Az alfa-liponsav csillapítja a szívfibrózist Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty patkányokban

Jung Eun Lee

2 Mellkas- és Kardiovaszkuláris Sebészeti Osztály, Gyeongsang Nemzeti Egyetemi Kórház, Gyeongsang Nemzeti Egyetem Orvostudományi Kar, Jinju, Gyeongnam, Koreai Köztársaság

Chin-ok Yi

1 Anatómiai Tanszék, Egészségtudományi Intézet, Gyeongsang Nemzeti Egyetem Orvostudományi Kar, Jinju, Gyeongnam, Koreai Köztársaság

Byeong Tak Jeon

1 Anatómiai Tanszék, Egészségtudományi Intézet, Gyeongsang Nemzeti Egyetem Orvostudományi Kar, Jinju, Gyeongnam, Koreai Köztársaság

Hyun Joo Shin

1 Anatómiai Tanszék, Egészségtudományi Intézet, Gyeongsang Nemzeti Egyetem Orvostudományi Kar, Jinju, Gyeongnam, Koreai Köztársaság

Soo Kyoung Kim

3 Belgyógyászati Klinika, Gyeongsang Nemzeti Egyetemi Kórház, Gyeongsang Nemzeti Egyetem Orvostudományi Kar, Jinju, Gyeongnam, Koreai Köztársaság

Tae Sik Jung

3 Belgyógyászati Klinika, Gyeongsang Nemzeti Egyetemi Kórház, Gyeongsang Nemzeti Egyetem Orvostudományi Kar, Jinju, Gyeongnam, Koreai Köztársaság

Jun Young Choi

2 Mellkas- és Kardiovaszkuláris Sebészeti Osztály, Gyeongsang Nemzeti Egyetemi Kórház, Gyeongsang Nemzeti Egyetem Orvostudományi Kar, Jinju, Gyeongnam, Koreai Köztársaság

Gu Seob Roh

1 Anatómiai Tanszék, Egészségtudományi Intézet, Gyeongsang Nemzeti Egyetem Orvostudományi Kar, Jinju, Gyeongnam, Koreai Köztársaság

Absztrakt

Háttér

A hiperglikémia szív oxidatív stresszhez és a glükóz homeosztázis egyensúlyhiányához vezet. A diabéteszes kardiomiopátiát a szív hipertrófiája és a fibrózis jellemzi. A diabéteszes kardiomiopátia mögöttes mechanizmusait azonban nem teljesen értik. Ez a tanulmány az alfa-liponsav (ALA) szívenergia-anyagcserére, antioxidáns hatásra és fibrózisra gyakorolt hatásainak vizsgálatát célozta Otsuka Long-Evans Tokushima zsíros (OLETF) patkányok szívében.

Mód

Az állatokat 16 héten át nem diabéteszes Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO) patkányokba és cukorbetegségre hajlamos OLETF patkányokba választottuk ALA-val vagy anélkül (200 mg/kg/nap). A diabéteszes kardiomiopátiát Sirius Red-rel végzett festéssel értékeltük. Az ALA hatását az AMPK jelátvitelre, antioxidáns enzimekre és a fibrózissal összefüggő génekre az OLETF patkányok szívében Western-blot-analízissel vagy immunhisztokémiával végezték.

Eredmények

Western-blot-analízis azt mutatta, hogy a szív adenozin-monofoszfát-aktivált kináz (AMPK) szignalizációja alacsonyabb volt az OLETF patkányokban, mint a LETO patkányokban, és hogy az ALA kezelés fokozta a jelátvitelt OLETF patkányokban. Továbbá az ALETF patkányok alacsony antioxidáns aktivitását az ALA-kezelés fokozta. A kollagén lerakódások fokozott Sirius vöröses festése mellett a transzformáló növekedési faktort β1 (TGF-β1) és a kötőszöveti növekedési faktort (CTGF) magasabb szinten fejezték ki az OLETF patkányszívekben, mint a LETO patkányszívekben, és ezen tényezők szintje csökkentette az ALA.

