Egyéni különbségek AMY1 A génmásolat száma, a nyál α-amilázszintje és az orális keményítő észlelése

Tagság Monell Chemical Senses Center, Philadelphia, Pennsylvania, Amerikai Egyesült Államok

Társulások: Monell Chemical Senses Center, Philadelphia, Pennsylvania, Amerikai Egyesült Államok, Táplálkozástudományi Tanszék, Környezet- és Biológiai Tudományok Iskola, Rutgers University, New Brunswick, New Jersey, Amerikai Egyesült Államok

Abigail L. Mandel,
Catherine Peyrot des Gachons,
Kimberly L. Plank,
Suzanne Alarcon,
Paul A. S. Breslin

Ábrák

Absztrakt

Háttér

Az étrendi keményítő emésztését emberben a nyál α-amiláz, egy endoenzim indítja el, amely a keményítőt maltózzá, maltotriózzá és nagyobb oligoszacharidokká hidrolizálja. A nyálamiláz a fehérje 40-50% -át teszi ki az emberi nyálban, és gyorsan megváltoztatja a keményítő fizikai tulajdonságait. Fontos, hogy a nyálamiláz mennyisége és enzimatikus aktivitása jelentős egyéni variációt mutat. Azonban a nyálamiláz-szintek variációinak összekapcsolása a keményítő orális észlelésével nehéznek bizonyult. Továbbá nem vizsgálták az összefüggést az AMY1 gén kópiaszám-variációi (CNV) között, amelyek befolyásolják a nyál amilázszintjét, és a keményítő viszkozitása.

Fő megállapítások

Itt bemutatjuk, hogy a magas szintű amilázt tartalmazó nyál elegendő aktivitással rendelkezik egy viszkózus keményítőoldat in vitro gyors hidrolizálásához. Ezenkívül időintenzitás-besorolásokkal mutatjuk be, amelyek nyomon követik a keményítő emésztését az orális manipuláció során, hogy a magas amilázszinttel rendelkező egyének gyorsabb és szignifikánsabb csökkenésről számolnak be az észlelt keményítőviszkozitásban, mint az alacsony nyálamilázszintű embereknél. Végül bemutatjuk, hogy az AMY1 CNV-k megjósolják az egyén mennyiségét és aktivitását a nyálamilázban, és ezáltal végső soron meghatározzák az orális keményítőviszkozitás elvékonyodásának észlelt arányát.

Következtetések

A genetikai variáció és az ebből következő nyál enzimatikus különbségek összekapcsolásával ezeknek a variációknak az észlelési következményeivel megmutatjuk, hogy az AMY1 kópiaszám a nyál amiláz koncentrációjára és az enzimatikus aktivitás szintjére vonatkozik, amelyek viszont a keményítő viszkozitásának orális észlelésének egyéni változásaival járnak . A nyál amilázszintjének és a nyálaktivitásának mélyreható egyéni különbségei jelentősen hozzájárulhatnak az étrendi keményítőbevitel egyéni következményeihez és következésképpen az általános táplálkozási állapothoz.

Idézet: Mandel AL, Peyrot des Gachons C, Plank KL, Alarcon S, Breslin PAS (2010) Egyéni különbségek az AMY1 génpéldányszámban, a nyál α-amilázszintjeiben és az orális keményítő észlelésében. PLoS ONE 5 (10): e13352. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0013352

Szerkesztő: Manfred Kayser, az Erasmus Egyetem Orvosi Központja, Hollandia

Fogadott: 2010. február 11 .; Elfogadott: 2010. szeptember 15 .; Közzétett: 2010. október 13

Finanszírozás: Ezt a tanulmányt a National Starch Co. (http://www.foodinnovation.com/FoodInnovation/en-US/) és a Nemzeti Egészségügyi Intézet (R01 DC 02995) támogatásával finanszírozta a PASB. A National Starch hozzájárult a mikroviscoamylograph és az észlelési vizsgálatok tervezéséhez. A vállalat a kéziratban szereplő 73 alany közül nyolc esetében végezte el a percepciós tesztet. A Nemzeti Keményítőnek nem volt szerepe a kézirat elemzésében, kiadásának eldöntésében vagy előkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: Ezt a tanulmányt részben a National Starch Co. finanszírozta. A szerzőket nem a National Starch alkalmazotta, és nem is konzultáltak velük. Nincsenek olyan termékek, kereskedelmi cikkek vagy szabadalmak, amelyek a National Starch-ot érintenék. Ez a finanszírozás nem változtatja meg a szerzők betartását az adatok és anyagok megosztására vonatkozó PLoS ONE összes politikájához.

