Az egyhólyagos képalkotás lipidszelektív és lépésenkénti membránmegszakadást tár fel a monomer α-szinuklein hatására

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
ORCID rekord Fredrik Höök számára
Levelezés céljából: pernilla.wittung @ chalmers.sefredrik.hook @ chalmers.se

Szerkesztette William F. DeGrado, Kaliforniai Egyetem, San Francisco, Kalifornia, és jóváhagyta 2020. május 7-én (2019. augusztus 22-én kapott felülvizsgálatra)

Jelentőség

A neurodegeneratív betegségek egyre növekszenek a világ lakossága körében, de nincsenek gyógymódok. Ezek a rendellenességek mind amiloid rostokká formálódó fehérjékkel járnak, ami agysejt pusztulást eredményez. A bizonyítékok arra utalnak, hogy ezeknek a fehérjéknek a lipidmembránokkal való összekapcsolása döntő fontosságú mind a funkcionális, mind a kóros szerep szempontjából. A Parkinson-kórban az érintett fehérje, az α-szinuklein, úgy gondolják, hogy az agyi lipid vezikulák kereskedelmében működik. A mechanisztikus eredet keresése során egyre nagyobb hangsúlyt fektetnek a membrán interakciók által kiváltott neurotoxikus reakciók azonosítására. Ahhoz, hogy új nyomokat adjunk ehhez a kérdéshez, itt egy új felületérzékeny szórási mikroszkópos technikát alkalmaztunk. Ezzel a megközelítéssel azt tapasztaltuk, hogy az α-synuclein fokozatosan és lipidfüggő módon zavarja a vezikulákat már nagyon alacsony fehérje-lefedettség mellett.

Absztrakt

A neuronális fehérje α-szinuklein és a lipidmembránok közötti kölcsönhatás döntő fontosságúnak tűnik a Parkinson-kór összefüggésében, de a mögöttes mechanisztikus részletek, beleértve a különböző lipidek szerepét a patogén fehérje-aggregációban és a membránmegszakításban, továbbra is megfoghatatlanok. Itt egyhólyag-felbontású fluoreszcenciát és címke nélküli szórásmikroszkóppal vizsgáltuk a monomer α-szinuklein interakciós kinetikáját a különféle negatív töltésű lipidekből álló, felülettel összekapcsolt vezikulákkal. Az elméleti modell alátámasztva, hogy a felülettel kötött lipid vezikulák szétszóródási tulajdonságaiban bekövetkező szerkezeti változásokat figyelembe vegyék, az adatok fokozatosan mutatják be a vezikulák megszakadását és az aszimmetrikus membrán deformációt, amikor a foszfatidil-glicerin vezikulákhoz kötődő α-szinuklein kötődik 10 nM fehérjekoncentrációig (~ 100 fehérje per vezikulum). Ezzel szemben a foszfatidil-szerin vezikulák csak kis mértékben érintettek. Ezek a betekintések az α-szinukleinnek a lipid vezikulákkal való kölcsönhatásának strukturális következményeibe kiemelik a különböző anionos lipidek kontrasztos szerepét, amelyek mechanisztikusan relevánsak lehetnek mind a normális fehérje működés (pl. Szinaptikus hólyag kötődés), mind a diszfunkció (pl. Mitokondriális membrán interakció) szempontjából.

Eredmények

Az α-Synuclein megváltoztatja a felülethez kötött negatív töltésű lipid vezikulák viszkoelasztikus tulajdonságait.

Mielőtt rátérnénk az egyhólyagos mérésekre, MP-SPR és QCM-D alkalmazásával megvizsgáltuk az időben megoldott tömeg- és szerkezeti tulajdonságok változását, amelyet az α-szinuklein kötődése indukált a felülettel kötött DOPG és DOPS vezikulákhoz. A vezikulákat kis mennyiségű (0,25 mol%) biotin-lipiddel módosítottuk, hogy a NeutrAvidin-t összekötő linkerként használjuk egy poli (l-lizin) -graft-poli (etilén-glikol) (PLL-g-PEG) módosított érzékelőfelülettel, amely tartalmaz 0,25% PLL-g-PEG-biotin. 200 nM α-szinuklein hozzáadása a DOPG vagy a DOPS vezikulákhoz a QCM-D által mért rezonancia frekvenciaeltolódás (Δf) szignifikáns csökkenését mutatta, ami az energia disszipációjának növekedésével járt (ΔD) (1A. Ábra) ). Vagy 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-foszfokolin vezikulákat vagy csupasz PLL-g-PEG-biotint használó kontrollok: A PLL-g-PEG felület nem mutatott α-szinuklein kölcsönhatás jeleit (SI függelék, S1 ábra), annak ellenőrzése, hogy az 1A. ábrán bemutatott válaszok specifikusak-e.

