Az élelmiszer-korlátozás és a leptin-kiegészítés hatása az egerek magzati programozására

Társított adatok

Absztrakt

Az elhízás és az azzal összefüggő betegségek világszerte jelentős problémát jelentenek, jelentős hatással vannak a morbiditásra és a mortalitásra (1). Az Egészségügyi Világszervezet 2005-ben azt jósolta, hogy 2010-re az Egyesült Államokban a felnőtt férfiak 44,2% -a és a felnőtt nők 48,3% -a elhízott [testtömeg-index (BMI) ≥ 30 kg/m 2] (1). Egy 2010-es tanulmány becslése szerint az összes felnőtt 34,3–38,5% -a szenved metabolikus szindrómában, olyan állapotban, amelyet központi elhízás, cukorbetegség, magas vérnyomás és nem alkoholos zsírmájbetegség (NAFLD) jellemez, amely az összes halálozás 6–7% -át teszi ki (2, 3). Az egészség és a betegség, vagy a magzati programozás fejlődési eredete azt a hipotézist állítja, hogy az anyai környezet tartós hatással van a magzatra felnőttkorban, amely magában foglalhatja a metabolikus szindróma fokozott kockázatát (2, 4). Ezt a hipotézist Barker és Osmond (5) epidemiológusok tették fel, akik összefüggéseket fedeztek fel a felnőttek kardiovaszkuláris betegségei és az alacsony születési súly, a csecsemőhalandóság, valamint az anyák rossz egészségi állapota és a táplálkozás között.

Anyagok és metódusok

Állatok és szövetgyűjtés

Minden állatkísérletet a Missouri Egyetem Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyott jóvá, és a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó Országos Egészségügyi Intézet útmutatójának megfelelően hajtották végre.

Az állatok leölésekor az összes utódból vérmintákat vettünk, és a szérumot -20 ° C-on tároltuk. A májmintákat összegyűjtöttük és trireagensbe (Sigma, St. Louis, MO) helyeztük, vagy 4% paraformaldehidben (PFA) rögzítettük. egy éjszakán át, majd az optimális vágási hőmérsékletű vegyületbe (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) ágyazva, és -80 ° C-on tároltuk. A szubkután zsír-, zsigeri zsír- és hipotalamusz-mintákat folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. Az összes mintát -80 ° C-on tároltuk. A bal vesét összegyűjtöttük, 4% -os PFA-ban rögzítettük, középső részen kettévágtuk, paraffinba ágyazottuk és szobahőmérsékleten tároltuk. A hasnyálmirigy mintáját is összegyűjtöttük, 4% PFA-ban rögzítettük, paraffinba ágyazottuk és szobahőmérsékleten tároltuk. A combcsontokat összegyűjtöttük, megtisztítottuk, gézbe csomagoltuk és -20 C-on PBS-ben tároltuk.

Kisállat-mágneses rezonancia képalkotás (MRI)

A testösszetételt 54 hím utódban határozták meg 21 hetes korban, valamint 54 férfi és 44 nőstény utódban 27 hetes korban, 5 hét után magas zsírtartalmú étrendnek (HFD) való kitettség után. A testzsírszázalékot Micro-MRI nagyteljesítményű 7T MR képalkotó és spektroszkópiai rendszerrel (Varian Inc., Santa Clara, Kalifornia) mértük a veteránügyi biomolekuláris képalkotó központban a Harry S. Truman Veteránügyi Kórházban és a Missouri-Columbia Egyetemen., amint azt korábban leírtuk (33). Az állatokat izofluránnal altattuk a vizsgálat időtartama alatt. Az MRI-t a rekeszizomtól a farok alapjáig végeztük. Az adatok elemzését Mnova7software (Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Spanyolország) segítségével végeztük.