Bevezetés

Az étkezési keményítő kezdeti emésztését emberben nyál α-amiláz, egy endoenzim végzi, amely katalizálja az α-1,4-glikozidos kötések hidrolízisét maltóz, maltotrióz és nagyobb oligoszacharidok előállítására. Ez az amilolitikus emésztés a szájüregben történő rágás során kezdődik, és a gyomorban folytatódik. Ezután a keverék átjut a vékonybélbe, ahol a hasnyálmirigy-amiláz befejezi a keményítő hidrolízisét.

A nyálamiláz a leggyakoribb fehérje az emberi nyálban [1], amely a nyálfehérje 40-50% -át teszi ki [2], és képes gyorsan megváltoztatni a keményítő fizikai tulajdonságait a szájüregben [3]. A nyálamiláz mennyisége és enzimatikus aktivitása azonban jelentős eltéréseket mutat az egyének között. Ennek oka számos környezeti tényező, többek között a stresszszint [4], [5] és a cirkadián ritmus [6]. Ezenkívül bizonyítékok vannak arra, hogy a nyál amiláz expresszióját magas keményítőtartalmú étrend szabályozza [7]. Genetikailag a nyál amiláz szintjét befolyásolja az 1p21 kromoszómán található AMY1 gén egyedi kópiaszám-variációja (CNV), amely a nyál amilázt kódolja [8]. Az AMY1 gén az egyik legváltozóbb CNV lókusz az emberi genomban, a jelentett tartomány 2-15 diploid kópia között van. Fontos, hogy az orális nyál amiláz koncentrációja pozitívan korrelál az AMY1 gén kópiaszámával [9].

Ezen megfontolások alapján azt választottuk, hogy megvizsgáljuk, hogyan változik az észlelt viszkozitás a szájüregben az időintenzitás-besorolások alkalmazásával. Ez a módszer jobban közelíti az élelmiszer-változások valós idejű észlelését az idők során. A jelenlegi vizsgálat céljai a következők voltak: 1) annak meghatározása, hogy a nyál amilázszintjének egyéni különbségei hogyan befolyásolják a keményítő viszkozitásának lebontását in vitro reológiai mérések segítségével, és 2) annak tisztázása, hogy az enzim nyálkoncentrációjának változása hogyan befolyásolja a keményítő viszkozitásának érzékelését az idő múlásával. Végül a nyálamiláz számos környezeti variációs forrása ellenére arra törekedtünk, hogy 3) meghatározzuk, hogyan viszonyulnak az AMY1 CNV-k polimorfizmusai a nyálamiláz koncentrációjához és az enzimatikus aktivitás szintjéhez, valamint a keményítő viszkozitásának érzékeléséhez.

Eredmények

Reológiai intézkedések

A mikroviszkoamilográfban a nyál keményítő-viszkozitásra gyakorolt hatása az egyének között szinte semmilyen hatástól a keményítő viszkozitásának másodperceken belüli gyors csökkenéséig változott. Az 1. ábra négy olyan alany adatait ábrázolja, amelyeknél a viszkozitás a legmagasabb, 120-ról 425 másodpercre csökken, és négy olyan alany adatait, amelyeknél a legkisebb a változás. Valamennyi alany esetében 100 ul friss nyálat adtunk 100 g gélesített 6% keményítőhöz a „0” időpontban. A viszkozitás-bomlási görbék kb. 10 másodpercig átfedésben vannak minden egyén számára, ami azt jelzi, hogy az amiláz aktív működéséhez aktív keverés szükséges. Keverés után azonban a nyál amilolitikus aktivitása nagymértékben egyedivé vált az alanyok között (lásd az S1 fájl S1 táblázatát). Az 1. ábra beillesztése az összes alany görbéjét ábrázolja, hogy szemléltesse a nyálaktivitás teljes skáláját.