A felülethez kötött lipid vezikulákhoz kötött α-szinuklein QCM-D és SPR mérése. (A) Δf és ΔD időbeli alakulása lipid vezikulák és α-szinuklein későbbi hozzáadása után egy PLL-g-PEG-biotinhoz: PLL-g-PEG és NeutrAvidin-módosított szenzorfelületek egy PLL-g-PEG-biotinnél: A PLL-g-PEG arány 0,25%. Az α-szinuklein hozzáadása a DOPG vagy DOPS vezikulák telített megkötése és tiszta pufferrel történő öblítés után kezdődött. (B) Kettős hullámhosszú SPR szenzorgrammok a rezonancia szögeltolódás változásainak változásához, R, az idő függvényében λ = 670 nm-nél, ugyanazon folyamatnál, mint az A-ban, DOPG (kék) és DOPS (vörös) vezikulák esetében. (C) Az SPR válasz R670/R785 arányának változásának időbeli alakulása DOPG (kék) és DOPS (piros) esetén. B-ben és C-ben a nyilak az a-szinuklein hozzáadását jelzik.

Első látásra csábító az αf csökkenésének az α-szinuklein injekcióval (t ≈ 20 perc) tulajdonítható a csatolt tömeg növekedése, amelyet a vezikulákhoz való protein kötődés okoz, míg a kísérő ΔD növekedés változásokkal társulhat a vezikulák szerkezetében és viszkoelasztikus tulajdonságaiban. Ezt az érvelési irányt követve a későbbi Δf növekedés (t ≈ 27 perc DOPG és t ≈ 32 perc DOPS esetében) értelmezhető a lipid és/vagy α-szinuklein deszorpciójaként az érzékelő felületéről. Korábbi vizsgálatokból azonban ismert, hogy az Δf-t az adszorbeált vezikulák szerkezeti változásai is befolyásolhatják, amelyekben azokban a helyzetekben, amikor a molekulatömeg lényegében állandó marad, a kapcsolt oldószer mennyiségének változása dominál (40).

A kapcsolt oldószer kapcsolt molekulatömegében bekövetkező változások dekonvolúciójára két hullámhosszon működtetett MP-SPR-t használtunk. Ezzel a technikával az interfész régióját két különböző bomlási hosszúságú elúszó mezővel vizsgáljuk meg, lehetővé téve a film vastagságának (vagy az adszorbeált részecskék méretének) közvetlen meghatározását a megfelelő válaszok, R1/R2 közötti arány alapján. Ez pedig lehetővé teszi mind az adszorbeált vezikulák szerkezeti változásainak azonosítását, mind pedig a tömegkvantifikáció pontosságának javítását (42), amelyeket itt végeztünk (a részletekért lásd az SI függelék 3. szakaszát) a film vastagságának figyelembevételével ( SI függelék, egyenletek. S1 és S4 és S2. ábra), az α-szinuklein (∼14 kDa) és a lipidek (∼0,8 kDa) közötti molekulatömegbeli különbség, valamint az a tény, hogy a fehérjék törésmutatója valamivel magasabb, mint a lipideké (34, 46).

Az α-Synuclein a felülethez kötött DOPG vezikulák strukturális átalakítását indukálja.

Az egyes DOPG vezikulák szóródási emissziója. Az egyes DOPG vezikulák hat reprezentatív szórási intenzitási profilja (a háttér kivonása után) 10 nM α-szinukleinnel való érintkezéskor t = 0-nál. Különbség az abszolút szórási intenzitások között ezen adatok és a 2B. Ábra és az SI függelék között. Az S4 – S8 a fényintenzitás, a chip variációi és a képfelvételi idő különbségei miatt következik be. Az intenzitási profilokat jelöletlen vezikulák alkalmazásával kaptuk.

A fluoreszcens képalkotás jelzi a lipidek felszíni bezáródását az α-Synuclein-indukált vezikulák átalakítása után.

