Az AM80 hatásai az AC261066-hoz képest magas zsírtartalmú étrendes májbetegség-modellben

Szerepek Formális elemzés, vizsgálat, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

A Weill Cornell Medicine farmakológiai osztálya, New York, NY, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Formális elemzés, vizsgálat, írás - áttekintés és szerkesztés

A Weill Cornell Medicine farmakológiai osztálya, New York, NY, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Formális elemzés, vizsgálat, írás - áttekintés és szerkesztés

Gyógyszerészeti tagozat, Weill Cornell Medicine, New York, NY, Amerikai Egyesült Államok, Városi Közegészségügyi Iskola, Hunter College, New York-i Városi Egyetem, New York, NY, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Formális elemzés

A Weill Cornell Medicine farmakológiai osztálya, New York, NY, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Formális elemzés, írás - áttekintés és szerkesztés

A Weill Cornell Medicine farmakológiai osztálya, New York, NY, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Formális elemzés

A Weill Cornell Medicine patológiai osztálya, New York, NY, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Konceptualizálás, vizsgálat, projekt adminisztráció, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Gyógyszerészeti tagozat, Weill Cornell Medicine, New York, NY, Amerikai Egyesült Államok, Weill Cornell Orvosbiológiai Orvostudományi Kar, New York, NY, Amerikai Egyesült Államok

Melis Márta,
Xiao-Han Tang,
Steven E. Trasino,
Viral M. Patel,
Daniel J. Stummer,
Jose Jessurun,
Lorraine J. Gudas

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Melis M, Tang X-H, Trasino SE, Patel VM, Stummer DJ, Jessurun J és mtsai. (2019) Az AM80 hatásai az AC261066-hoz képest a magas zsírtartalmú étrendes májbetegség modelljében. PLoS ONE 14 (1): e0211071. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211071

Szerkesztő: Michael Schubert, a Villefranche-sur-Mer biológiai laboratóriuma, FRANCIAORSZÁG

Fogadott: 2018. október 1 .; Elfogadott: 2019. január 7 .; Közzétett: 2019. január 24

Adatok elérhetősége: Minden lényeges adat a kéziratban és annak kiegészítő információs fájljaiban található.

Finanszírozás: Ezt a kutatást Weill Cornell alapok, valamint az NIH R01 CA043796 és az R01 DK113088 támogatta az LJG számára. A SET-et a NCI T32 CA062948 támogatta a kutatás egy részében. Az MM-t az NCI T32 CA062948 támogatta a kutatás egy részében.

Versenyző érdeklődési körök: A Weill Cornell Medicine (WCM) szabadalmat nyújtott be a kézirat egyes szellemi tulajdonaira, amelyeket a Sveikatal, Inc. engedélyezett. Az LJG és az XHT alapítók és pénzügyi érdekeltségekkel rendelkezik a Sveikatal, Inc. területén. A SET a szellemi tulajdon feltalálója ( IP) a WCM tulajdonában van. Az MM, a VMP, a DJS és a JJ nem jelentenek összeférhetetlenséget a kiadvány kapcsán. Ez nem változtatja meg az adatok és anyagok megosztására vonatkozó PLOS ONE irányelvek betartását. • US20180263924A1 "Metabolikus szindrómával összefüggő állapotok kezelésének módszerei retinsav receptor agonisták alkalmazásával" • US10010512B2 "Módszerek magas zsírtartalmú étrendhez és A-vitamin-hiányhoz kapcsolódó betegségek kezelésére retinsav-receptor-agonisták alkalmazásával".

Bevezetés

Nemrégiben kimutattuk, hogy egy nagyon szelektív RARβ2 agonista, az AC261066 [20] alkalmazása csökkentette a hiperglikémiát és a máj steatosisát számos 2-es típusú cukorbetegség (T2D) és NAFLD egérmodellben [16, 17]. Itt hasonlítottuk össze a RARβ2, az AC261066 szelektív agonistáját a RARα, AM80 [21–23] szelektív agonistájával a magas zsírtartalmú étrend (HFD) által indukált NAFLD egérmodellben. Megállapítottuk, hogy az AC261066 és az AM80 ellentétes hatást mutat, és az AM80 fokozza a HFD által kiváltott NAFLD-t.

Anyagok és metódusok

Mód

A kísérleteket a Weill Cornell Medical College (WCMC) Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottságának (IACUC) irányelveinek megfelelően hajtották végre, minden vonatkozó szövetségi, állami és helyi szabályozásnak megfelelően. Ennek a specifikus vizsgálatnak az összes kísérleti protokollját az IACUC (0705-615A számú állathasználati protokoll) jóváhagyta, beleértve az állatok gondozását, elhelyezését és fertőtlenítését (WCMC Animal Welfare Assurance Number: D16-00186); A WCMC Intézményi Biológiai Biztonsági Bizottság (IBC) laboratóriumi nyilvántartási száma: IBC-18783.