Ez a grafikon azt a négy alanyot mutatja, amelynél a viszkozitás a legkevesebb (a felső görbék) és a legnagyobb a legnagyobb a változás (az alsó görbék). A beillesztett grafikon az MVAG-ban elemzett összes nyálminta adatait mutatja (n = 42). Mindkét grafikonon az egyes alanyok adatait különböző színű vonallal ábrázolják. Minden alany nyálából 100 ul hozzáadunk 100 g keményítőt 37,5 ° C-on. A „0” időpontban nyálat adtak a keményítőhöz, és a keményítőoldat ~ 0,1% -át tette ki.

Nyálamiláz mérések

Immunblot és enzimatikus vizsgálatot alkalmaztunk az amiláz mennyiségének/ml és aktivitásának/ml független kvantifikálására az egyes nyálmintákban. Jelentős eltéréseket figyeltünk meg az egyének között a nyálegységenként termelt amiláz mennyisége és aktivitása tekintetében (S2. Táblázat az S1 fájlban). Az amiláz átlagos mennyisége (± SD) 2,64 mg/ml (± 1,8) volt, 0 és 7,5 mg/ml tartományban, míg az átlagos percenkénti koncentráció 5,7 mg/perc (± 7,1) (0–42,8 tartomány) mg/perc). A nyál egységenkénti átlagos aktivitása 93 U/ml (± 62) volt, 1 és 371 U/ml között. Az átlagos percenkénti aktivitás 177 U/perc (± 166) volt, 2 és 900 U/perc közötti tartományban. A hímek és a nők nem különböztek szignifikánsan sem amilázmennyiségükben, sem aktivitásukban.

Mindhárom nyálmérés (1. amiláz mennyiség/nyál ml, 2. enzimatikus aktivitás/nyál ml, 3. A keményítő viszkozitásának csökkentése 100 ul nyál injekcióval az MVAG-ban) szignifikánsan korrelált egymással. Az amilázmennyiség (mg/ml) és az MVAG általános viszkozitásváltozása közötti összefüggés (2A. Ábra) r értéke 0,58 (P 2. ábra. A nyálamiláz mértékeinek összefüggései).

Mind a nyálamiláz mennyisége/ml (A), mind a nyálaktivitás/ml (B) szignifikánsan összefüggött az MVAG által mért teljes viszkozitás változással. A nyál amiláz mennyisége/ml és a nyál aktivitása/ml szintén szignifikánsan korrelált egymással (C). Megjegyezzük, hogy az MVAG-ban elemzett nyálminták (n = 41) a Western blot és enzimatikus vizsgálattal elemzett minták részhalmaza (n = 73).

AMY1 génszám és nyálamiláz

DNS-mintákat gyűjtöttünk 62 alanyból, és qPCR segítségével elemeztük a gén kópiaszám meghatározásához. Az értékeket egy humán DNS-mintára standardizáltuk, ismert AMY1 gén kópiaszámmal, amelyet a Fiber FISH igazolt. Az AMY1 génmásolatok medián száma négy volt (átlag = 4,4 ± 2), 1 és 11 közötti tartományban (S2 táblázat az S1 fájlban). A nyál amiláz mennyisége/ml és a gén kópia száma szignifikánsan korrelált (r = 0,50; P 3. ábra. Az AMY1 kópia számának változása és a nyál amiláz fehérje expressziója.

Jelentős pozitív kapcsolat volt az AMY1 diploid kópiaszám és az amiláz mennyiség/ml között (n = 62).

A viszkozitás szóbeli észlelése

A három inger (keményítő, gumi és víz) átlagos észlelt időintenzitású viszkozitási függvényeit a 4A. Ábra mutatja (az adatokat lásd az S1 fájl S3 táblázatában). A várakozásoknak megfelelően az alanyok úgy ítélték meg, hogy a víz viszkozitása nagyon közel nulla, amely nem ingadozott a 60 másodperces mérés során. A csúcs elérése után a xantángumi inger besorolása kissé csökkent a próbaidőszakban, valószínűleg a nyálkeverésből származó volumetrikus elvékonyodás miatt, de egyébként stabil maradt az idő múlásával. A keményítőviszkozitás-görbe alakja kétlépcsős folyamatot javasolt: egy kezdeti „keverési” fázist, amelyben az alany manipulálta a szájban lévő bolust és összekeverte a nyállal (a 4A. Ábrán kb. 0–10 másodperc) és egy második „amilolitikus aktivitás” szakasz, amelyet a keményítő viszkozitásának negatívan gyorsuló csökkenése jellemez a fennmaradó 50 másodperc alatt.