Következtetések

Az ALA fokozza az AMPK jelátviteli, antioxidáns és antifibrogén hatást. A tézisek arra utalnak, hogy az ALA jótékony hatással lehet a diabéteszes kardiomiopátia kezelésére.

Háttér

A mitokondriális ATP szintézisének állandó sebessége és a glükózfelvétel szükséges ahhoz, hogy a szív folyamatosan összehúzódjon [1]. A szívenergia-anyagcsere és az inzulinrezisztencia szabályozatlansága morfológiai változásokat okoz a szívizomban [2]. Különösen a korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a diabéteszes betegeknél a perivaszkuláris és/vagy intersticiális fibrózis a legkiemelkedőbb szívizomszerkezeti változás [3]. Az energiacsere és az inzulinrezisztencia közti összefüggés ellenére a diabéteszes szívben a diabéteszes kardiomiopátia kialakulásának hátterében álló mechanizmus még tisztázatlan.

Az adiponektin olyan adipokin, amely antidiabetikus és atherogén hatású [4]. A hipoadiponektinémia szív oxidatív stresszhez és a glükóz homeosztázis diszregulációjához vezet [5]. Az adiponektint szintetizálja és szekretálja humán és rágcsáló kardiomiociták is [6]. Az inzulinrezisztenciában lévő adiponektin korrelál az adenozin-monofoszfát-aktivált kináz (AMPK) jelátviteli út aktivációjával, amely szerepet játszik a zsírsav oxidációjában és a glükózfelvételben. Az AMPK egy metabolikus stresszérzékelő vagy effektor, amely a sejtben az energiaháztartást szabályozza. Az AMPK-t a máj kináz B1 (LKB1) foszforilálja és aktiválja az AMP/ATP arány növekedésére reagálva [7]. Az aktivált AMPK foszforilálja és inaktiválja az acetil-koenzim A karboxilázt (ACC), amely részt vesz a zsírsav oxidációjában [8]. Adiponektinhiányos egerekben a szívben az AMPK csökkent jelátvitel fokozott szívhipertrófiával jár [9].

A diszfunkcionális AMPK aktivitás csökkenti az antioxidáns gén expressziót, gyulladást és oxidánsok termelését váltja ki [10]. Az oxidánsok túlzott mennyisége szorosan összefügg az inzulinrezisztenciával. A reaktív oxigénfajok (ROS) túltermelését hiperglikémia, diszlipidémia, előrehaladott glikációs végtermékek (AGE) és lipid-peroxidok indukálják [11]. Különösen a mitokondriumokban a ROS termelés fokozódik a diabéteszes szívben, ami a szív energia metabolizmusának csökkenését eredményezi [12].

Az alfa-liponsavat (ALA) eredetileg a mitokondriális α-ketois-dehidrogenázok kötelező kofaktoraként azonosították, és megállapították, hogy fontos szerepet játszik a mitokondriális energia-anyagcserében [13]. Az ALA fokozza a glükóz felhasználását izolált patkány szívekben [14]. Egyre növekvő bizonyítékok arra utalnak, hogy az ALA fenntartja a sejtek antioxidáns státuszát az antioxidáns enzimek felvételének fokozása vagy indukálása révén [15]. Az ALA beadása csökkenti az aorta AGE-tartalmát, a szív mitokondriális szuperoxid termelését és az inzulinrezisztenciát diabéteszes állatmodellekben [16].

Ezért ennek a tanulmánynak a célja az volt, hogy megvizsgálja az étrendi ALA alkalmazásának az AMPK jelátviteli útra és a diabéteszes kardiomiopátia kialakulásához és progressziójához kapcsolódó ROS-ra gyakorolt hatásait.