Viselkedési vizsgálatok

A viselkedési aktivitást két anya és két nő utódán, 26 hetes korban, automatikusan figyeltük a Med Associates Open Field Test Environment (ENV-515) monitorjaival (Georgia, VT) az Egyetem Translational Neuroscience Behavior Testing Core-jában. Missouri-Columbia, a korábban leírtak szerint (33). A megtett távolság mérésére a szenzortörés adatait használtuk. A labirintus közepén eltöltött időt a kerülethez viszonyítva becsülték a viselkedési szorongás. Az egereket 3-4 órán át a vizsgálati területre szoktattuk, majd egyenként a kamrába helyeztük 60 percig. A vizsgálatokat minden másnap lefuttattuk, egérenként összesen három kísérletet végeztünk.

Szérumvizsgálatok

A szérum leptin és inzulin koncentrációit utódokban mértük egér leptin, illetve patkány/egér inzulin ELISA módszerrel (Millipore, Billerica, MA) a gyártó útmutatásait követve. A valódi szérum triglicerid-koncentrációt minden utódban a szérum triglicerid-meghatározó készlet (Sigma) segítségével mértük a gyártó útmutatásai szerint. Az intraperitoneális glükóztolerancia teszteket (IPGTT) 13 hím (öt kontroll, négy korlátozott, négy leptin) és 25 nőstény utódon (10 kontroll, nyolc korlátozott, hét leptin) végeztük a National Institute of Health állati modelljeinek diabéteszes szövődményekkel konzorcium protokoll szerint (http://www.diacomp.org/shared/showFile.aspx?doctypeid=3&docid=11). Röviden, az állatokat 6 órán át éheztettük, majd vénás farokmintával éhomi glükózszintet kaptunk. Ezután ip. Injekciót adtak be glükózból (1 mg/g), és a vércukorszintet az injekció beadása után 30, 60 és 120 perc múlva vénás farokmintával értékelték OneTouch Ultra glükózmérővel (LifeScan Inc., Milpitas, CA). ).

Vesemorfológia

A veséket metszettük és hematoxilinnal és eozinnal festettük, majd a glomerulusok számát a legnagyobb vese keresztmetszetben számoltuk az ImageJ szoftver számlálási funkciójával (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Csontanalízis

Hasnyálmirigy morfológia

Az immunhisztokémiát 42 hím és 40 nő utód hasnyálmirigy-szövetén végeztük. Röviden, öt 5 μm paraffin metszetet vizsgáltunk hasnyálmirigyenként 50 μm vagy annál nagyobb időközönként. Miután normál kecske szérum PBS-ben 1:10 arányú oldatában 30 percig blokkoltuk, mindegyik mintát egy éjszakán át kétszer festettük α-sejt markerrel, egér antiglukagon (K79bB10; Abcam Inc., Cambridge, MA) és β-sejtekkel. marker, nyúl-anti inzulin (ab63820; Abcam) 1: 2000, illetve 1: 1000 értéknél. Másodlagos antitesteket: Alexa Flour 568 kecske-antimouse és 488 kecske-antabbabbit (Invitrogen, Carlsbad, CA) használtunk 1: 500 arányban. Összesen 991 szigetet vizsgáltak, 515 nőstényt (145 kontroll, 202 korlátozott, 168 korlátozott leptint kezeltek) és 476 férfit (178 kontroll 157 korlátozott 141 korlátozott leptint kezeltek), és átlagosan 12,1 ± 0,4 szigetet vizsgáltak kölyökként. A szigeti értékeket állatonként átlagoltuk. Az α- és β-sejtek számát az ImageJ (National Institute of Health) kézi számlálási szolgáltatásával határoztuk meg. A β-sejteket manuálisan köröztük, és a területet megmértük, a Image J régió érdeklődésére számítva, a korábban leírtak szerint (35). A szigetekenkénti átlagos β-sejtterületet használtuk a β-sejtek tömegének indexeként.

RNS izolálás és valós idejű RT-PCR elemzés

A teljes sejtes RNS-t májból, sc-zsírból, zsigeri zsírból és hipotalamuszból izoláltuk. A mintákat trireagensben (Sigma) homogenizáltuk, és a fáziskiválasztás után fázislug-gélből készült nehéz csövek (5 Prime Inc., Gaithersburg, MD) segítségével a vizes réteget RNEasy minikolonnára (QIAGEN, Valencia, CA) helyeztük, és az összes a sejtes RNS-t a gyártó utasításai szerint tisztítottuk.