Átlagos időintenzitás besorolás a három ingerre (A). Amint azt hat személy LMS-besorolása bizonyítja (mindegyiket különböző színű vonallal/alakkal ábrázolják), az alanyok nagyon eltérőek voltak az LMS-skála használatában, amikor a keményítő viszkozitását értékelték a vizsgálat során (B). Az LMS-besorolásokat 100 másodpercre normalizáltuk 5 másodperc alatt annak érdekében, hogy eltávolítsuk a szubjektív zajokat és lehetővé tegyük az amiláz viszkozitási osztályokra (C) gyakorolt hatásainak megfigyelését. Vegye figyelembe, hogy a B és C panel ugyanazon hat alany LMS minősítési adatait tartalmazza; minden egyént ugyanaz a színvonal képvisel minden panelen.

A keményítő viszkozitási osztályaiban nagy egyéni különbségek voltak (4B. Ábra). A szubjektív minősítések hatásának csökkentése érdekében az LMS besorolásokat 100-ra normalizálták, 5 másodperc múlva kezdve a függvénybe (4C. Ábra). Az adatokat a fennmaradó 55 másodperc alatt elemeztük, kiszámítva 1) a teljes csúcsról a mélypontra változó teljes változást és 2) azt az időpontot, amikor a görbe elérte az ½ viszkozitás besorolást az egyes görbék csúcsát követően.

Annak érdekében, hogy értékeljük a nyálamiláz mennyisége/aktivitása közötti kapcsolatot a 60 másodperces teszt során és a viszkozitás besorolását, az enzimkoncentrációt/a nyálfolyás percében és az aktivitást/áramlási percben kvartilokra osztottuk. Magasabb nyálamiláz-koncentrációval rendelkező alanyok (5A. Ábra) (F (3,69) = 2,28, P 5. ábra. A nyálamilázszintek szignifikánsan összefüggenek a keményítő észlelt viszkozitásával.

Azoknál az alanyoknál, akiknél magasabb a nyálamiláz-koncentráció/ml (A) és a nyálaktivitás/ml (B), nagyobb volt az észlelt viszkozitás általános változása. Ezek az alanyok ½ észlelt viszkozitási szintet is lényegesen gyorsabban érték el (C és D). Az egyes dobozok szaggatott vonala az átlagértéket, míg a mező felső és alsó határa a 75., illetve a 25. százalékot jelöli. A mező fölötti és alatti hibasávok a 90. és a 10. százalékot jelzik. A különböző betűkkel rendelkező pontok jelentősen különböznek egymástól. Mg/perc kvartilisek: 1 = 0–1,5; 2 = 1,51–2,99; 3 = 3–10; és 4 => 10 mg/perc. U/perc kvartilisek: 1 = 0–60; 2 = 61–120; 3 = 121–220; és 4 => 220 U/perc.

Érdemes megjegyezni azt is, hogy a keményítő viszkozitásának 60 másodpercen belüli in vivo LMS-besorolása szignifikánsan összefüggött az MVAG 7 percnél mért in vitro viszkozitásának mérésével (r = 0,27; P 2 = 0,25, illetve 0,27) ebben a vizsgálatban. Megállapításunk összhangban áll a korábbi kutatásokkal [8], [9], amelyek arra utalnak, hogy az amiláz expresszió további genetikai hatásokat tükrözhet, például az AMY1 génben előforduló nem szinonimák egyetlen nukleotid polimorfizmusát (SNP) vagy a transzkripció különbségeit vagy transzlációs hatékonyság az AMY1 gének között különböző haplotípusokban [9]. Ezenkívül a nongenetikus hatások, beleértve a stresszt és az étrendi keményítőbevitelt, szintén befolyásolhatják a fehérje szintjét. A variabilitás forrásától függetlenül a gén kópiaszámának nagyobb variációjú alanyok toborzására lesz szükség ennek a kapcsolatnak a további teszteléséhez, mivel alanyaink többségének (87%) az AMY1 gén két-hat kópiája volt.