Állatok és kezelések

A vad típusú (súlyú) C57BL/6 hím egereket (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 12 órás világos/sötét ciklusokban tartottuk. 6 hetes korukban ad libitum chow-étrendet fogyasztottak a kcal 13% -ának zsírból (macska # 5053, 15 NE A-vitamin-acetát/gramm, Test-Diet, Inc.), vagy magas zsírtartalmú étrendet kaptak. (HFD), a kcal 45% -a zsírból (kat. # 58125, 4,7 NE A-vitamin-acetát/gramm, Test-Diet, Inc.). Ezeket a chow és a magas zsírtartalmú étrendeket a csoportunk által korábban közzétett bizonyítékok alapján választottuk [18], jelezve, hogy a vad típusú C57BL/6 egerek magas zsírtartalmú étrendet (HFD) tápláltak 4,7 NE A-vitamin-észter/grammal (# 58125, Test-Diets Co, St. Louis, MO) egyenlő csökkenést mutatott a szöveti A-vitamin szintben, összehasonlítva a kontroll egerekkel, akiket egyedi kontroll étrenddel tápláltak (# 58124, Test-Diets Co, St. Louis, MO), amely 3,8 NE vitamint tartalmaz. A-észter/gramm), vagy a WCMC vivarium rágcsáló-étrend 15 NE A-vitamin-észter/gramm mellett (Pico Rodent Diet, # 5053) [18]. A jelen vizsgálatban a 3 hónapig HFD-vel táplált egereket három csoportra osztottuk, mindegyiket további egy hónapig kezeltük a HFD-vel (a) további gyógyszerekkel (vivőanyag, 0,6% DMSO); (b) a 4 - [(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalinil) -karboxamido] benzoesav (AM80) RARα szintetikus agonista (kat. S4260, n tétel 0,01, Selleck Chem) 0,4 mg/100 ml koncentrációban (

0,6–0,8 mg/ttkg) 0,6% DMSO-ban, vagy (c) RARβ2 szintetikus agonista, 4- (4- (2-butoxietoxi) -5-metil-tiazol-2-il) -2-fluor-benzoesav (AC261066) ( cat # 4046, R&D Systems) [20], 3 mg/100 ml (5,3 mg/kg testtömeg) koncentrációban 0,6% DMSO-ban, mindkét gyógyszert az ivóvízben adagolva (n = 4 egér csoportonként).

Glükóz tolerancia tesztek (GTT)

Négy hónapos kezelés és egy éjszakai éhgyomor után teszteltük az egerek kohorszját, hogy megmérjük a vércukorszint kiürülési sebességét. Röviden: az egereket 20% -os glükózoldat PBS-ben történő injekciójával 2,0 g/testtömeg-kg (n = 4 egér csoportonként) injekcióval hoztuk létre. Az injekció beadását követően 15, 30, 45, 60 és 120 perccel mértük a farokvénák vércukorszintjét Free Style Lite vércukorszint-ellenőrző rendszer (Abbott Diabetes Care, Inc.) segítségével.

Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC)

Szövettan és kóros vizsgálat

A máj- és hasnyálmirigy-mintákat 4% -os formaldehid pufferban rögzítettük és paraffin blokkokba ágyazottuk. Ezután 5 μm-es metszeteket festettünk hematoxilinnal és eozinnal (H&E), és egy májpatológus (JJ) vakon megvizsgálta az egyes mintákat a steatosis, a fibrózis és a steatohepatitis bizonyítékaira, a legjobb klinikai gyakorlat és a Brunt-kritériumok alapján [24]. . Az egyes szakaszoknál figyelembe vett fő hisztopatológiai jellemzők a következők voltak: duktuláris reakció (0–3 pontszám), portális és lobularis gyulladás (0– nincs, 1-enyhe, 2-közepes, 3-súlyos), a duktuláris sejteket tartalmazó atipikus sejtek jelenléte vagy hiánya reakció, steatosis mértéke (0-nincs, 1 30, de 60%), a szteatotikus vakuolák típusa (mikrovezikuláris vagy makro-vezikuláris) és ballonos degeneráció (0-nincs, 1-alkalmi, 2-szer több, mint alkalmi, 3-sok sejt).

Szérum triglicerid mérések

Az éhomi szérum trigliceridek méréséhez CardioChek PA kézi lipid analizátort és PTS triglicerid tesztcsíkokat használtunk (Polymer Technology Systems, Inc., Indianapolis, IN). Ezt a tesztet csoportonként 4 egérben végeztük.