Máj-, zsigeri- és sc-zsír, valamint kvantitatív RT-PCR esetében 1 μg RNS-t fordítottunk átírással az RT 2 első szál kit (QIAGEN) segítségével, a gyártó utasításainak betartásával. A valós idejű PCR-t ezután egy egyedi RT 2 Profiler PCR lemez tömb felhasználásával hajtottuk végre, amely több PCR-t és RT 2 SYBR Green ROX qPCR master mixet (QIAGEN) tartalmaz egy Applied Biosystems 7500 valós idejű PCR rendszeren (Applied Biosystems, Foster City, CA ) a PCR tömb gyártójának irányelvei szerint. Három háztartási gént, 18s rRNS-t (18s riboszomális RNS), Actb-t (aktin-β) és Hprt-t (hipoxantin-foszforibozil-transzferáz 1) vizsgáltunk; a 18s és a Hprt expresszióváltozása miatt azonban csak az Actb-t használták a hajtásváltozások kiszámításához. Külső reverz transzkripciót és pozitív PCR kontrollokat is tartalmazott.

A hipotalamusz kvantitatív RT-PCR esetében 500 ng RNS-t fordítottunk át a SuperScript első szálú szintézis rendszer (Invitrogen) segítségével a gyártó utasításainak betartásával. A SYBR Green valós idejű PCR-vizsgálatot Agrp (agouti rokon fehérje), Cart (kokain és amfetamin által szabályozott transzkriptum), Npy (Y neuropeptid Y), Pomc (proopiomelanocortin), Lepra és Leprb (leptin receptor-a és -b) esetében végeztük. A belső ellenőrzéshez az Actb-t használták. Az alapozók szekvenciája (Integrated DNA Technology, Coralville, IA) megtalálható az 1. számú kiegészítő táblázatban, amelyet az Endocrine Society Journals Online weboldalán tettek közzé a http://endo.endojournals.org címen. A Lepra és Leprb primer szekvenciákat a Primer Express szoftver (Applied Biosystems) alkalmazásával fejlesztették ki, az Actb (36), az Agrp, a Cart, az Npy és a Pomc primer szekvenciákat korábban publikálták (37).

Anyánként egy hím és egy női májmintát elemeztek PCR-rel. Anyánként két hím és két női sc zsír, zsigeri zsír és hipotalamusz mintát vizsgáltak.

NAFLD elemzés

A szövettani elemzést befejeztük az utódmájokon (54 hím, 44 nő) a NAFLD esetében. A fagyasztott májmintákat 8 μm-nél metszettük, és három metszetet 50 μm-es intervallummal helyeztünk a tárgylemezre. A mintákat a közzétett irányelvek szerint (38) olajvörös O-val (Sigma) festettük, Mayer hematoxylinnel (Sigma) ellenfestettük és glicerin-zselével szereltük fel. A májszakaszokat a közzétett irányelvek alapján értékelték a NAFLD szempontjából (39, 40). Röviden, a kezeléstől elvakult kezelő által értékelt közös jellemzők a hepatocelluláris léggömbözés, a steatosis és a portális gyulladás voltak. Mallory hyalinját is megjegyezték. Az egyes májszakaszok minden rendellenességét 0–3 skála alapján osztályoztuk, amelynek értéke 0, amely a rendellenességgel borított minta kevesebb, mint 33% -ának felel meg. Az 1 érték 33-50% -nak, 2-50-66% -nak, 3 pedig a rendellenesség jelenlétének felel meg a minta 66-100% -ában. Az egyes szakaszok összesített pontszáma a rendellenességek összege volt, 0–9 tartomány (példák, 1. kiegészítő ábra). Állatonként három szakasz pontszámát átlagoltuk.