Anyagok és metódusok

Állatok

Cukorbetegségre hajlamos hím Otsuka Long-Evans Tokushima zsíros (OLETF) patkányok (4 hetesek) és nem diabéteszes kontroll Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO) patkányokat az Otsuka Pharmaceutical Company-tól (Tokushima, Japán) szereztünk be, és az állatban tartottuk fenn. létesítmény a Gyeongsang Nemzeti Egyetemen (Koreai Köztársaság). Valamennyi kísérletet a laboratóriumi állatok felhasználására vonatkozó Országos Egészségügyi Intézet irányelveinek megfelelően hajtották végre. A Gyeongsang Nemzeti Egyetem Egyetemi Állatgondozási Bizottsága állat-kutatási bizottsága jóváhagyta a vizsgálati protokollt. A LETO és OLETF patkányokat külön-külön, 12 órás világos/sötét ciklus váltakozásával helyeztük el. Az OLETF patkányokat (12 hetesek) véletlenszerűen két csoportba osztották (n = 9-10 csoportonként), és standard csirkét etettek ALA-val vagy anélkül (200 mg/kg/nap, Bukwang Pharmaceutical Company, Szöul, Dél-Korea) 16 évig. hétig. A LETO patkányokat standard chow-val etettük ALA nélkül. Valamennyi patkányt lemértük közvetlenül az elejtés előtt, 28 hetes korban.

Szövetgyűjtés és minta előkészítése

A szöveti elemzéshez a patkányokat Zoletil-lel (5 mg/kg, Virbac Laboratories, Carros, Franciaország) altattuk, majd transzkardiálisan perfundáltuk heparinizált sóoldattal, majd 4% paraformaldehiddel 0,1 M foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS). A szíveket ugyanazzal a reagenssel rögzítettük 12 órán át 4 ° C-on. Ezután a mintákat paraffin beágyazás céljából feldolgoztuk, és 5 μm vastag metszeteket vágtunk. A metszeteket hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festettük. A metszeteket BX51 fénymikroszkóppal (Olympus, Tokió, Japán) tettük láthatóvá, és digitális képeket rögzítettünk és dokumentáltunk.

Sirius vörös festés

A kollagének azonosítására általában a Sirius vörös festést alkalmazzák. A szívkollagén felhalmozódásának meghatározásához a deparaffinizált szívmetszeteket Weigert-féle hematoxilinnel (Sigma-Aldrich, MO, USA) 8 percig festettük, mostuk, és 1 órán át picro-sirius vörösnel (Sigma) pihentettük. A metszeteket dehidratálták osztályozott alkoholokon keresztül, xilolban tisztítottuk, fedőlemezzel borítottuk és Permount-tal (Sigma) lezártuk.

Sircol kollagén assay

A Sircol kollagén assay egy festékkötési módszer, amelyet a gyulladás és a sebgyógyulás során újonnan szintetizáló savban és pepszinben oldódó kollagének elemzésére terveztek. A szívszöveteket folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, és a vizsgálat előtt -80 ° C-on tároltuk. A kollagén koncentrációt Sircol assay kit (Bioclor Ltd., Észak-Írország, Egyesült Királyság) segítségével elemeztük a gyártó utasításainak megfelelően. Levontunk egy standard görbét, és kiszámítottuk a minta kollagéntartalmát.

Immunhisztokémia

Deparafinizált szívmetszeteket 10 percig 0,3% H2O2 oldatba helyeztünk. Mosás után a metszeteket hígított blokkoló kecskeszérummal kezeltük 20 percig. A tárgylemezeket egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on, nedvesített kamrában blokkoló szérummal hígított anti-egér-Cu/Zn-szuperoxid-diszmutázzal (SOD) (1: 100, Santa Cruz Biotechnology, USA). Háromszor 0,1 M PBS-sel végzett mosás után a metszeteket 1 órán át szobahőmérsékleten szekunder antitesttel (1: 200) inkubáltuk. Mosás után a metszeteket avidin-biotin-peroxidáz komplex oldatban inkubáltuk (ABC oldat, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). A metszeteket 0,05% diaminobenzidinnel (DAB, Sigma) fejlesztettük ki, amely 0,05% H2O2-t tartalmazott, és osztályozatos alkoholokon dehidratáltuk, xilolban tisztítottuk, fedőlemezzel borítottuk és Permount-tal (Sigma) lezártuk. A metszeteket BX51 fénymikroszkóppal (Olympus) tettük láthatóvá. A kollagén szöveti növekedési faktor (CTGF) immunfestéséhez a szívmetszeteket egy éjszakán át, 4 ° C-on inkubáltuk a nyúl anti-patkány CTGF-fel (1: 500, Abcam, Cambridge, MA, USA). A metszeteket AlexaFluor 594 konjugált szamár nyúlellenes antitesttel (1: 1 000, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) inkubáltuk. A fluoreszcenciát konfokális mikroszkóppal (FV-1000, Olympus) szemléltettük.