Máj triglicerid extrakció

A trigliceridek májszintjének számszerűsítéséhez Folch-módszert [25] alkalmaztunk, csoportonként 4 egérrel. A máj lipidjeit (50 mg szövet) kloroform és metanol (2: 1 arányú) keverékével extraháltuk. A lipidkivonatok szárításához nitrogéngázt használtunk, majd 200 μl izopropanolban újraszuszpendáltuk, és a máj trigliceridkészletével (ThermoFisher Infinity Kit, kat. Szám: TR22421) kvantifikáltuk SpectraMax M2e mikrolemez-olvasón (Molecular Devices, Inc.) a gyártók szerint. 'protokoll.

Immunfluoreszcens mikroszkópia

A májszöveteket egy éjszakán át 4% formaldehiddel 4 ° C-on rögzítettük, majd 25% -os szacharózzal és optimális vágási hőmérséklet (OCT) beágyazással kezeltük a kriosztát-metszés előtt. Ezután csoportonként 3–4 diát blokkoltunk 2% szarvasmarha szérum albuminnal (BSA) PBS/Triton X 0,1% -ban vagy egér IgG koktéllal (macska # MKB-2213, tétel: ZB0618, 1: 30-ra hígítva, Vector Labs, Inc.) és blokkoló szérumot, ha egér antitesteket használunk, 1 órán át szobahőmérsékleten (szobahőmérsékleten). A festési protokoll optimalizálása után a tárgylemezeket 4 órán át 37 ° C-on inkubáltuk egér anti-RBP1 (CRBP1) (cat # sc-271208, lot # B0912, 1:50) (Santa Cruz, Inc.) vagy egy éjszakán át. 4 ° C-on patkány-anti F4/80-mal (Bio Legends, kat. Nr. 123101, tétel B226028, 1: 100). A nem specifikus festés értékeléséhez primer antitest nélkül inkubált negatív kontrolllemezeket vontunk be. Miután PBS-ben leöblítettük, azután a tárgylemezeket 1: 500 arányban hígított Alexa Fluor 594 konjugált anti-egér vagy Alexa Fluor 488 konjugált patkányellenes (Invitrogen) szekunder antitestekkel inkubáltuk 1 órán át 22 ° C-on. A magokat Hoechst Dye 33258-mal (cat # 382061, Calbiochem) festettük 0,5 μg/ml koncentrációban PBS-ben 1 percig, majd egy mosás PBS-ben és rögzítés a kép megszerzéséhez.

Szöveti szakaszonként minimum 4 véletlenszerű mezőt nyertünk, és a korábban publikált kritériumok szerint számszerűsítettük a fluoreszcencia szintjét Fidzsi-szigeteki (Image J) szoftverrel (v1.48, NIH) [26]. Röviden, kiszámítottuk a fluoreszcencia relatív szintjét integrált sűrűségként - (a kiválasztott sejt területe × a háttérolvasások átlagos fluoreszcenciája). Az adatokat ezután átlag ± szórásként (SD) ábrázoltuk.

RNS izolálás és kvantitatív RT PCR (qRT-PCR)

Az összes RNS-t TRI Reagenssel (Sigma Aldrich) extraháltuk egér májából (kísérleti csoportonként 3-4 egér), és 1 μg RNS-t használtunk a komplementer DNS (cDNS) véletlenszerű primerekkel történő szintetizálására. A génexpresszió szintjének értékeléséhez specifikus primereket használtunk a Retinol Binding Protein 1 (RBP1) számára (Gene ID: 19659) Forward primer (5’– 3 ’): GCTGAGCACTTTTCGGAACT; Fordított alapozó (5’– 3 ’): GGAGTTTGTCACCATCCCAG. Az alkalmazott háztartási gén a riboszomális foszfoprotein P0 (RPLP0) volt, amelyet 36B4-ként jelöltek (Gene ID: 11837) Forward primer (5’– 3 ’): AGAACAACCCAGCTCTGGAGAAA; Fordított alapozó (5’– 3 ’): ACACCCTCCAGAAAGCGAGAGT. A qRT-PCR-t a korábban leírt módon [27] hajtottuk végre, SYBR Green PCR mester keveréket használva egy Bio-Rad MyiQ2 valós idejű PCR iCycler (Bio-Rad) segítségével. A kísérleti csoportokban a különböző génexpresszió kiszámításához a delta Ct módszert alkalmaztuk, és a 36B4 belső kontroll gén expressziójára normalizáltuk [17].