Az egyhólyag-fluoreszcencia intenzitásának változásai a-szinuklein hozzáadásával. (A) Fluoreszcens mikrográf, amely ugyanazokat a DOPG vezikulákat mutatja, amelyek 1% rodamint tartalmaznak az a-szinuklein hozzáadása előtt (t1 ≈ 0 s) és után (t2 ≈ 20 s). A vörös nyilak a vezikulák azonosságát jelzik t1 és t2 időpontban. (Méretarány: 2 µm.) (B) Az egyes DOPG (kék) és DOPS (vörös) vezikulák fluoreszcencia intenzitása az α-szinuklein addíció (t1) előtt és legfeljebb 40 s (t2) az adagolás után. A vonalak lineárisan illeszkednek az ábrázolt adatpontokhoz, és az árnyékolt terület megfelel az illesztés átlagos négyzethibájának. (C) A fluoreszcencia intenzitás t1 és t2 idõ közötti relatív változásának hisztogramja az egyes DOPG és DOPS vezikulák esetében. (D) Fluoreszcencia intenzitásprofil az egyes DOPG vezikulák keresztmetszetéhez, t1 és t2 időpontokban rögzítve. A DOPS megfelelő grafikonja nem mutat különbséget t1 és t2 között. (E) Az FWHM keresztmetszetének változása> 100 DOPG és DOPS vezikulák esetében.

A kalcein szivárgását az α-Synuclein és a lekötött DOPG vezikulák kölcsönhatása okozza.

Egyhólyagú kalcein szivárgási vizsgálat. (A) A vizsgálat sematikus ábrázolása. A vezikulákat a kapszulázott kalcein fluoreszcensen jelöli (olyan koncentrációban, amelynél az önkioltó hatás nem súlyos). A membrán permeabilizációja kalcein felszabadulást és így vezikulum fluoreszcencia csökkenést eredményez. (B) Fluoreszcens mikrográfiák, amelyek a calceint tartalmazó vezikulákat mutatják be az α-szinuklein hozzáadása után különböző időpontokban. (Méretarány: 2 µm.) (C) Normalizált fluoreszcencia (szaggatott vonalak) és szórás (folytonos vonalak) intenzitási nyomok a DOPG (kék) és a DOPS (piros) számára az α-szinuklein hozzáadása után t = 0-nál.

Vita

A lipid fejcsoportban mutatkozó különbségek azonban önmagukban nem elegendők annak a messzemenő különbségnek a magyarázatához, amelyet az α-szinuklein a DOPG membránokra gyakorol a DOPS-hoz képest. Figyelembe véve a kétrétegű lipid tulajdonságokat, megjegyezzük, hogy a röntgendiffrakciós és az NMR vizsgálatok magasabb molekuláris sorrendet mutattak a DOPS poláros fejcsoportjának régiójában a DOPG-hez viszonyítva, lamelláris folyadékkristályos fázisban (54). Ez a tény azon megfigyelésekkel együtt, hogy az α-szinuklein nagyobb affinitással kötődik az alacsony lipid sűrűségű, nagy görbületű és/vagy inhomogenitást tartalmazó modell membránokhoz (17, 26, 55, 56), összhangban áll a DOPG membránokkal való kedvező kölcsönhatással DOPS, beleértve a mélyebb behelyezést a DOPG kétrétegekbe. Ezenkívül korábbi kutatások arról számoltak be, hogy az α-szinuklein a membrán merevségének és diffúziójának csökkentésével indukálja a tökéletlenségeket (57, 58), ami arra utal, hogy az α-szinuklein kötés valószínűleg fokozni fogja a lipid kettős réteg szerkezetének dinamikus inhomogenitásait, ami membránváltozásokat eredményez. ami elősegítheti a további fehérjekötést. Az itt használt DOPG membránokban az a-szinuklein által kiváltott hatások észlelték az események láncolatát, amelyek végül elősegítették az aszimmetrikus vezikulum összeomlását a támasztó felület közvetlen közelében és a vezikulum tartalom felszabadulásában.

Anyagok és metódusok

Anyagok.

A DOPG és DOPS kloroform-oldatok, valamint a DSPE-PEG (2000) biotin (1,2-disztearoil-sn-glicero-3-foszfoetanol-amin-N- [biotinil (polietilén-glikol) -2000], ammóniumsó) az Avanti Polar Lipids-től származnak. . A rodamin-DHPE az Invitrogen cégtől származik. A nátrium-foszfát-nátrium-foszfátot (NaH2PO4; ≥99%), a bázisos nátrium-foszfátot (Na2HPO4; ≥99.0%), az etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA; ≥99%), a NeutrAvidint és a kalceint a Sigma-Aldrich cégtől vásároltuk.