Citoszolos és magfrakció

A citoszolos és a magfrakciók esetében a szíveket azonnal kivágták és jéghideg PBS-be helyezték. Jéghideg lízispufferben (10 mM HEPES-KOH [pH 7,9], 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 1 μg/ml aprotinin, 3 μg/ml pepstatin, 0,5 μg/ml leupeptin, 0,5 mM PMSF, aprítás után). 0,5 mM DTT), a szíveket homogenizáltuk. A szív frakcióit Andrews és Faller szerint készítettük [17]..

A membrán frakcionálása

A szíveket azonnal kivágtuk és jéghideg PBS-be helyeztük. Jéghideg hipertóniás lízispufferben történő aprítás után (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM nátrium-vanadát, 5 μg/ml aprotinin, 3 μg/ml pepstatin, 5 μg/ml leupeptin, 1 mM EDTA, 1 mM DTT), a szíveket homogenizáltuk. A homogenizátumokat 12 500 × g sebességgel 15 percig centrifugáltuk. A kapott pelletet újraszuszpendáljuk 1% -os Triton lízis pufferben, és 15 percig 12 500 × g sebességgel centrifugáljuk.

Western blot elemzés

A teljes szívkivonatokhoz a fagyott szíveket egy T-PER szövetfehérje-extrakciós reagensben (Thermo scientitic, IL, USA) homogenizáltuk, amely Halt proteáz inhibitor koktélt (Thermo scientitic) tartalmaz. A következő antitesteket használtuk: LKB1 (Wako Pure Chemical Company, Osaka, Japán); foszfo-AMPK, AMPK, foszfo-acetil-CoA karboxiláz (ACC), ACC, Sterol szabályozó elemhez kötődő protein-1 (SREBP-1, BD Biosciences, CA, USA), glükóz transzporter 4 (GLUT4, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), fejlett glikozilezési végtermékek (RAGE), hem-oxigenáz-1 (HO-1), Cu/Zn-SOD és a transzformáló β1 növekedési faktor (TGF-β1) (mind a Santa Cruz Biotechnology cég) receptora . A membránokat minden antitesttel vagy α-tubulin antitesttel (Sigma) szondáztuk, és fokozott kemilumineszcencia szubsztrát (Pierce, Rockford, IL, USA) segítségével vizualizáltuk. A sávsűrűség mérésére a Multi-Gauge V 3.0 képelemző programot (Fujifilm, Tokió, Japán) használtuk.

Statisztikai analízis

Jelentőség: * P † P (1A. Ábra). 1 A). A szív LKB1 expressziójának szintje szignifikánsan alacsonyabb volt az OLETF patkányokban, mint a LETO patkányokban (p (1B ábra). 1 B). Western-blot-analízis azt mutatta, hogy a szívfoszfo (p) -AMPK és a p-ACC szintje az OLETF patkányokban alacsonyabb volt, mint a LETO patkányokban, és hogy emelkedett az ALA beadása után (p (1C 1 C és D ábra)., Western blot kimutatta, hogy az SREBP-1 expresszió prekurzor szegmense mind az összes, mind a citoszolikus lizátum OLETF patkányokban körülbelül 1,42, illetve 4,51-szeresére nőtt (ábra (1C ábra). 1 C). Az SREBP érett szegmense A -1 érték növekedett az OLETF patkányokban, összehasonlítva a LETO patkányokkal, azonban az ALA kezelés gyengítette az SREBP-1 expressziót az OLETF patkányok szívéből származó teljes és nukleáris lizátumokban (1,24, illetve 2,76 alkalommal, p (1D ábra). 1 D). Az ALA-kezelés fokozta a GLUT4 transzlokációját az intracelluláris helyekről a plazmamembránra.