Statisztika

Az adatokat átlag ± szórásként (SD) mutatjuk be. A csoportok közötti statisztikai szignifikanciát egyirányú ANOVA és Bonferroni többszörös összehasonlító post-hoc analízissel (fekete csillagok) határoztuk meg, az 1. ábra P értékei. Az AM80 RARα agonista nem befolyásolja a HFD-vel táplált egerek testsúlyát, de növeli a éhomi glükóz és glükóz intolerancia szintje.

(A) Az önmagában HFD-t, HFD + AM80 vagy HFD + AC261066-ot kapó egerek testtömege (bw) nőtt a chow-val táplált egerekhez képest. (B) Az éhomi glükóz szintje a HFD-, HFD + AM80- és HFD + AC261066-val kezelt állatokban, összehasonlítva a szarvasmarhával táplált egerekkel. (C) Glükóz tolerancia tesztek (GTT), éjszakai éhezés után, 20% glükóz intraperitoneális (ip) injekcióval PBS-ben, 2 g glükóz/kg dózisban. (D) A GTT számszerűsítését a görbe alatti terület (AUC) ábrázolja. Az összes kísérletben használt egerek = 4 csoportonként. A diagramok átlag ± szórás (SD) formájában vannak feltüntetve. A fekete csillagok statisztikai szignifikanciát képviselnek az egyirányú ANOVA teszt alapján, p. 2. ábra: A retinol (ROL) megemelkedik a szérumban, a retinol és a retinil-palmitát pedig csökken HFD-, HFD + AM80- és HFD + AC261066-val kezelteknél. chow-táplált egerek.

A szérum retinol, a máj retinol és a máj retinil palmitát mennyiségének meghatározása HPLC-vel chow-, HFD-, HFD + AM80- és HFD + AC261066-kezelt egerekben. A diagramok átlag ± szórás (SD) formájában vannak feltüntetve. Egér csoportonként = 4; A fekete csillagok statisztikai szignifikanciát képviselnek az egyirányú ANOVA teszt alapján, p 0,05), és 9,3-szoros (± 1,4) (p> 0,05) alacsonyabbak, mint a chow-vel táplált egerekben (3. ábra), míg az RBP1 fehérje szintje a HFD + AC261066 kezelt egerekben> 18-szoros volt (± 1) (p 0,05). Ezzel szemben nem figyeltünk meg változásokat az RBP1 mRNS szintjeiben a HFD + AM80 kezelt egerekben, összehasonlítva a HFD-vel kezelt egerekben (3. ábra).

Reprezentatív képek, amelyek az RBP1-t vörösben és a magokat kékben ábrázolják (Hoechst jelölés), immunfluoreszcenciával fagyasztott májszövetekben, qRT-PCR-rel értékelve chow-, HFD-, HFD + AM80- és HFD + AC261066-kezelt egerekben. A képeken látható sárga nyilak jelzik az RBP1-pozitivitás reprezentatív területeit (betétek). Az immunfluoreszcencia és az mRNS szintjének meghatározása oszlopdiagramként jelenik meg. A diagramok átlag ± szórásként (SD) vannak ábrázolva (egerek csoportonként = 3-4; képmezők egérenként> 4). A statisztikai szignifikanciát egyirányú ANOVA (fekete csillagok) segítségével értékeljük, p. 4. ábra. Az AM80 RARα-szintetikus agonista növeli a steatózist HFD-vel táplált egerekben.

Számszerűsítettük a máj trigliceridtartalmát, a Módszerek szakaszban leírtak szerint [25], és 2,8-szoros (± 0,14) (p 0,05) növekedést találtunk a chow-val táplált egerekhez képest (5. ábra).

Tekintettel a retinoidoknak az elhízással kapcsolatos rendellenességek patofiziológiájában és kezelésében betöltött szerepére, egyre több adat mutat be, hogy a jelen munkában bemutatott AMAR és AC261066 RARα és RARβ2 specifikus agonisták divergens metabolikus hatásai megerősítik a retinoidok terápiás potenciálját, ugyanakkor fontos, továbbá hangsúlyozza a további preklinikai vizsgálatok szükségességét az izotípus-specifikus RAR agonisták terápiás relevanciájának és lehetséges korlátozásainak meghatározására a NAFLD és más, az elhízással kapcsolatos rendellenességek kezelésében.

Segítő információ

S1 ábra. Az AM80 RARα agonista és az AC261066 RARβ2 agonista nem befolyásolja a szérum triglicerideket.

Az éhomi szérum trigliceridek a chow, HFD, HFD + AM80 és HFD + AC261066 kezelt egerekben (csoportonként 4 egér). Az egereket az 1. ábra szerint kezeltük. A szérum triglicerideket a módszerek részben leírtak szerint mértük. n.s. = nem szignifikáns (p> 0,05).

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük a Gudas laboratóriumának a megbeszélést és az adatok kritikai értelmezését.