Fehérje expresszió és tisztítás.

Lipid vezikulum készítmény.

A vezikulákat lipidfilm hidratálással és extrudálással állítottuk elő. Megfelelő mennyiségű DOPG vagy DOPS kloroform-oldatot vittünk egy gömblombikba. A biotinilezett vezikulákat úgy állítottuk elő, hogy a DSPE-PEG (2000) biotin (metanolban oldva) teljes lipid tömegének 1% -át összekevertük a szerves oldat DOPG-jével vagy DOPS-jával. Fluoreszcensen jelölt vezikulák esetén rodamine DHPE-t (1 tömeg%) is adtak a vezikulákhoz. A szerves oldószereket rotációs bepárlóval eltávolítottuk, és a kapott filmet vákuumban legalább 3 órán át szárítottuk, 20 mM foszfátpufferrel, 1 mM EDTA-val (pH 6,5) hidratáltuk és 10 percig vortexeltük. A vezikulák méretét extrudálással csökkentették Avestin LiposoFast-Basic extruder és 100 nm pórusméretű polikarbonát membránok alkalmazásával.

Az összes mérést Q-Sense E4 (Biolin Scientific) és SiO2-val bevont kristályok (Q-Sense, Biolin Scientific) felhasználásával végeztük, ultrahanggal tisztítva (Elmasonic, Elma Schmidbauer GmbH) nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS, Sigma-Aldrich) és ultratiszta H2O (Synergy systems, Merck Millipore Corporation), majd szárítás előtt N2 áramlással és UV/Ozone kezeléssel (UV/Ozone Procleaner Plus, BioForce Nanosciences) 30 percig. Az alapvonalat minden kísérlet előtt a fent leírt foszfátpufferral normalizáltuk. A kísérlet kezdetén az érzékelő felületét 10 µg/ml PLL-g-PEG-vel (PLL (20) -g [3,5] -PEG (2) a SuSOS AG-tól) bevontuk, az oldat 0,25% -ával vagy 1% -ával. Biotinnal funkcionalizált PLL-g-PEG (PLL (20) -g [3,5] -PEG (2)/PEGbiotin (3,4) SuSOS AG 50% -a). A telítettség elérésekor NeutrAvidint adunk 10 µg/ml koncentrációban, amíg további kötődést nem észlelünk. Ehhez 1% biotinilezett lipidet tartalmazó vezikulákat (100 ug/ml lipidkoncentráció) adtunk a telítettség eléréséig, majd az a-szinukleint. A mintasejteket pufferrel öblítettük minden adagolás között.

MP-SPR.

A kettős hullámhosszú felületi plazmon rezonancia (SPR) méréseket egy SPR Navi 220A (BioNavis) segítségével SiO2-val bevont forgácson (SPR102-SIO2, BioNavis) végeztük, amelyet először 10 mM SDS-ben végzett öblítéssel, majd ultratiszta vízben történő öblítéssel tisztítottunk meg. Öblítés után a zsetonokat nitrogénáramban szárítottuk, majd 30 percig UV/ózonnal (UV/Ozone Procleaner Plus, BioForce Nanosciences, Inc.) kezeltük. A mosási eljárás után a forgácsot az SPR készülékbe dokkolták, és keringő pufferrel alapozták meg 20 μL/perc sebességgel. A chipet PLL-g-PEG-biotinnal vontuk be: PLL-g-PEG-vel és a NeutrAvidin-en keresztül megkötött vezikulákkal a QCM-D kísérleteknél leírtak szerint, és az SPR-t 670 és 785 nm hullámhosszon követtük nyomon, ~ 65 ° és 78 °. A méréseket 21 ° C-on végeztük.

Hullámvezető forgács gyártása és felületének módosítása.

Mikroszkópia beállítása.

