, illetve a kontrollokban az átlagos hajlító merevség 57%, illetve 32%, a megfelelő kontra-laterális combcsonthoz képest, azt mutatta, hogy a biomechanikai kompetencia teljes helyreállítása még mindig nem sikerült.

A jobb combcsont hajlító merevsége az EPO-val kezelt állatokban és a kontroll állatokban a törés és a stabilizáció után 2 héten (A) és 5 héten (B). Az adatok átlag ± SEM; *o

Western Blot elemzés

A PCNA expressziója, amely a sejtproliferáció indikátorát képezi a törés kalluszban, nem mutatott különbséget a két csoport között (7A. Ábra). Az NFκB expressziója azonban szignifikánsan csökkent az EPO-val kezelt állatokban (7B. Ábra).

A PCNA (A) és az NFκB (B) expressziója a periostealis kalluszban a törés és a stabilizálás után 2 héttel, Western-blot analízissel. Az adatok átlag ± SEM; *o

Áramlási citometriás elemzés

A törés és a stabilizálás után 2 héttel a keringő EPC-k (VEGFR2 +/Sca1 +) 10 000 sejtre jutó számát szignifikánsan növelték az EPO-val kezelt állatokban a kontrollokhoz képest (227,3 ± 19,20 vs. 148,3 ± 21,99; o

VITA

Jelen tanulmány először mutatja, hogy az alacsony dózisú EPO-kezelés jelentősen javítja a kis szegmentális csontdefektusok gyógyulását egerekben. Ezt jelzi a gyógyító femora megnövekedett hajlítómerevsége és a kallusz megnövekedett radiológiai sűrűsége 2 és 5 hét gyógyulás után. Az EPO-kezelés után megnövekedett radiológiai sűrűség összhangban van szövettani eredményeinkkel, amelyek nagyobb arányú csontot mutattak a gyógyító kalluszban.

Kevéssé ismert az EPO törésgyógyulás során kifejtett hatása. Különböző mechanizmusokat írtak le más szövetekben, amelyek révén az EPO kifejtheti nem vérképző hatásait. Agyi ischaemia és metabolikus stressz esetén az EPO kimutatták, hogy a proliferáció stimulálásával közvetlenül befolyásolja a gyógyító szövet sejtjeit. Továbbá kimutatták, hogy az EPO a gyulladás csillapításával, 13 csökkenő nekrózissal, 14 moduláló immunsejtfunkcióval, 15 és őssejtek toborzásával befolyásolja a sérülés helyén a helyi mikrokörnyezetet. Jelen tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy az EPO felgyorsítja-e a gyógyulást a sejtproliferáció stimulálásával. Azonban a PCNA változatlan expressziója az EPO-val kezelt állatok kalluszában a kontrollokhoz képest nem erősítette meg ezt a hipotézist.

Összességében bemutatjuk, hogy az alacsony dózisú, hosszú távú EPO-kezelés jelentősen javítja az egerek kis szegmentális hibáinak gyógyulását. Mivel az EPO széles körben használt gyógyszer, jól ismert biztonsági profillal, nagy érdeklődésre számíthat az EPO alkalmazása prospektív klinikai vizsgálatokban késleltetett törésgyógyulással és nem szakszervezeti képződéssel rendelkező betegeknél.

Köszönetnyilvánítás

Nagyra értékeljük Janine Becker kiváló technikai segítségét. Ezt a tanulmányt a svájci AO alapítvány támogatásával támogatták.