Az összes hullámvezető mérést egy Olympus BX61 függőleges mikroszkóppal végeztük, amely 100 ×, NA 1,0 Leica vízmerítő objektívvel és egy Hamamatsu ORCA Flash 4.0 V2 tudományos kiegészítő fémoxid félvezető (CMOS) kamerával volt felszerelve, amely egy Hamamatsu W-VIEW GEMINI képhez volt csatlakoztatva. elosztó, amely specifikus szűrőkockákat tartalmaz (dikro tükör: 562 nm; fluoreszcencia sáv áteresztés: 590/50; és szórási sáv áteresztés: 535/50), lehetővé téve a fluoreszcencia és a szórt jelek egyidejű megszerzését. Funkcionális hullámvezető chipet helyeztek az objektív alá, és egymódusú, 532 nm-es TE polarizált fényt (szálcsatolt NANO 250 [Qioptiq, Inc.] lézerből) egymódusú szálon keresztül csikkcsatlakoztattak a chipbe amelyet egy manuális háromtengelyes transzlációs szakasz segítségével gondosan illesztettek a hullámvezető arcához. Miután összehangoltuk, a vezikulákat tartalmazó oldatot kitettük a chipre, és a vezikulák felületi kötődését valós időben követtük nyomon. Amikor elérte a megfelelő felületi lefedettséget, a chipet pufferrel öblítették, majd a-szinukleinnek tették ki. A hullámvezető chipről és a kísérleti beállításról további részletekért lásd a ref. 67.

Egyhólyag-szórás és fluoreszcencia mérések.

Felülethez kötött lipid vezikulum mintákat készítettünk a fent leírtak szerint. A mintát a fentiekben leírt mikroszkóp-beállítással készítettük, 100 ms-os integrációs idővel 0,1 kép/s sebességgel. A szórási és a fluoreszcencia jeleket egyszerre rögzítettük egy képfelosztó eszközzel. A felvett képeket ImageJ-ben elemeztük. Először a megfelelő fluoreszcencia és szóró képeket igazítottuk az ImageJ beépített igazító moduljával. Ezután az egyhólyag-intenzitást úgy kaptuk meg, hogy az intenzitást integráltuk a vezikuláris szignált körülhatároló területre. Ezt a területet határoztuk meg a felvétel végén, a fluoreszcencia adatokra (a jel lábnyoma növekszik az idővel), és a felvétel elején a szórási adatokra (a jel lábnyoma lényegében állandó marad az idővel). A pixelenkénti átlagos háttérintenzitást lokálisan értékeltük az egyes vezikulák számára, és levontuk azok integrált szóródási és fluoreszcencia-intenzitásáról.

Szivárgási vizsgálat.

Biotinilezett vezikulákat kapszulázott kalceinnel 30 mM koncentrációban, amelynél az önkioltó hatás elég gyenge ahhoz, hogy az egyes vezikulák kimutathatók legyenek, úgy készítettük el, hogy a lipidfilmet a festéket tartalmazó foszfátpufferrel hidratáltuk. A kalceint lúgos környezetben (1 M NaOH) oldjuk, majd foszfátpufferrel (20 mM foszfátpuffer, 1 mM EDTA, pH 6,5) hígítjuk. A vezikulákat vortexeltük, extrudáltuk és immobilizáltuk a forgács felületén, az előzőekben leírtak szerint. A szabad kalceint úgy távolítottuk el, hogy az immobilizált vezikulákat foszfátpufferrel mostuk, mielőtt hozzáadtuk az a-szinukleint. A fluoreszcencia emissziót 100 ms-os integrációs idő alkalmazásával detektáltuk. Két másodpercenként képet rögzítettünk annak érdekében, hogy hosszabb felvételi idő legyen elérhető anélkül, hogy a mintában lévő színezékek jelentősen kifehérednének. Meg kell jegyezni, hogy a kalcein jelenléte a vezikulákban nyilvánvalóan negatív hatást gyakorol az α-szinukleinnak arra a képességére, hogy kölcsönhatásba lépjen a jelen tanulmányban használt lipidmembránokkal. A QCM-D által mért hasonló interakció eléréséhez (amelyet az SI függelék mutat be) 10-szer nagyobb α-szinuklein koncentrációra volt szükség. Ez azt jelenti, hogy a különböző módszerekkel kapott kvantitatív eredmények nem közvetlenül összehasonlíthatók.

Az adatok elérhetősége.

Az összes adatot és eljárást a kézirat és az SI függelék tartalmazza.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát a Knut és Alice Wallenberg Alapítvány, a Svéd Kutatási Tanács és a Chalmers Egyetem előzetes vetőmag-támogatási területe támogatta. Köszönetet mondunk Ranjeet Kumar-nak (Chalmers Műszaki Egyetem, Biológia és Biotechnikai Tanszék) az α-szinuklein kifejeződéséért és tisztításáért. Ezt a munkát részben a Chalmers Anyagelemző Laboratóriumban (CMAL) végezték.